KR20150056209A - 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스 cc110와 이를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약 - Google Patents

신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스 cc110와 이를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스 CC110와 이를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약에 관한 것이다.
본 발명의 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P) 균주는 서열번호 1로 표현되며 식물병에 대해 방제효과를 갖는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 식물병에 대하여 방제효과를 갖는 신규미생물인 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110균주와, 미생물제제 및 미생물농약이 제공됨으로써, 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 식물병 방제가 가능하여 작물의 수량을 증대시킬 수 있게 된다.

Description

신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스 CC110와 이를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약 {New microorganism Bacillus amyloliquefaciens CC110 and Microbial agent biopesticide containing the same}
본 발명은 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스 CC110와 이를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 식물병 중 노균병, 흰가루병, 잿빛곰팡이병에 대하여 방제효과를 갖는 신규균주를 오이잎으로부터 분리동정하고 이 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물제제 및 미생물농약에 관한 것이다.
오늘날 농업은 품종 개량, 토양 비옥도 증진, 병해충 방제 및 잡초 제거 등의 방법으로 식량 증산에 몰두해 왔지만 지속적인 농약의 사용과 남용은 토양과 하천의 심각한 오염을 유발하고 있다.
또한, 농작물에 이들 농약이 잔류함으로써 독성, 환경오염 및 사람과 가축에 대한 독성 등의 문제를 일으키기 때문에 농약 사용은 현재 세계적으로 그에 대한 제제 조치가 강화되고 있는 실정이다.
이와 같은 농약에 대한 우려와 삶의 질에 대한 관심이 커지면서 최근에는 새로운 대안으로서 농작물 병해충 방제에 미생물이나 식물추출물을 이용하는 생물학적 방제가 관심의 대상이 되고 있다.
특히, 미생물을 이용한 생물방제로는 토양미생물로부터 생산된 항생물질 또는 독소를 이용하여 병원균이나 해충을 방제하는 미생물농약 또는 미생물 자체의 길항작용을 이용하여 병원균의 감염으로부터 식물을 보호하고 간접적으로 식물생육을 촉진하는 미생물비료 등이 있다.
이러한 생물학적 방제는 환경에 유해한 화학적 농약을 대신하여 사용이 가능하므로, 소비자에게 안전한 농산물을 제공할 수 있게 된다.
특히, 식물병의 방제는 통상적으로 유독성 화학물질(농약)의 광범위한 사용에 의존하여 왔다.
이러한 유기합성농약에 의한 방제법은 대상 식물과 그 식물의 생산물뿐만 아니라 토양에도 유독성 화학물질을 처리해야 할 때가 많으므로, 식물잔류 및 토양잔류 독성 문제를 발생시키며, 이들 중 많은 화합물은 대상생물 이외의 미생물과 동물에도 독성을 나타내며, 사람에게도 해를 기칠 수 있다고 알려져 있다.
따라서 최근 식물병의 방제 연구 중 상당 부분은 환경친화적인 식물병 방제법을 알아내는 것을 목표로 삼고 있으며, 그 중 하나가 식물병원미생물에 길항적인 생물자원을 이용한 생물농약의 개발이다.
길항 미생물이란 다른 종류의 미생물과 함께 배양될 때 그 다른 미생물의 생육을 저지시키는 미생물을 말한다. 길항 미생물은 기생, 포식, 항생작용 등을 하는 것으로 알려져 있다.
관련 선행기술로는 한국 등록특허 제10-1260170 "항균활성을 갖는 신균주 슈도모나스 CP236 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물", 또는 한국 등록특허 제10-1166853호 "식물병 방제용 조성물" 등이 있다.
본 발명의 목적은 식물병에 대하여 방제효과를 갖는 신규미생물인 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110균주를 분리 동정하고, 이 균주를 함유하는 미생물제제 및 미생물농약을 제공하기 위한 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P) 균주는 서열번호 1로 표현되며 식물병에 대해 방제효과를 갖는 것이 특징이다.
상기 균주는 오이잎으로부터 분리되는 것이 특징이다.
상기 식물병은 노균병, 흰가루병, 잿빛곰팡이병 중 어느 하나인 것이 특징이다.
상기 균주는 미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용되는 것이 특징이다.
본 발명의 식물병 방제용 미생물제제는 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P) 균주의 균체 또는 그 배양액 및 그 배양 희석액을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.
상기 배양액은 TSB(Tryptic Soy broth)배지에서 배양한 것이 특징이다.
상기 배양액은 탄소원으로 프락토스(fructose), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 슈크로스(sucrose), 글루코스(glucose) 중 어느 하나 이상을 함유하는 것이 특징이다.
상기 탄소원은 상기 배양액 중량대비 5~10중량%로 함유되는 것이 특징이다.
상기 배양액은 질소원으로는 L-아스파라긴(L-Asparagine), 이스트 익스트락트(yeast extract), 카제인(casein), 펩톤(peptone), 염화암모늄(NH4Cl), L-아르기닌(L-Arginine), 인산암모늄((NH4)2HPO4), L-프롤린(L-proline) 중 어느 하나 이상을 함유하는 것이 특징이다.
상기 질소원은 상기 배양액 중량대비 5~10중량%로 함유되는 것이 특징이다.
상기 배양액은 4.5~9.5의 pH 및 7.5~55℃의 온도하에서 배양한 것이 특징이다.
상기 배양액에는 1㎖ 당 1×105∼1×108개 포자의 상기 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주가 포함되는 것이 특징이다.
상기 배양 희석액은 상기 배양액을 2~5 배 희석한 것이 특징이다.
본 발명의 식물병 방제용 미생물 농약은 상기의 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P) 균주의 균체 또는 그 배양액 및 그 배양 희석액을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.
본 발명의 식물병을 방제하는 방법으로는 상기의 미생물 농약을 식물병이 존재하는 식물체에 분무 처리하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 식물병에 대하여 방제효과를 갖는 신규미생물인 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110균주와, 미생물제제 및 미생물농약이 제공됨으로써, 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 식물병 방제가 가능하여 작물의 수량을 증대시킬 수 있게 된다.
도 1은 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110의 분자생물적 동정을 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110의 염기서열을 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110의 형태적 특성을 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110의 오이 노균병 발생 억제효과를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주 cell 및 이의 배양액 처리시 오이 노균병 발생 억제효과 및 배양액 처리시 오이 노균병균의 형태 변화를 나타낸 도면이다.
A: CC110 균주의 배양액 처리한 오이잎에 노균병균 접종 7일 후 노균병이 발생하지 않은 오이잎 표면
B: 노균병이 발생한 오이잎에 CC110균주의 배양액 처리 3일후 노균병균의 포자낭에 cell의 영향으로 변형된 포자낭
C: 오이잎에 발생한 노균병균의 포자낭에 CC110균주의 배양액 처리후 전자현미경 사진
D: CC110균주의 배양액 처리 7일후 오이노균병균의 변형된 포자낭
도 6은 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주의 pH별 생장능을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주의 배지종류별 생장능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주의 배지에 함유된 탄소원(0.5%) 종류별 생장능을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주의 배지에 함유된 탄소원(1.0%) 종류별 생장능을 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주의 배지에 함유된 질소원(0.5%) 종류별 생장능을 나타낸 그래프이다.
도 11은 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주의 배지에 함유된 질소원(1.0%) 종류별 생장능을 나타낸 그래프이다.
도 12는 실시예 1에서 분리된 신규균주 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주의 오이 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 나타낸 도면이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
본 발명의 신규 미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주는 서열번호 1로 표현되며, 식물병에 대해 방제효과를 나타내는 것으로 특히, 노균병, 흰가루병 및 잿빛곰팡이병에 대한 방제효과를 나타내는 것으로 하기 실시예 및 실험예를 통해 규명되었다.
설명하면, 식물병에 대하여 높은 방제효과를 나타내는 신규 균주를 선발하기 위하여, 토양에서 채취하여 신규균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 배지에 접종하여 배양한 후 관찰 한 바 형태적으로 타원형태이며, 특징적인 생리생화학적 특성을 나타냄을 확인하였다(하기 표 1에 예시).
이에, 이를 16s rRNA 분석결과, 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens)의 신규한 균주로 밝혀져, 이를 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주로 명명하고, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전지원센터에 기탁하여 2013년 07월 10일 수탁번호 KACC91830P를 부여받았다.
상기 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 1,489bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다.
이러한 상기 본 발명의 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주는 하기 배양조건을 통해 배양액을 제조할 시 상기 신규균주를 단시간내에 대량생산도 가능하여 산업적으로 사용할 수 있다.
설명하면, 상기 신규미생물은 배양배지로서 TSB(Tryptic Soy broty)배지 상에서 잘 자라며, 특히 상기 TSB배지의 배양액들을 2~5배 정도 희석한 배양 희석액을 사용할 시에도 오이 노균병에 대한 병반면적율을 나타냄을 확인하였다.(하기 표 2에 예시, 도 7 참고).
또한, 상기 배양액에는 탄소원으로 프락토스(fructose), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 슈크로스(sucrose), 글루코스(glucose) 중 어느 하나 이상을 함유하며, 질소원으로는 L-아스파라긴(L-Asparagine), 이스트 익스트락트(yeast extract), 카제인(casein), 펩톤(peptone), 염화암모늄(NH4Cl), L-아르기닌(L-Arginine), 인산암모늄((NH4)2HPO4), L-프롤린(L-proline) 중 어느 하나이상을 함유하는 것이 좋다. 바람직하게는 상기 탄소원과 질소원을 각각 상기 배양액의 중량대비 0.5~1.0 중량%로 함유하는 것이 상기 균주의 대량생산을 가능하게 하는 조건이다(도 8,9,10,11 참고).
이때, 상기 탄소원은 0.5 중량% 미만으로 함유될 경우 에너지를 만들어주는 요소가 너무 적어 상기 균주의 증식속도를 더디게 하며, 1.0중량%초과로 함유될 경우 다른성분과의 적절한 혼합이 이루어지지 않아 오히려 상기 균주의 증식속도를 더디게 한다.
상기 질소원은 0.5 중량% 미만으로 함유될 경우 균주의 생장과 생식을 더디게 하여 선택적으로 촉매하는 기질의 특이성이 떨어지게 되며, 1.0 중량%를 초과할 경우 과도한 촉매제가 첨가됨으로서 다른 성분과의 적절한 혼합이 이루어지지 않음과 동시에 균주의 변형을 일으킬 우려가 있다.
또한, 배양조건으로 상기 균주는 상기 균주는 7.5~55℃범위에서 생육이 가능하며, 특히 25~35℃에서 가장 잘 배양된다(하기 표 6 예시).
상기 신규균주의 생육 pH 범위는 4.5~9.5으로, 최적 pH는 7.0이다(도 6 참고).
이러한 본 발명의 상기 신규미생물 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC11의 균체 또는 그 배양액 및 배양 희석액은 식물병 방제용 미생물제제 또는 미생물농약의 유효성분으로 사용하게 된다.
특히 상기 미생물제제는 식물병 중 노균병, 흰가루병, 잿빛곰팡이병에 대해 우수한 방제효과를 나타냄을 확인한 바(하기 표 7, 8, 도 12 참고), 상기 미생물제제는 활성세균의 생존 유지기간, 생존발아율, 항균 활성유지, 항균물질 생성 능력이 우수하므로, 미생물농약, 종자코팅제, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등에 이용될 수 있다.
또한, 상기 미생물제제를 곰팡이병을 앓고 있는 농작물 또는 농작물 자체에 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주를 집중하여 분무 또는 관주처리하고, 미생물의 유효량은 단위용량(㎖) 당 미생물의 수가 1×105∼1×108 마리 정도로 분무하는 것이 식물병에 대해 가장 우수한 살균효과를 나타내게 된다(하기 표 3, 4에 예시).
하기 실시예 및 실험예에 의해서 보다 구체적으로 설명하지만 보호범위가 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명의 신규균주 분리
오이 잎을 차아염소산나트륨 10%용액으로 1분간 표면소독한 후 마쇄하여 10분간 80℃로 열처리한 다음 1/10 TSA 배지에 도말하여 20℃에서 2일간 배양 후 균을 분리하여 하기 실시예 2에서 분자생물학적 동정, 형태학적 특성, 생리생화학적 특성 및 염기서열 분석을 시행하였다.
<실시예 2> 분리된 신규균주의 분자생물학적 동정, 형태학적 특성, 생리생화학적 특성 및 염기서열 분석
1) 분자생물학적 특성
CC110 균주의 계통분석을 위해서는 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 이용하였다.
즉, universal primer인 27F와 1492R 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭하였다.
얻어진 PCR 산물은 다시 27F와 1492R sequencing primer와 DNA sequencing kit (BigDye terminator Cycle Sequencing Ready Reacions v3.1 ; Applied Biosystem)를 사용하여 반응시킨 후, 3700 Genetic Analyser(Applied Biosystems)로 1489bp의 염기서열을 결정하였다.
표준균주와의 염기서열 유사도는 EzTaxon-e server(Kim et al., 2012)를 통해 계산하였고, 유연관계를 분석하기 위하여 CLUSTAL W program을 이용하여 염기서열을 정렬한 후 MEGA version 5.1 프로그램(Tamura et al., 2011)을 이용하여 진화계통수를 작성하였다.
branch의 안정성은 1,000회의 resampling(bootstrap value)을 통하여 조사하였다.
2) 형태 및 생리생화학 특성
형태학적 특성은 TSA 배지에서 1-2일 동안 배양된 균을 1.5% agarose가 얇게 코팅된 슬라이드 글라스에 접종하고, 광학현미경(DM2500,Leica)을 사용하여 1000배의 배율로 관찰하였다. 포자가 미처 형성되지 못하였거나, 이미 포자가 나출된 균주는 배양 시간을 증가 또는 감소시켜 관찰하였다.
Catalase 활성은 3% (v/v) hydrogen peroxide 용액을 떨어뜨려 기포방울의 형성유무로, oxidase 활성은 1% (w/v) tetramethyl-p-phenylenediamine (bioM)을 이용하여 결정하였다.
혐기조건에서의 생육능은 AnaeroGen sachet pouches (Oxoid, England)를 이용하여 28°C에서 2주간 배양한 후 결정하였다. 단백질(10 % skimmed milk, w/v), 전분(1.0 %, w/v), 지질(1.0% tributyrin), 섬유소(CM-cellulose, 0.1 %, w/v), 키틴(0.5 %, w/v)의 가수분해능은 Smibert & Krieg (1994)의 방법에 준해 수행하였고, 배양 7일 후에 판정하었다.
pH에 따른 생육 범위(pH 0.5 간격)는 citric acid/Na2HPO4(pH5.06.0), NaH2PO4/Na2HPO4 (pH6.58.0), Tris/HCl (pH8.5와 pH9.0), Na2CO3/NaHCO3F (pH9.5와 pH10.0) (Gomori, 1955)의 완충액을 이용하여 시험하였다.
생육온도범위는 7.5-55℃로 조절된 온도구배장치 배양기에서 2일간 배양한 후 생육여부를 조사하였다. 염농도 따른 생육 범위는 NaCl을 배지에 첨가해 1% 간격으로 0-16%로 조정한 후 수행하였다.
2. 실험결과
(1) 형태적 특성
관찰된 균주의 모습은 도 3과 같으며, 이 균주의 생리생화학적 특성은 하기 표 1과 같이 나타났다.
생리생화학적 특성
(Characteristics)		 CC110
포자형태(Spore shape) 타원체(ellipsoidal)
포자위치(Spore position) subterminal
pH 5.0~10.0
NaCl(%) 1~15
온도
Temperature(℃)		 10~55
전분(Starch) +
카제인(Casein) +
CM-셀룰로오스(CM-cellulose) +
젤라틴(Gelatin) +
지질(Lipid) -
키틴(Chitin) -
질산환원(Nitrate reduction) +
옥시다아제 활성(Oxidase activity) +
카탈라아제 활성(Catalase activity) +
글루코오스(Glucose) +
아라비노스(Arabinose) +
만노스(Mannose) +
만니톨(Mannitol) +
글루코사민(N-acetyl-glucosamine) +
말토스(Maltose) +
글루콘산염(Gluconate) +
카프린산염(Caprate) -
아디핀산염(Adipate) -
사과산염(Malate) +
구연산염(Citrate) +
페닐 아세트산(Phenyl-acetate) -
또한, 계통분류학적 분석결과 도 1에서와 같이, 다른 유사 종들과는 다른 종(strain)이라는 것이 입증되었다.
또한, 실시예 1에서 분리한 균주가 신규 균주임을 뒷받침하기 위해 16S rDNA의 ITS(internal transcribed spacer) 영역에 대한 염기서열 분석을 실시하였고, 그 결과는 도 2와 같이 나타났다.
이에, 첨부된 기탁증명서에 기재되어 있듯이, 신규미생물인 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110으로 명명하였으며, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전지원센터에 기탁하여 2013년 07월 10일 수탁번호 KACC91830P를 부여받았다.
<실험예 1> 본 발명의 신규 CC110 균주의 배양 배지의 희석농도별 오이노균병 발생 억제효과 확인
1. 실험방법
상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 각각 TSB배지, LB배지, NB배지와 KB배지에 24시간 진탕배양(28℃, 150rpm)하고 각 배양액을 5배로 희석하여 오이에 분무 처리 후 직경 25mm로 잎절편을 만들어서 오이 노균병 유주자낭(1×105/㎖)을 10㎕씩 점접종하여 20℃ 항온기에서 형광등을 하루에 12시간 조사하면서 처리 11일후 오이노균병 발생을 조사하였다.
배지조성(/ℓ)은 다음과 같다.
·TSB(Tryptic soy broth) 배지; Casein 17g, Soybean 3g, Dextrose 2.5g, NaCl 5g, K2HPO4 2.5g
·NB(Nutrient broth) 배지; Beef extract 3g, Peptone 5g
·KB(King's broth) 배지; Proteose peptone 10g, Glycerol 15g, K2HPO4 1.5g, MgSO4 5g
·LB(Luria Bertani broth) 배지; NaCl 10g, Tryptone 10g, Yeast extract 5g
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 2와 같이 나타났다.
처리내용 배지별 오이 노균병 병반면적율(%)
TSB LB NB KB 무처리
배양원액 4.0 0 11.0 0 22.0
배양 5배 희석액 3.0 10.0 20.0 22.0
상기 표 2에 나타나 있듯이, 상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주는 TSB 배지, LB배지, NB배지, KB배지 모두 오이 노균병 병반면적율에 대해 무처리보다 낮게 나타났으며, 5배 희석한 배양 희석액에서는 TSB 배지, LB배지, NB배지에서 오이 노균병 병반면적율에 대해 무처리보다 낮게 나타냄을 확인하였다. 특히 TSB 배지에서 배양원액, 희석액 모두 오이 노균병 병반면적율에 대해 우수한 효과를 나타내는 바, 본 발명에서는 상기 실시예 2에서 확인된 신규균주를 TSB 배지에서 배양하는 것이 가장 적합함을 알 수 있었다.
<실험예 2> 신규균주의 오이노균병에 대한 억제효과 확인
1. 실험방법
(1) 신규균주의 처리형태별 오이노균병에 대한 억제효과 확인
상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 TSB배지에 이식하여 2일간 28℃에서 150rpm으로 배양하여 원심분리(8000rpm, 10℃, 30분)하였다.
배양액은 원액, 2배, 5배로 하고, 배양여액은 원액, 2배, 5배로 하고, 세포는 농도별로 오이잎에 처리한 후에 잎절편을 만들어서 노균병균의 포자낭을 1×106~1×108/㎖을 10㎕씩 점접종하여 20℃ 항온기에서 형광등을 하루에 12시간 조사하면서 처리 8일후에 병발생을 조사하였다.
(2) 신규균주의 휘발성 물질에 의한 오이노균병에 대한 억제효과 확인
TSA배지가 분주된 I plate에 CC110균주를 이식하여 25℃에서 배양하고, 다음날에 직경25mm 오이 잎절편에 노균병균의 포자낭을 1×105/㎖을 10㎕씩 점접종하여 20℃ 항온기에서 형광등을 하루에 12시간 조사하면서 처리 8일후 오이노균병 발생을 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 3, 4와 같이 나타났다.
처리내용 희석배수 오이노균병 병반면적율(%)
배양액 원액 0.0
×2 3.0
×5 8.0
배양여액 원액 0.0
×2 4.0
×5 7.0
Cell 1×108 9.4
5×107 10.0
5×106 20.0
1×106 19.0
무처리 - 21.0
오이 노균병 병반면적율(%)
CC110 처리 무처리
0 13.2
상기 표 3, 4에 나타나 있듯이, 상기 실시예 2에서 확인된 신규균주의 배양액, 배양여액 모두 원액 뿐만아니라 이를 2~5배 희석한 희석액에서도 오이노균병에 대한 우수한 병반면적율을 나타냄을 확인하였으며, 균체로는 1×105~1×108에서 오이노균병에 대한 우수한 병반면적율을 나타냄을 확인하였다.
<실험예 3> 본 발명의 신규균주 배양액의 오이 노균병 방제 효과 확인
1. 실험방법
상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주의 배양은 TSB tryptic soy agar 배지(TSA)(Difco, Laboratoris, Detroit)배지를 이용하여 28℃에서 120 rpm으로 24시간 배양하였다.
원예용 장기육묘용 상토와 바로커상토를 1:1로 비율로 혼합하여 직경 7 ㎝ 비닐포트에 담아 은성백다다기 오이를 파종하여 온실에서 재배하면서 2엽기의 오이를 사용하였다.
오이 2엽기의 유묘에 배양한 미생물의 배양액을 분무처리하고 5시간 후에 배양한 노균병균을 붓을 사용하여 유주자낭을 수거하여 유주자낭 5×104㎖-1로 조절하여 상온에 2시간 방치하였다.
노균병균을 2엽기의 오이식물체에 처리당 6반복으로 분무접종하여 20℃의 12시간 형광등이 조사되는 접종상에 넣어 7일후에 병반면적을 조사하였다.
2. 실험결과
오이 노균병 병반면적율(%)
CC110 처리 무처리
35.0 82.0
상기 표 5에 나타나 있듯이, 본 발명의 실시예 2에서 확인된 신규균주의 배양액에서도 오이 노균병 병반면적율에 대해 무처리보다 훨씬 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 4> 본 발명의 신규 CC110균주의 오이 노균병 발생 억제 기작확인
1. 실험방법
TSA배지가 분주된 I plate에 상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 이식하여 25℃에서 배양하고, 다음날에 직경25mm 오이 잎절편에 노균병균의 포자낭을 1×105/㎖을 10㎕씩 점접종하여 20℃ 항온기에서 형광등을 하루에 12시간 조사하면서 처리 8일후 오이노균병 발생 여부를 해부현미경으로 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 4에 나타나 있듯이, 플레이트에서 CC110균주 처리에서 오이노균병이 전혀 발생하지 않았고, 실체현미경(M205A, Leica)로 검경결과로도 접종한 유주자낭이 흔적만이 남아있었지만, 무처리는 오이노균병이 발생하였으며, 해부현미경상에서 많은 오이노균병균의 균사와 유주자낭이 형성되었음이 확인되었다.
<실험예 5> 본 발명의 신규 CC110균주의 배양액과 cell의 오이 노균병균 억제활성 확인
1. 실험방법
상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 TSB배지에 이식하여 2일간 28℃에서 150rpm으로 배양하여 원심분리(8000rpm, 10℃, 30분)하였다.
배양액은 원액로 하고, cell은 1×108/㎖ 농도로 오이잎에 처리한 후에 잎절편을 만들어서 노균병균의 포자낭을 1×105/㎖을 10㎕씩 점접종하여 20℃ 항온기에서 형광등을 하루에 12시간 조사하면서 처리 8일후에 병발생을 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 5에 나타나 있듯이, CC110균주의 배양액과 Cell를 처리한 결과 오이노균병 발생을 억제함을 확인하였다(도 5의 상면도면).
배양액을 처리하여 광학 및 전자현미경사진도 나타낸 바와 같이 오이노균의 유주자낭의 형태가 변형되어 병이 발생하지 않았음을 확인하였다(도 5의 하면도면).
<실험예 6> 본 발명의 신규 CC110균주의 배양적 특성 확인
1. 실험방법
상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주의 대량배양조건을 확립하기 위하여 온도구배장치(Bio-photo recorder, Advantec Toyo Kaisa, LTD)를 이용하여 TSB배지(Tryptic soy broth 배지: pancreatic digest of casein 17g, enzymatic digest of soybean meal 3g, dextrose 2.5g, sodium chloride 5g, dipotassium phosphate 2.5g, 증류수 1ℓ)를 사용하여 48시간 배양하여 균 생육을 조사하였다.
2. 실험결과
배양온도별 OD값
7.5℃ 15.2℃ 19.6℃ 23.1℃ 26.6℃ 29.7℃ 33.1℃ 36.6℃ 40.0℃ 43.5℃ 48.2℃ 55.0
0.015 1.506 2.410 2.468 2.519 2.645 2.475 2.980 2.181 2.014 1.418 0.352
상기 표 6에 나타나 있듯이, 본 발명의 실시예 2에서 확인된 신규균주 CC110은 7.5~55℃에서 생육이 가능함을 확인하였으며, 특히 25~35℃에서 가장 생육이 활발히 일어남을 확인하였다.
<실험예 7> 본 발명의 신규 CC110균주의 pH별 생장율 확인
1. 실험방법
상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 TSB배지에 30℃에서 120rpm으로 24시간동안 진탕배양하여 그 배양액을 10배로 희석하였다.
마이크로플레이트(100well)에 멸균된 TSB배지를 이용하여 pH 4.0부터 9.5까지 0.5단위로 배지를 조제하여 pH배지별 3반복으로 350㎕씩 분주하고, 상기 CC110균주를 배양한 희석액을 10㎕씩 접종하여 Bioscreen C(Growth Curves AB Ltd)에서 30℃에서 48시간 배양하여 흡광도(600nm)로 OD(optical density)를 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 6에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규균주인 CC110균주는 7.0~7.5의 pH로 이루어진 배양액에서 생육이 가장 잘 이루어짐을 확인하였다.
<실험예 8> 본 발명의 신규 CC110균주의 배지종류별 생장율 확인
1. 실험방법
상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 30℃에서 120rpm으로 24시간동안 진탕배양하여 그 배양액을 10배로 희석하였다. Microplat(100well)에 멸균된 TSB배지, LB배지, KB배지와 NB배지별 3반복으로 350㎕씩 분주하고, 상기 CC110균주를 배양한 희석액을 10㎕씩 접종하여 Bioscreen C(Growth Curves AB Ltd)에서 30℃에서 48시간 배양하여 흡광도(600nm)로 OD(optical density)를 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 7에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규균주인 CC110균주는 TSB배지로 이루어진 배양액에서 생육이 가장 잘 이루어짐을 확인하였다.
<실험예 9> 본 발명의 신규 CC110균주의 탄소원 종류 및 함량별 생장율 확인
1. 실험방법
배양적 특성 조사는 상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 30℃, TSB배지, 24시간동안 전배양하고 Microplat(100well)에 멸균된 배지별(원액)로 350㎕씩 넣고(3반복) 각 탄소원 종류별로 넣은 다음 CC110 균주를 10㎕씩 접종하여 Bioscreen C(Growth Curves AB Ltd)에 플레이트를 넣고 컴퓨터를 가동하여 OD값을 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 8, 9에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규균주인 CC110균주는 TSB배지에 탄소원으로 프락토스(fructose), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 슈크로스(sucrose), 글루코스(glucose) 중 어느 하나 이상이 0.5중량% 내지 1.0중량%를 포함하는 것이 생육이 잘 이루어짐을 확인하였다.
<실험예 10> 본 발명의 신규 CC110균주의 질소원 종류 및 함량별 생장율 확인
1. 실험방법
배양적 특성 조사는 상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 30℃, TSB배지, 24시간동안 전배양하고 Microplat(100well)에 멸균된 배지별(원액)로 350㎕씩 넣고(3반복), 각 질소원 종류별로 넣은 다음 CC110 균주를 10㎕씩 접종하여 Bioscreen C(Growth Curves AB Ltd)에 플레이트를 넣고 컴퓨터를 가동하여 OD값을 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 10, 11에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규균주인 CC110균주는 TSB배지에 질소원으로 L-아스파라긴(L-Asparagine), 이스트 익스트락트(yeast extract), 카제인(casein), 펩톤(peptone), 염화암모늄(NH4Cl), L-아르기닌(L-Arginine), 인산암모늄((NH4)2HPO4), L-프롤린(L-proline) 중 어느 하나 이상이 0.5중량% 내지 1.0중량%를 포함하는 것이 생육이 잘 이루어짐을 확인하였다.
<실험예 11> 본 발명의 신규 CC110균주의 오이 흰가루병 발생 억제효과 확인
1. 실험방법
오이 흰가루병에 대한 실험은 상기 실시예 2에서 확인된 CC110균주를 TSB배지에 이식하여 2일간 28℃에서 150rpm으로 배양하여 배양액을 흰가루병균이 발생하기 시작한 오이잎에 분무처리한 후에 잎절편을 만들어서 25℃ 항온기에서 형광등을 하루에 12시간 조사하면서 처리 8일후에 병발생을 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 7과 같이 나타났다.
처리내용 흰가루병 병반면적율(%) 방제효과(%)
CC110 0.0 100
무처리 93.1 -
상기 표 7에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규균주 CC110은 흰가루병에 대해 우수한 방제효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 12> 본 발명의 신규 CC110균주의 오이 잿빛곰팡이병 발생 억제효과 확인
1. 실험방법
오이 육묘는 TKS상토와 원예용 장기육묘상토를 1:1(V:V)로 혼합하여 오이(은성백다다기)종자를 파종하여, 유묘 2엽기에 배양한 시험미생물을 분무처리 4시간 후에 잿빛곰팡이병균의 포자현탁액에 영양원으로 v8 juice 10%액과 0.1M KH2PO4를 첨가하였다.
영양원이 첨가된 잿빛곰팡이균의 포자현탁액(1×106cfu/㎖-1)를 오이유묘에 접종하여 20℃, 100% 습도로 조절한 접종상에 넣은 24시간 후 꺼낸 다음 6일후에 병반면적을 조사하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 하기 표 8과 도 12와 같이 나타났다.
처리내용 잿빛곰팡이병 병반면적율(%) 방제효과(%)
CC110 3.2 78.0
무처리 81.2 -
상기 표 8과 도 12에 나타나 있듯이, 본 발명의 신규균주 CC110은 잿빛곰팡이병에 대해 우수한 방제효과를 나타냄을 확인하였다.
이와 같이 본 발명의 신규미생물인 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens)CC110 균주는 식물병 중 특히 노균병, 흰가루병 및 잿빛곰팡이병에 대해 우수한 방제효과를 나타냄으로써 이를 함유하는 미생물 제제는 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 식물병 방제용 미생물 농약으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 시험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91830P 20130710
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> New microorganism Bacillus amyloliquefaciens CC110 and Microbial agent and biopesticide containing the same <130> p2013-0148 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1489 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens CC110 <400> 1 tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt 60 gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120 ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac 180 ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240 aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300 gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360 acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 420 gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca ccttgacggt acctaaccag 480 aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540 ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 600 gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660 ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720 ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 840 ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960 gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 1020 gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080 cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200 cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1260 ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg 1440 agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt cgtaacagg 1489

Claims (15)

  1. 서열번호 1로 표현되며 식물병에 대해 방제효과를 갖는,
    신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P) 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 오이잎으로부터 분리되는,
    신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P)균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 식물병은 노균병, 흰가루병, 잿빛곰팡이병 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P)균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 미생물 농약, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용되는,
    신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P)균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항의 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P) 균주의 균체 또는 그 배양액 및 그 배양 희석액을 유효성분으로 함유하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 배양액은 TSB(Tryptic Soy broth)배지에서 배양한 것을 특징으로 하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 배양액은 탄소원으로 프락토스(fructose), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 슈크로스(sucrose), 글루코스(glucose) 중 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 탄소원은 상기 배양액 중량대비 5~10중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 배양액은 질소원으로는 L-아스파라긴(L-Asparagine), 이스트 익스트락트(yeast extract), 카제인(casein), 펩톤(peptone), 염화암모늄(NH4Cl), L-아르기닌(L-Arginine), 인산암모늄((NH4)2HPO4), L-프롤린(L-proline) 중 어느 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 질소원은 상기 배양액 중량대비 5~10중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 배양액은 4.5~9.5의 pH 및 7.5~55℃의 온도하에서 배양한 것을 특징으로,
    식물병 방제용 미생물제제.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 배양액에는 1㎖ 당 1×105∼1×108개 포자의 상기 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110 균주가 포함되는 것을 특징으로 하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  13. 제5항에 있어서,
    상기 배양 희석액은 상기 배양액을 2~5 배 희석한 것을 특징으로 하는,
    식물병 방제용 미생물제제.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항의 신규미생물 바실러스 아밀로리퀴펜션스(Bacillus amyloliquefaciens) CC110(KACC 91830P) 균주의 균체 또는 그 배양액 및 그 배양 희석액을 유효성분으로 함유하는,
    식물병 방제용 미생물농약.
  15. 제14항의 미생물 농약을 식물병이 존재하는 식물체에 분무 처리하는 것을 특징으로 하는, 식물병을 방제하는 방법.
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