KR101489865B1 - 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 벌크홀데리아 세파시아 jbk9 균주, 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균 방제용 조성물 - Google Patents

식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 벌크홀데리아 세파시아 jbk9 균주, 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균 방제용 조성물 Download PDF

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KR101489865B1 KR20130102936A KR20130102936A KR101489865B1 KR 101489865 B1 KR101489865 B1 KR 101489865B1 KR 20130102936 A KR20130102936 A KR 20130102936A KR 20130102936 A KR20130102936 A KR 20130102936A KR 101489865 B1 KR101489865 B1 KR 101489865B1
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gray mold
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KR20130102936A
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신재호
정병권
홍성준
박건석
최정배
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경북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 벌크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) JBK9 균주(KCTC 12466BP), 이의 배양액, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균(phytopathogenic fungi) 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 그람 음성간균인 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주는 잿빛곰팡이의 생육을 저해하고, 고온의 열처리에도 손상되지 않는 항진균 활성물질을 함유하고 있으므로, 잿빛곰팡이를 비롯한 식물병원성 진균의 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주, 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균 방제용 조성물{Novel strain Burkholderia cepacia JBK9 having antifungial activity against phytopathogenic fungi, its culture, and composition containg them for controlling phytopathogenic fungi}
본 발명은 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 벌크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) JBK9 균주(KCTC 12466BP), 이의 배양물, 및 상기 균주 또는 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균(phytopathogenic fungi) 방제용 조성물에 관한 것이다.
식물병원성 진균은 식물에 병원성이 있는 진균(곰팡이)으로, 식물의 생장 및 과실 수확에 영향을 미치는 병원균이다. 식물병원성 진균은 그 종류가 매우 다양하며, 각종 살충제에 내성을 갖게되어 새로운 특성을 갖는 균주로 확인이 되거나, 연구자들에 의해 새롭게 균주가 개발됨으로써, 계속적으로 그 종이 증가하고 있다.
식물병원성 진균의 하나인 잿빛곰팡이(Bortyritis cinerea)는 상추, 시금치, 파, 양파, 고추 등의 채소류를 오염시켜 잿빛곰팡이병을 일으키는 다범성 병원균이다. 잿빛곰팡이는 무름병, 흰가루병과 함께 채소 재배 및 수확시 문제를 일으키는 병해로 알려져 있다. 또한, 재배기간 중 살균제를 주기적으로 살포하였을 경우에도, 잿빛곰팡이에 의해 작물의 수확량이 5-10% 가량 감소한다는 연구결과가 보고되어 있다. 잿빛곰팡이는 기주범위가 넓고, 저온에서 생장 및 생식(포자법)이 가능하기 때문에, 병원균의 감염 및 확산이 다른 병원균에 비해 비교적 용이하다. 잿빛곰팡이는 비닐하우스 등의 시설재배지에서 많은 피해를 일으키고, 대부분의 과실을 수확전 및 수확후에 오염시켜 수확량 감소를 야기하는 것으로 알려져 있다. 오염된 과실의 표면에 붙은 잿빛곰팡이 포자는 과실의 저장 및 유통 과정 중에 발아되어 잿빛곰팡이병을 일으키는 것으로 알려져 있다.
잿빛곰팡이의 방제 방법으로는 과실 수확후 저장 및 유통 중에서 저장온도 및 이산화탄소 가스의 농도를 조절하는 방법 등이 시행되고 있으나, 근본적인 해결방법은 제공되고 있지 않는 실정이다. 또한, 대부분의 채소들은 유통기한이 짧고 신선도 유지가 중요하고, 재배기간 중 농약의 사용이 채소에 대한 식품 안정성을 해칠 우려가 있어, 제한적으로 사용되고 있는 실정이다.
더욱이, 1970년대 이후 저독성의 선택적 살균제 사용이 보편화되면서 농업용 살균제에 내성을 지닌 식물병원성 진균류도 새롭게 출현하고 있는 실정이며, 잿빛곰팡이에 대한 저항성을 지닌 식물병원성 진균의 출현도 보고된 바 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 친환경 방제 수단이 활발히 연구되고 있다. 친환경 방제 수단으로는 식물병원균 저항성 품종 개발, 경종적 방제, 생물학적 방제 및 천연물 농약 등이 있다. 특히, 천연물 농약은 식물병원균에 대한 방제 효과가 우수할 뿐만 아니라, 새로운 합성 농약의 제조에 사용될 수 있어, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다.
한편, 생물학적 방제제(biological control agent)로 사용되는 균주들은 페나진(phenazine), 피아롤니트린(pyrrolnitrin), 2,4-DAPG(diacetylphloroglucinol) 및 Plt(pyoluteorin) 등의 항진균 물질(antifungal metabolites)을 생산하는 것으로 알려져 있다. 또한, 생물학적 방제제로 사용되는 균주들은 CLPs(cyclic lipopeptides)에 속하는 비스코신아마이드(viscosinamide) 및 텐신(tensin) 등도 생산하는 것으로 보고된 바 있다.
본 발명자들은 잿빛곰팡이에 대한 방제 효과가 우수한 신규 미생물에 관해 연구하던 중, 그람 음성간균인 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주가 잿빛곰팡이의 생육을 저해하고, 고온의 열처리에도 손상되지 않는 항진균 활성물질을 함유하고 있는 등, 잿빛곰팡이를 비롯한 식물병원성 진균을 방제하는 효과가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 100431278 KR 100537389 KR 1020100042184 KR 100519469
본 발명의 목적은 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 벌크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) JBK9 균주(KCTC 12466BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벌크홀데라아 세파시아 JBK9 균주로부터 분리된 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균의 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 식물병원성 진균을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 벌크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) JBK9 균주(KCTC 12466BP)를 제공한다.
본 발명에서 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주는 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 서열이 서열번호 1로 표시되며, 16S rRNA 염기서열이 공시균주와 99%의 상동성을 가지므로, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다.
이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주로 명명하고, 2013년 8월 8일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 수탁번호 KCTC 12466BP로 기탁하였다.
상기 균주는 마늘배지로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, (a) 질산을 환원하는 특성; (b) 혐기 조건하에서 포도당을 에너지원으로 사용하는 특성; (c) 프로테아제 또는 베타갈락토시다아제를 생산하는 특성; 및 (d) 12종의 탄소원을 에너지원으로 사용하는 특성;을 가질 수 있다.
본 발명의 그람 음성간균인 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주는 잿빛곰팡이의 생육을 저해하고, 고온의 열처리에도 손상되지 않는 항진균 활성물질을 함유하고 있으므로, 잿빛곰팡이를 비롯한 식물병원성 진균의 방제에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 식물병원성 진균에는 식물병을 일으킬 수 있는 진균이 제한없이 포함되며, 바람직하게는, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 콜렉토트리키움 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 산토모나스(Xanthomonas), 스클레레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 피시움 미리오틸륨(Pythium myriotylum), 콜레토트리쿰 그로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 페니실리움 히르수텀(Penicillium hirsutum) 또는 잿빛곰팡이(Bortyritis cinerea)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 상기 식물병원성 진균은 잿빛곰팡이다.
본 발명에서 용어 "잿빛곰팡이병"이란 식물의 잎에서 발생하는 곰팡이 감염병으로, 잎이 회색으로 물드는 병이다. 현재까지 확실한 잿빛곰팡이병의 발병기전 및 병원균의 생리, 생태적인 기초 연구가 미흡하여 확실한 예방 또는 방제 방법이 없는 실정이다.
또한, 본 발명은 상기 벌크홀데라아 세파시아 JBK9 균주의 배양물을 제공한다.
상기 배양물은 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주를 배양한 보통 한천배지(또는 영양 한천배지; Nutrient agar) 배지, TSA(tryptic soy agar) 배지, 표준한천배지(Standard Methods Agar; Plate Count Agar), 유당배지(lactose Broth), BGlB 배지(Brilliant Green lactose Bile Broth), 2배 농도 BGlB 배지, Endo 한천배지(Endo Agar), EMB 한천배지(Eosin methylene blue agar), 보통 배지(또는 영양 배지; Nutrient Broth), 데스옥시콜레이트 유당 한천배지(Desoxycholate lactose Agar) 또는 EC 배지(EC Broth)로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균의 방제용 조성물을 제공한다.
상기 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주 또는 이의 배양물은 식물의 뿌리 또는 그 주위의 토양에 적용하여 식물병원성 진균을 방제할 수 있다. 보다 바람직하게는 식물의 뿌리 또는 그 주위의 토양에 적용하여 식물의 잿빛곰팡이병을 방제할 수 있다.
상기 조성물은 미생물의 안정적인 제제화를 목적으로, 수화제, 입제 또는 캡슐제로 제제화되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주 또는 이의 배양물에 계면활성제, 중량제 및 영양제를 첨가하여 제조된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 미생물 또는 배양액을 잿빛곰팡이를 비롯한 식물병원성 진균의 방제용 조성물에 포함된 채로 공급될 수도 있고, 장기간 보존을 위해 별도로 보관하였다가 사용 직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 미생물을 장기간 보존하기 위해 별도로 공급되는 경우에는 글리세롤 저장용액에 -70℃ 이하로 보존하거나 -20 내지 -80℃에서 동결건조 보존하여 사용할 수 있다.
본 발명의 수화제는 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제 또는 영양제를 첨가하여 혼합하여 제조할 수 있다. 상기 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린 (dextrin), 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 입제는 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 첨가하여 제조할 수 있다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트 (bentonite), 탈크 (talc), 다이아라이트 (dialite), 카올린 (kaolin) 및 칼슘 카보네이트 (calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 입제는 미생물에 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 식물병원성 진균을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 식물병원성 진균을 방제하는 방법의 일 실시예로, 상기 조성물을 식물의 뿌리 또는 이에 근접한 토양에 직접 살포하거나 침지시키는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 식물병원성 진균을 방제하는 방법은 상기 균주의 배양액 또는 균주를 직접 도말 (spreading), 살포 (spraying), 침지(soaking)하거나, 상기 균주 배양액 또는 균주를 질석, 규조토, 퍼라이트에 흡착시켜 산포하거나, 경작 예정지 관리 시에는 토양을 갈아 엎는 중에 균주 배양액 또는 흡착시킨 균주를 섞는 방법을 이용할 수 있다. 이 밖에도 공지의 농약 투여법, 미생물 적용법 등이 이용될 수 있다. 이때, 상기 방법에 따라 처리되는 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1×100 내지 1×10100 마리의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 미리리터(㎖) 당 1×100 내지 1×10100 마리의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 조성물에 함유된 미생물의 유효량은 미리리터(㎖) 당 1×100 내지 1×10100 마리의 미생물 농도로 포함될 수 있다.
아울러, 상기 조성물은 잿빛곰팡이의 생육을 억제하여 잿빛곰팡이병을 방제할 수 있으며, 식물병원성 진균에 대한 방제 효과도 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 그람 음성간균인 벌크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) JBK9 균주는 잿빛곰팡이의 생육을 저해하고, 고온의 열처리에도 손상되지 않는 항진균 활성물질을 함유하고 있으므로, 잿빛곰팡이를 비롯한 식물병원성 진균의 방제에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 계통수를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 형태학적 특성을 그람 염색법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 생화학적 특성을 API 20 NE 키트로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 지방산 성분 및 함량을 MIDI 세록 소프트웨어로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 배양온도에 따른 성장 정도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주 및 잿빛곰팡이를 영양배지(Nutrient broth)가 포함된 PDA 배지에 대치배양한 후, 잿빛곰팡이에 대한 방제 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 배양액을 열처리한 후, 잿빛곰팡이에 접종하여 잿빛곰팡이 생육 저해도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1. 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 분리 및 동정]
본 발명에서는 잿빛곰팡이에 대한 항진균 활성을 나타내는 신균주를 분리 및 동정하기 위하여, 하기와 같은 과정을 수행하였다.
전국에서 약 220개의 토양시료를 수집하여 그 속에 함유된 미생물을 조사하였다. 토양시료로부터 미생물을 분리하기 위하여, 영양 한천(Nutrient agar) 및 TSA(tryptic soy agar) 배지를 사용하였다. 분리된 미생물들의 항진균 활성을 잿빛곰팡이와의 대치배양을 통해 확인하였다. 항진균 활성을 가지는 미생물을 동정하기 위해, 분리된 미생물의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하여 16S rRNA PCR 및 염기서열분석(sequencing)을 수행하였다.
상기 분리된 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하기 위해, 상기 균주의 균체를 회수한 다음, 이로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA는 통상의 프라이머(universal primer) 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열번호 2) 및 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 3)을 사용하여 16S rRNA를 증폭시켰다. 균주의 염기서열을 분석은 솔젠트(Solgent, Daejon, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLAST 알고리즘으로 동정하였으며, MEGA5 프로그램을 이용하여 게통수(phylogenetic tree)를 작성(도 1)하고 비교분석하였다. 이때, 상기 계통수는 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과(서열번호 1)를 토대로 벌크홀데리아 공시 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열과의 비교를 통해 근린결합법(neighbor-joining methods)을 사용하여 작성되었다. 이의 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 과정을 통해 분리된 균주가 기존에 보고된 벌크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)와 99%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 균주는 기존의 벌크홀데리아 세파시아와 완전히 동일하지 않기 때문에 신규한 균주임을 알 수 있다. 이에 따라, 상기 균주를 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주로 명명하고, 2013년 8월 8일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12466BP).
[실험예 1. 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 형태 생화학적 특성 분석]
본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 형태·생화학적 특성을 분석을 수행하기 위하여, 하기와 같은 과정을 수행하였다.
상기 실시예 1에서 분리된 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 형태적 특성을 Gram 염색법을 이용하여 조사하였다. 먼저, 상기 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주를 TSA 배지에서 24시간 배양한 후, 통상의 Gram 염색 절차에 따라 염색한 후, 광학현미경으로 관찰하였다. 또한, 상기 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 생화학적 특성을 조사하였다.
1. Gram 음성 간균
MacCongkey agar 배지에 획선을 그은 다음 분홍 또는 붉은 색으로 형성된 콜로니를 그람 음성 세균으로 판정하고, 세균을 염색하여 형태를 광학현미경으로 조사하였다. 대조군으로는 그람 양성 세균인 낫도균(또는 고초균) (Bacillus subtilis)을 사용하였다. 이의 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주가 MacCongkey agar 배지에서 분홍 또는 옅은 붉은 색의 콜로니를 형성하였으며, 그람(gram) 음성 간균임을 확인하였다.
2. 생화학적 특성
TSA 배지에서 배양한 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 콜로니를 20 루프(loops) 현탁한 용액을 이용하여 API 20 NE 키트에 접종하였다. 48시간 동안 배양한 후, 하기 균주의 다양한 기질 이용가능성을 확인하였다.
본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 생리학적 특성을 조사하였으며, 이의 결과를 표 1 및 도 3에 나타내었다.
유효성분 결과 유효성분 결과
질산칼륨 + D-만노오스 +
L-트립토판 - D-만니톨 +
D-포도당(발효) + N-아세틸-글루코사민 +
L-아르기닌 - D-말토오스 +
요소 - 글루콘산칼륨 +
구연산철(Esculin ferric citrate) - 카프르산 +
젤라틴(소 유래) + 아디프산 +
4-니트로페닐-bD-갈락토피라노사이드 + 말산 +
D-포도당(동화) + 시트르산나트륨 +
L-아라비노오스 + 페닐아세트산 +
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주는 질산을 환원시키고, 혐기 조건하에서 포도당을 에너지원으로 사용함을 확인하였다. 또한, 도3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주가 프로테아제 및 베타갈락토시다제를 생산하고, 12종의 탄소원을 에너지원으로 사용함을 확인하였다.
3. 지방산 분석
본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 지방산 함량을 분석하기 위해, 하기와 같은 과정을 수행하였다.
먼저, 튜브에 1ml의 시약 1(reagent 1)을 넣은 후, TSB 아가 배지에서 배양한 각각의 균주(상기 실시예 1에서 분리된 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주)를 40 루프 넣고 볼텍싱(vortex)하였다. 100℃의 온도에서 5분간 반응시킨 다음, 다시 볼텍싱하여 100℃의 온도에서 25분 동안 반응시켰다. 이후, 반응액을 냉각시킨 후, 2ml의 시약 2(reagent 2)를 넣고 혼합한 다음, 80℃의 항온수조에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 반응액을 다시 냉각시킨 후, 1.25ml의 시약 3(reagent 3)을 첨가하고 회전 교반기(orbital shaker)를 이용하여 10분 동안 교반시켰다. 교반 후 층의 분리가 완전히 일어나도록 정치하였다. 분리된 상층액을 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용하여 새로운 튜브로 옮긴 후, 3ml의 시약 4(reagent 4)를 넣고 교반시켰다. 교반 후, 5ml의 시약 5(reagent 5)를 넣고 다시 교반시켰다. 분리된 상층액을 파스퇴르 페펫을 이용하여 GC용 바이알(vial)에 넣었다. 지방산 측정은 HP 6890 가스 크로마토그래피(Gas Chromatograph)를 사용하였으며, 울트라2 모세관 칼럼(ultra2 capillary column)을 이용하여 수용 가스(carrier gas)로 수소(H2)를 0.4ml/분의 유속으로 흘려주었고 칼럼의 초기온도를 170℃에서 260℃까지 분당 5℃의 속도로 상승시켰다. 검출기(Detector)는 FID를 사용하였으며, 지방산 성분 및 함량의 분석은 MIDI 세록 소프트웨어(Sherlok software)를 제조사의 메뉴얼에 따라 이용하여 분석하였다. 이의 결과를 표 2 및 도 4에 나타내었다.
지질인산화 지방산 화합물 벌코홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 총 지질인산화 지방산의 상대 비율(%)
8:0 3OH 1.08
10:0 2.40
11:0 2OH 0.49
14:0 2.04
13:0 ISO 3OH 0.43
15:0 0.54
16:0 40.20
17:0 CYCLO 9.81
16:1 2OH 1.31
16:0 2OH 1.24
16:0 3OH 3.56
18:1 w7c 7.97
18:0 10.12
19:0 CYCLO w8c 3.79
18:1 2OH 2.45
상기 표 2 및 도4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주가 12종의 불포화지방산과 3종의 포화지방산을 함유하고 있음을 확인하였다.
[실시예 3. 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 최적 성장 배양온도 확인]
본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 최적 성장 배양온도를 알아보기 위하여, TSB 배지에 균주를 동량으로 배양하여 25℃, 30℃, 35℃ 또는 37℃의 온도에서 각각 24시간 동안 배양하였다. 이의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주는 25 내지 30℃의 배양온도에서 활발하게 성장함을 확인하였다. 또한, 30℃이후부터는 배양온도가 증가함에 따라, 균주의 성장이 저해되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주는 25 내지 30℃의 배양온도에서 최적의 균주 성장을 나타냄을 알 수 있다.
[실시예 4. 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 잿빛곰팡이에 대한 방제 효과]
본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주의 잿빛곰팡이에 대한 방제 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 과정을 수행하였다.
먼저, 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주와 잿빛곰팡이를 영양배지(Nutrient broth)가 포함된 PDA 배지에 대치배양하였다. 또한, 배양여액을 이용하여 항진균 활성 상태에서 상기 균주에 대한 열안정성을 측정하였다. 구체적으로, 영양배지에서 24시간 동안 배양한 배양액 5 ml를 12,000 rpm의 유속으로 10분간 원심분리한 다음, 0.45 ㎛ 막 필터(membrane filter)로 여과하였다. 얻어진 여과액을 121℃의 온도로 15분 동안 열처리한 다음, 용액 30 ㎕를 페이퍼 디스크(paper disc)에 접종하여 잿빛곰팡이 포자(104/ml)가 함유된 PDA 배지 상에 위치시킨 다음, 24℃의 온도에서 3일 동안 배양한 후, 방제 효과를 측정하였다. 이의 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.
도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주가 잿빛곰팡이의 생육을 저해시키는 저해대를 형성하였음을 확인하였으며, 다른 분리 세균에 비해 우수한 방제 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주가 생산하는 항진균 물질은 고온의 열처리에도 우수한 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주는 잿빛곰팡이의 생육을 저해시키는 효과가 우수하며, 고온의 열처리에도 우수한 활성을 가지는 항진균 물질을 함유하고 있으므로, 잿빛곰팡이를 비롯한 생물병원성 진균의 방제 효과가 우수함을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12466BP 20130808
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Claims (16)

  1. 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea)에 대한 항진균 활성을 가지고, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 16s rDNA를 가진, 벌크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) JBK9 균주(KCTC 12466BP).
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 균주는 하기와 같은 특성 중 어느 하나를 갖는 것을 특징으로 하는, 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주(수탁번호 KCTC 12466BP);
    (a) 질산을 환원하는 특성;
    (b) 혐기 조건하에서 포도당을 에너지원으로 사용하는 특성;
    (c) 프로테아제 또는 베타갈락토시다아제를 생산하는 특성; 및
    (d) D-포도당, L-아라비노오스, D-만노오스, D-만니톨, N-아세틸-글루코사민, D-말토오스, 글루콘산칼륨, 카프르산, 아디프산, 말산, 시트르산나트륨 및 페닐아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 탄소원을 에너지원으로 사용하는 특성.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 벌크홀데라아 세파시아 JBK9 균주(KCTC 12466BP)의 배양물.
  8. 삭제
  9. 제1항의 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주(KCTC 12466BP) 또는 제7항의 배양물을 유효성분으로 함유하는, 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea)의 방제용 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 잿빛 곰팡이의 방제용 조성물은 수화제, 입제 또는 캡슐제로 제제화되는 것을 특징으로 하는, 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea)의 방제용 조성물.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 잿빛 곰팡이의 방제용 조성물은 벌크홀데리아 세파시아 JBK9 균주 또는 배양물에 계면활성제, 중량제 및 영양제를 첨가하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea)의 방제용 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제9항의 잿빛곰팡이의 방제용 조성물을 이용한 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea)의 방제 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 방법은 상기 조성물을 식물의 뿌리 또는 이에 근접한 토양에 직접 살포하거나 침지시키는 것을 특징으로 하는, 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea)의 방제 방법.
  16. 삭제
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