KR100746310B1 - 풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사ｋｐｂ３종 - Google Patents

풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사ｋｐｂ３종 Download PDF

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허장현
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Abstract

본 발명은 풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 국내 토마토 재배 토양으로부터 신규 국내 토착 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)종을 분리하고 이 균주를 이용하여 토마토 및 고추 외 다양한 가지과 작물에 큰 피해를 입히는 풋마름병원균(세균성 시들음병원균, Ralstonia solanacearum)을 효율적으로 방제하고 작물생장촉진 효과를 나타냄으로써 세계 최초로 대표적 난방제 토양병인 풋마름병(세균성 시들음병, bacterial wilt disease)에 대한 우수한 방제 효과를 갖는 신규 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 및 이를 이용한 미생물제제로서의 용도에 관한 것이다.
풋마름병(세균성 시들음병) 방제, 페니바실러스 폴리믹사 KPB3 (Paenibacillus polymyxa KPB3)종, 풋마름병원균(세균성 시들음병원균)

Description

풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사 ＫＰＢ３종{Effects of a soil-born Paenibacillus polymyxa strain KPB3, on suppression of bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum}
도 1은 본 발명에 따른 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종의 생리ㆍ생화학적 특성을 분석하여 계통분류학적 위치를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종의 16S rRNA 유전자를 분석하여 계통분류학적 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 저지원 시험방법에 의한 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3 [KCCM10793P]종의 풋마름병원균 랄스토니아 솔라나세아륨에 대한 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종 배양액을 토마토 뿌리 땅가 부분에 관주 처리하여 7일 후 풋마름병이 억제되는 것을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종 배양액을 1000배 희석하여 토마토 시설 재배에 관주 처리한 결과, 효율적으로 풋마름병을 억제함을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종 배양액을 처리하여 20일 후 신장을 나타낸 것으로, 본 균주에 의한 작물생장 촉진효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 국내 토마토 재배 토양으로부터 신규 국내 토착 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)종을 분리하고 이 균주를 이용하여 토마토 및 고추 외 다양한 가지과 작물에 큰 피해를 입히는 풋마름병원균(세균성 시들음병원균, Ralstonia solanacearum)을 효율적으로 방제하고 작물생장촉진 효과를 나타냄으로써 세계 최초로 대표적 난방제 토양병인 풋마름병(세균성 시들음병, bacterial wilt disease)에 대한 우수한 방제 효과를 갖는 신규 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 및 이를 이용한 미생물제제로서의 용도에 관한 것이다.
풋마름병(세균성 시들음병)은 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum) 병원균에 의해 발생되는 병으로서, 토마토, 고추, 가지, 담배 등 주요 가지과 작물에 대발생하여 극심한 피해를 초래한다. 또한, 과채류, 엽채류, 쌈채류 등의 거의 모든 원예작물에 잠재적 위해 요소로 작용할 수 있어 그 피해의 위험성이 매우 크다. 특히, 동일한 작물의 연작 재배 및 연중 재배가 성행하고 있는 최근 농업의 추세에 따라 발생빈도는 점차 증가하고 있으며, 토경 재배뿐만 아니라 수경 재배지에서도 피해상황이 속속 알려지고 있는 실정이다. 이러한 풋마름병(세균성 시들음병)에 대한 재배 농민들의 가장 큰 불안요소는 다른 식물병과 달리, 일단 발생하면 세균의 특성상 급속도로 진전하여 재배지 전체로 번지며, 작물 포기전체가 고사하여 거의 모든 수확물을 수확할 수가 없다는 것이다.
이러한 풋마름병(세균성 시들음병)을 방제하기 위해서 윤작, 간ㆍ혼작 등의 재배적 기술방법과 재배포장 위생 청결 등의 경종적 방법, 그리고 저항성 품종 육성 등의 방법이 적용되고 있으나 효과가 없다.
따라서, 미생물 자체를 이용하여 풋마름병(세균성 시들음병)을 방제하는 것이 가장 효과적인 방제대책이라 할 수 있다.
현재 슈도모나스(Pseudomonas) 균주에 의한 작물 생장촉진 방법 및 풋마름병 방제에 대한 연구가 일부 진행되고 있으나, 그 효과는 매우 낮아 실용성이 없다. 한편, 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 피씨움 울티멈(Pythium ultimum) 등의 일부 곰팡이(fungi) 병을 방제하는 페니바실러스 폴리믹사 H210 (Paenibacillus polymyxa H210)이 알려져 있으나, 본 발명처럼 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)가 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아륨 (Ralsotonia solanacearum)을 방제할 수 있다는 보고는 세계적으로 알려져 있지 않다. 특히, 페니바실러스 폴리믹사 H210 균주의 경우에는 일부 곰팡이병원균의 생장을 억제할 뿐, 풋마름병과 같은 세균병의 방제에는 효과가 없다.
따라서, 풋마름병 방제용 미생물 제제 개발이 절실히 필요한 실정이다.
이에, 상기와 같이 풋마름병 방제 효과가 우수한 신규 미생물을 선발하고자 연구 노력한 결과, 강원도 춘천시 토마토 재배지에서 풋마름병을 방제하는 새로운 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)KCCM10793P]종을 분리하였고, 이 균주가 풋마름병에 대한 활성을 가장 잘 나타낼 수 있는 농도까지 배양할 수 있는 배양조건을 최적화시켰다.
또한, 국내 토착 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 배양액을 작물에 관주 처리하였을 때 풋마름병을 매우 효과적으로 방제할 수 있고 작물 생장을 촉진하는 효과가 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 토마토, 고추, 가지, 오이, 호박, 참깨, 감자 및 담배 등의 풋마름병을 효율적으로 방제하는 국내 토착의 신규한 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종, 이 균주를 작물에 적용하였을 때 풋마름병에 대한 효과적인 방제제 및 작물생장 촉진의 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주로부터 고농도 배양액을 얻기 위한 배양 배지를 또 다른 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 풋마름병 방제제를 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 국내 토마토 재배 토양으로부터 신규 국내 토착 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)종을 분리하고 이 균주를 이용하여 토마토 및 고추 외 다양한 가지과 작물에 큰 피해를 입히는 풋마름병원균(세균성 시들음병원균, Ralstonia solanacearum)을 효율적으로 방제하고 작물생장촉진 효과를 나타냄으로써 세계 최초로 대표적 난방제 토양병인 풋마름병(세균성 시들음병, bacterial wilt disease)에 대한 우수한 방제 효과를 갖는 신규 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 및 이를 이용한 미생물제제로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 국내 토착의 신규한 페니바실러스 폴리믹사 KPB3 (Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종은 강원도 춘천시 토마토 재배지에서 풋마름병을 매우 효과적으로 방제하는 미생물로서 분리ㆍ동정한 결과, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)로 나타났다. 즉, 상기 분리 KPB3종을 페니바실러스 폴리믹사로 분류하는데 있어서 주요 특성이 되는 혐기적 성장, 10 ℃ 성장, 전분 분해, 그리고 세균 분류를 위하여 API 20E 및 API 50CH 키트를 이용하 여 실험한 결과, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)로 동정되었다.
따라서, 상기 신규 균주를 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)으로 명명하였고, 한국미생물보존센터에 2006년 11월 3일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCCM10793P로 부여받았다.
본 발명의 신규 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종을 작물에 관주 또는 엽면 처리하였을 때, 풋마름병을 매우 효과적으로 방제함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명은 상기 배양과정에서 얻어진 균체의 유효성분을 함유하는 풋마름병 방제제 등의 미생물농약을 포함하는 생물농약, 친환경농자재 그리고 비료를 포함한다.
또한, 신규 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3[KCCM10793P]종이 풋마름병을 가장 효과적으로 방제할 수 있는 배양 배지를 비롯한 전체 배양과정을 완성하였다.
즉, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종의 최적 효과를 나타내기 위해 필요한 배양과정은 다음에 나타낸 바와 같고, 효율적으로 포자형성을 유도할 수 있다.
먼저, 신균주 접종 전 pH를 5N NaOH로 7.0으로 조정하고 배양온도는 25 ~ 30 ℃, 더욱 바람직하게는 28 ℃로 조정한다. 이때, pH 6.2 이하에서는 균 성장이 저해되므로 조절시 유의해야 된다. 그리고, 씨드(seed)를 옮기고 초기 배양조건은 교반속도 30 ~ 100 rpm, 더욱 바람직하게는 50 rpm, 통기량은 0.2 ~ 0.8 vvm, 더욱 바람직하게는 0.3 vvm으로 조정한다. 균 성장이 빨라지는 시기에 교반속 도 80 ~ 150 rpm, 더욱 바람직하게는 110 ~ 120 rpm, 통기량 0.6 ~ 0.9 vvm, 더욱 바람직하게는 0.8 vvm으로 조정한다. 배양 18 ~ 24시간 경에 pH가 떨어져서 6.2가 되면 멸균된 5N NaOH로 6.7 ~ 7.0으로 조정한다.
배양 24 ~ 28 시간 경에 pH가 6.2 ± 0.1에서 변화가 없이 3 ~ 4시간 이상 지속이 될 경우 DPA(dipicolinic acid) 30 ~ 100 ppm, 더욱 바람직하게는 50 ppm을 첨가하여 포자형성을 유도한다. pH가 상승하기 시작하면 현미경으로 관찰하여 포자 형성을 확인한다. pH가 상승시기가 포자 형성 시기이다.
포자 형성이 완료되고 세포벽이 깨지면 발효가 완료된다. 발효가 완료되면 15 ~ 20 ℃로 냉각하여 생육활동을 멈추게 하며, 포자가 용출되지 않도록 한다.
또한, 본 발명에 따른 신균주를 배양하기 위한 최적의 배지 조성은 옥수수 전분(Corn starch) 40 ~ 80 g/L, 효모 추출액(Yeast extract) 3 ~ 17 g/L, (NH4)2SO4 3 ~ 17 g/L, KH2PO4 0.3 ~ 1.7 g/L, CaCO3 1 ~ 8 g/L 및 MgSO4ㆍ7H2O 0.5 ~ 10 g/L을 포함한다. 옥수수 전분(Corn starch)은 탄소원의 역할을 하며, 이의 농도가 40 g/L 미만일 경우에는 세포생장에 문제가 있고, 80 g/L 초과 시에는 포자가 잘 형성되지 않는 문제가 있으며, 효모 추출액(Yeast extract)은 질소원으로서 사용하며, 이의 농도가 3 g/L 미만일 경우에는 세포생장이 이루어지지 않는 문제가 있고, 17 g/L 초과 시에는 포자가 형성되지 않는 문제가 있으며, (NH4)2SO4는 질소원의 역할을 하며, 이의 농도가 3 g/L 미만일 경우에는 세포생장에 문제가 있고, 17 g/L 초과 시에는 포자형성에 문제가 있다. 즉, 옥수수 전분(Corn starch), 효모 추출액(Yeast extract) 및 (NH4)2SO4는 세균세포의 기본적인 영양성분으로 작용하여 이들의 생장 및 포자 형성에 있어서 영양성분의 결핍과 과잉에 의한 부작용을 나타나게 한다. 또한, KH2PO4는 버퍼의 역할을 하며, 이의 농도가 0.3 g/L 미만일 경우에는 낮은 pH 때문에 생장에 문제가 있고, 1.7 g/L 초과 시에는 높은 pH 때문에 생장에 문제가 있으며, CaCO3 버퍼 및 물질을 유도하기 위하여 사용하며, 1 g/L 미만일 경우에는 낮은 pH 때문에 생장에 문제가 있고, 8 g/L 초과 시에는 원활한 생장을 위한 대사물질이 생산되지 않는 문제가 있으며, MgSO4ㆍ7H2O 버퍼 및 대사물질 생산 역할을 하며, 이의 농도가 0.5 g/L 미만일 경우에는 대사물질이 적게 생산되는 문제가 있고, 10 g/L 초과 시에도 역시 대사물질이 적게 생산되는 문제가 있다.
한편, 상기 신균주를 이용한 생물농약, 친환경농자재 그리고 비료는 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 및 이의 배양액을 다양한 담체를 함께 사용하여 제조할 수 있다. 담체로는 통상적으로 사용되는 생물농약, 친환경농자재, 그리고 비료제형으로 허용 가능한 담체면 모두 사용할 수 있으나, 특히 질석, 미강, 제올라이트 등을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 유효성분은 전체 미생물제제 조성물에 대하여 0.001 ~ 90%를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 본 발명에 따른 균주 배양액을 1000배 희석하여 수화제로 제제화시킨다. 이렇게 제조된 생물농약, 친환경농자재, 그리고 비료를 풋마름병을 억제하기 위하여, 작물을 정식하기 전 묘상에서 침지처리 한 후 생육초기부터 15일 간격으로 3회 관주 또는 엽면 처리하는 것이 바람직하다.
이러한 미생물제제는 풋마름병 방제제, 관주처리제, 미생물영양제, 토양개량제 등의 다양한 형태로 만들어서 전반적인 생물농약, 미생물농약제, 친환경농자재 그리고 비료로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 국내 토착 페니바실러스 폴리믹사 KPB3( Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종의 분리 및 동정
1) 생리ㆍ생화학 동정
강원도 춘천시 토마토 재배지에서 미생물들을 다수 분리한 후, 세균성 시들음병원균 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum)에 대하여 항세균성 저지원을 나타내는 본 종을 선발하여 Bergey's manual[Lelliott, R. A. and Dickey, R. S. 1984. Genus Serratia. In: Bergey's Manual of Systemic Bacteriology. vol. 1, pp. 477-484, Williams and Willkins Co., Baltimore/London] 및 API 20E 및 API 50CH 키트를 이용하여 페니바실러스 속 폴리믹사 종의 생리ㆍ생화학 실험들을 수행하였으며, 그 결과는 다음 표 1과 같다.
즉, 상기 분리 KPB3종은 페니바실러스 속 폴리믹사 종을 분류하는데 있어서 주요 특성이 되는 혐기적 성장, 10 ℃ 성장, 전분 분해, 그리고 API 20E 및 API 50CH 키트를 이용하여 실험한 결과, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)로 동정되었다.
Figure 112006090796315-pat00001
Figure 112006090796315-pat00002
또한 상기 생리ㆍ생화학 실험 결과를 수리분류학적으로 분석하기 위하여, NTSYS 프로그램[Rolf, F. J. 1992. NTSYS. Numerical taxonomy and multivariate analysis system. version 1.70. Exeter, Setauket, New York]을 이용하여 계통도를 작성하였다[도 1].
그 결과, 상기 KPB3종은 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)로 판명되었다.
2) 16S rRNA 유전자 분석에 의한 특성
상기 KPB3종의 계통분류학적 위치를 알아보기 위해, 생명현상에 있어 필수적이고 그 염기서열이 비교적 잘 보존되어 있으며, 통계학적으로 분석하기에 용이한 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 먼저, 서열번호 1로 나타낸 fD1 프라이머와 서열번호 2로 나타낸 rP2 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하여 얻었다. 그 후 pGEM-T 벡터 시스템을 이용하여 클로닝하여 그 염기서열을 분석하였다[서열번호 3].
상기 분석된 염기서열은 메가 프로그램[Kumar, S., Tamura, K. and Nei, M. 1993. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis, version 1.0. The Pennsylvania State University, University Park.]에 의해 그 계통도를 작성한 결과 도 2와 같으며, 다음 표 2와 같이 그 유사도로 볼 때 본 발명의 KPB3 균주는 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)종으로 동정되었다.
Figure 112006090796315-pat00003
실시예 2 : 페니바실러스 폴리믹사 KPB3( Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종의 풋마름병 억제 및 작물생장 촉진 특성 분석
1) 저지원 테스트 방법에 의한 풋마름병원균의 억제 검정
먼저 상기 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종의 항세균성 물질 생산에 의한 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum)의 억제 효과를 검정하기 위하여 저지원 테스트를 실시하였다. 즉 TSA 고체배지(Tryptic soy agar, Difco)를 이용하여 28 ℃ 항온 배양한 후, 충분히 성장한 KPB3 종 균체를 멸균수 1 ml에 현탁하였다. 그 후 TSA 고체배지를 멸균하여 약 50 ℃ 내외로 식히어 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum)을 104 cells/ml 농도로 혼합하여 페트리디쉬에 분주하여 풍건하였으며, 이 배지 중앙에 현탁한 KPB3종을 접종하여 28 ℃, 2일간 배양한 후 저지원의 유무로 풋마름병원균에 대한 억제 효과를 검정하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 KPB3종을 접종한 부위 근처에서만 풋마름병원균에 대한 저지원(clear zone)이 형성된 반면, 멸균수를 접종한 부위에서는 저지원이 확인되지 않았다.
2) in vitro 에서 풋마름병의 억제 검정
풋마름병에 대한 실내 검정을 실시하기 위하여, 풋마름병에 가장 큰 피해를 보고 있는 토마토(품종: 로쿠산마루)를 이용하였다.
먼저 육묘상 포트에서 약 1개월간 성장한 토마토 육묘에 LB(Luria Burtani) 액체배지에서 충분히 성장한 (4 × 108 C.F.U./ml) KPB3 균주를 각 포트당 100 ml씩 관주 처리하였다. 관주 처리 1주일 후, 토마토 육묘를 뽑아 뿌리 끝 부분을 잘라 상처를 내어 병원균이 침입하기에 용이하게 만든 다음, 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum) 현탁액(1 × 108 C.F.U./ml)에 10분간 침지하여 새로운 포트에 이식하였다. 그 후 식물생장 상에서 28 ~ 30 ℃ 고온을 유지하면서 발병유무를 관찰하였다. 한편, 대조구로는 멸균수를 접종하여 비교하였으며, 시험은 난괴법 3반복에 준하여 3회 반복 실시하였다. 발병 상황은 발병도(0 : 무병징, 1 : 25% 이하 시들음, 2 : 26-50% 시들음, 3 : 51-75% 시들음, 4 : 76-100% 시들음, 5 : 작물고사)로 나타내었으며, 결과 분석은 SAS 프로그램(SAS institute, Cary, NC)을 이용하였다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 멸균수를 처리한 대조구에 비하여 풋마름병 발생이 현저히 감소하였다[도 4].
Figure 112006090796315-pat00004
또한, 현재 슈도모나스(Pseudomonas) 균주에 의한 작물 생장촉진 방법 및 풋마름병 방제에 대한 연구가 일부 진행되고 있으나, 그 효과는 매우 낮아 실용성이 없다.
슈도모나스(Pseudomonas)속은 형광을 나타냄과 동시에 세포벽 두께가 얇고 외부 세포막이 존재함에 따라 분류되는 그램 음성균인 반면, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3은 형광을 나타내지도 않으며 세포벽이 두껍고 외부 세포막이 존재하지 않으며 내생포자를 형성하는 그램 양성균으로, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)종과 슈도모나스(Pseudomonas)속 간에는 분류학적으로 엄연한 차이가 있다. 특히, 토마토를 이용하여 이 두 균주 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)과 슈도모나스 (Pseudomonas) 속의 풋마름병에 대한 방제효과를 면밀히 검정하였다.
육묘상 포트에서 약 1개월간 성장한 토마토 육묘에 각각 LB(Luria Burtani) 액체배지와 MGY(Mannitol Glutamic acid Yeast extract)액체배지에서 충분히 성장한(4 × 108 C.F.U./ml 이상) KPB3종과 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주를 각 포트당 100 ml씩 관주 처리하였다. 관주 처리 1주일 후, 토마토 육묘를 뽑아 뿌리 끝 부분을 잘라 상처를 내어 병원균이 침입하기에 용이하게 만든 다음, 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum) 현탁액(1 × 108 C.F.U./ml)에 10분간 침지하여 새로운 포트에 이식하였다. 그 후 식물생장 상에서 28 ~ 30 ℃ 고온을 유지하면서 발병 유무를 관찰하였다. 한편, 대조구로는 멸균수를 접종하여 비교하였으며, 시험은 난괴법 3반복에 준하여 3회 반복 실시하였다. 발병 상황은 발병도 (0 : 무병징, 1 : 25% 이하 시들음, 2 : 26-50% 시들음, 3 : 51-75% 시들음, 4 : 76-100% 시들음, 5 : 작물고사)로 나타내었으며, 결과 분석은 SAS 프로그램(SAS institute, Cary, NC)을 이용하였다.
그 결과, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)종이 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 비하여 풋마름병에 대한 방제 효과가 월등히 우수함을 알 수 있었다[표 4].
Figure 112006090796315-pat00005
한편, 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 피씨움 울티멈(Pythium ultimum) 등의 일부 곰팡이(fungi) 병을 방제하는 페니바실러스 폴리믹사 H210 (Paenibacillus polymyxa H210)과, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3 (Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종의 풋마름병 방제 효과를 비교 실험하였다. 먼저, 육묘상 포트에서 약 1개월간 성장한 토마토 육묘에 LB(Luria Burtani) 액체 배지에서 충분히 성장한 (4 × 108 C.F.U./ml) KPB3종과 H210종을 각 포트당 100 ml씩 관주 처리하였다. 관주 처리 1주일 후, 토마토 육묘를 뽑아 뿌리 끝 부분을 잘라 상처를 내어 병원균이 침입하기에 용이하게 만든 다음, 풋마름병원균인 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum) 현탁액(1 × 108 C.F.U./ml)에 10분간 침지하여 새로운 포트에 이식하였다. 그 후 식물생장 상에서 28 ~ 30 ℃ 고온을 유지하면서 발병유무를 관찰하였다. 한편, 대조구로는 멸균수를 접종하여 비교하였으며, 시험은 난괴법 3반복에 준하여 3회 반복 실시하였다. 발병 상황은 발병도 (0 : 무병징, 1 : 25% 이하 시들음, 2 : 26-50% 시들음, 3 : 51-75% 시들음, 4 : 76-100% 시들음, 5 : 작물고사)로 나타내었으며, 결과 분석은 SAS 프로그램(SAS institute, Cary, NC)을 이용하였다.
그 결과, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)종은 풋마름병에 대한 방제 효과가 매우 우수한 반면, 대조군인 페니바실러스 폴리믹사 H210(Paenibacillus polymyxa H210)은 방제효과가 전혀 없었다[표 5].
Figure 112006090796315-pat00006
따라서, 가지과 작물 등 주요 원예작물에 대발생하여 극심한 피해를 초래하는 풋마름병을 매우 효과적으로 방제하는 친환경 미생물은 본 발명과 같이 국내 토착 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종만이 유일하며, 페니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)를 이용하여 토마토, 고추 등 주요 가지과 작물의 풋마름병을 방제할 수 있음을 세계에서 최초로 증명하였다.
3) 작물별 풋마름병 방제 효과 검정
상기 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종의 토마토 외 주요 피해 작물에서의 방제 효과를 검정하기 위하여 고추, 가지, 오이, 호박, 참깨, 감자 및 담배를 선택하여 실내 실험을 실시하였다.
먼저, 각 작물이 본엽 3엽이 형성되었을 때 상기 2란에서 설명한 바와 같이 KPB3 종 배양액을 처리한 후, 동일한 방법으로 풋마름병원균을 접종하여 병 발생을 유도하였다.
그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이 실험에 사용한 모든 작물에 있어서 KPB3종은 토마토 풋마름병과 동일한 수준으로 고추, 가지, 오이, 호박, 참깨, 감자, 담배 등의 다양한 경제작물에 발생하는 풋마름병을 효과적으로 방제함을 알 수 있었다.
Figure 112006090796315-pat00007
4) in vivo 풋마름병의 억제 검정
상기 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종의 토마토 재배포장에서의 실제 방제효과를 검정하기 위해 강원도 춘천시 토마토 재배포장에서 실험을 실시하였다. 실험은 각각 재배시기로 보아 수확기가 봄과 가을에 맞추어지는 2곳에서 실시하였으며, 재배하우스는 700~800주의 토마토를 재배하였으며, KPB3종 배양액 처리와 대조구로 물만을 처리하여 비교하였다. KPB3종 배양액을 1000배로 희석하여 최종 농도가 1 × 104 C.F.U./ml가 되도록 하였으며, 처리는 봄과 가을 모두 정식 전 육묘부터 침지 처리하고, 재배 초기부터 15일 간격으로 3회 관주 처리하였다. 그 후 발병 시기에 따라서 이병상황을 풋마름병이 발생한 주수와 건전한 주수로 나누어 표기하였다.
그 결과, 표 7에서 나타난 바와 같이 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종은 봄과 가을 모두 60% 수준의 방제효과를 나타내어 실제 농가포장에서도 풋마름병을 효율적으로 방제할 수 있음이 확인되었다[도 5].
Figure 112006090796315-pat00008
5) 페니바실러스 폴리믹사 KPB3 [ KCCM10793P ]종의 작물 생장 촉진 효과 검정
상기 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종의 작물 생장 촉진 효과를 검정하기 위해, 파종 10일 후 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종 균주 배양액을 1000배(1 × 104 C.F.U./ml) 희석하여 지제부 근처에 5 ml을 관주 처리하였으며, 대조구로는 물만을 처리하였다. 본 발명의 KPB3종 처리에 의한 작물 생육촉진효과는 처리 25일 후 엽록소, 신장, 경경(줄기 두께) 및 지상부 생체중으로 나타내었으며, 본 시험은 5회 반복 실시하였다.
그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종 배양액 처리구에서 모두 대조구에 비하여 월등한 생육 촉진 효과가 확인되었다[도 6].
Figure 112006090796315-pat00009
실시예 3 : 효율적 풋마름병 방제를 위한 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종의 배양 공정기술 개발
본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종의 효율적인 풋마름병 방제를 위해서는 무엇보다도 높은 농도의 KPB3종이 생존해 있는 것이 중요하다. 따라서, KPB3종이 고농도로 성장할 수 있는 배지와 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종이 포자를 형성하는 세균이란 점을 감안하였을 때, 포자형성을 시키는 발효과정이 더욱더 필요한 것이다. 따라서, 표 9와 같이 저렴하면서도 고농도의 KPB3종을 배양할 수 있는 M5 배지를 개발하였다. 특히, 본 M5 배지에서 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종은 3 × 109 C.F.U/ml까지 배양되었다.
Figure 112006090796315-pat00010
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 국내 토착의 신규한 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종을 분리, 동정하였고, 본 종 배양액을 대표적 난방제 토양병인 풋마름병에 대한 방제제로서 실험한 결과, 다른 종에 비해 매우 월등한 효과를 나타내어 세계적으로 풋마름병을 가장 우수하게 방제할 수 있는 종임이 증명되었다. 또한, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종은 토마토뿐만 아니라 고추, 가지, 오이, 호박, 참깨, 감자, 및 담배 등 주요 원예작물에 발생하는 풋마름병을 효과적으로 방제하였다. 그리고 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종은 작물의 생장을 촉진시켜 원활한 생육을 이루어지게 하는 특성도 지니고 있었다. 특히, 본 발명의 페니바실러스 폴리믹사 KPB3종을 고농도로 배양할 수 있는 배지조성 및 배양공정을 확립함으로써 풋마름병을 방제하는 방제제로서의 산업화가 가능하게 되었다.
따라서, 풋마름병 방제를 위하여, 본 국내 토착 페니바실러스 폴리믹사 KPB3[KCCM10793P]종 및 이의 배양액은 미생물 농약 등의 생물농약, 친환경농자재 그리고 비료로 산업화가 가능하게 되었다.
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Claims (7)

  1. 풋마름병 방제 효과를 갖는 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종.
  2. 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 풋마름병 방제제.
  3. 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 작물생장 촉진용 비료.
  4. 페니바실러스 폴리믹사 KPB3(Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 친환경농자재.
  5. 삭제
  6. 배지의 pH를 7.0으로 조정하고 배양온도를 25 ~ 30 ℃로 조정한 후에, 균주를 접종하는 단계;
    상기 접종 후 씨드(seed)를 옮기고 초기 배양조건은 교반속도 30 ~ 100 rpm, 통기량 0.2 ~ 0.8 vvm으로 조정하여 배양하는 단계;
    균주 성장이 빨라지는 시기에 교반속도 80 ~ 150 rpm, 통기량 0.6 ~ 0.9 vvm으로 조정하여 배양하는 단계;
    상기 배양 후 18 ~ 24시간 경에 pH가 떨어져서 6.2가 되면 pH를 6.7 ~ 7.0로 조정하고, 배양 24 ~ 28 시간 경에 pH가 6.2 ± 0.1에서 변화가 없이 3 ~ 4시간 이상 지속이 되는 시기에 DPA(dipicolinic acid) 30 ~ 100 ppm를 첨가하여 포자형성을 유도하는 단계; 및
    포자 형성이 완료되고 세포벽이 깨지면 발효가 완료되는 시기로, 이때 15 ~ 20 ℃로 냉각하여 생육활동을 멈추게 하며, 포자가 용출되지 않도록 하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 페니바실러스 폴리믹사 KPB3 (Paenibacillus polymyxa KPB3)[KCCM10793P]종 배양방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 옥수수 전분(Corn starch) 40 ~ 80 g/L, 효모 추출액(Yeast extract) 3 ~ 17 g/L, (NH4)2SO4 3 ~ 17 g/L, KH2PO4 0.3 ~ 1.7 g/L, CaCO3 1 ~ 8 g/L 및 MgSO4ㆍ7H2O 0.5 ~ 10 g/L을 포함하여 이루어진 배지를 이용하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
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