KR100533874B1

KR100533874B1 - 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균, 이를 이용한 리포펩티드의 제조방법, 상기 바실러스속 CMB26균 및/또는리포펩티드를 유효성분으로 함유하는 식물곰팡이균의 살균제.

Info

Publication number: KR100533874B1
Application number: KR10-2002-0049338A
Authority: KR
Inventors: 정순주; 지연태; 김희경; 김희선; 이정현
Original assignee: 지연태
Priority date: 2002-08-20
Filing date: 2002-08-20
Publication date: 2005-12-06
Also published as: KR20020072813A

Abstract

본원 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 상이한 농약 과다 사용때문에 내성이 생기는 고질적인 곰팡이균인 역명, 탄저병, 흰가루병 등의 항곰팡이성 미생물농약 및 그의 제조방법, 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) 및 그의 제조방법을 제공하고 더욱이 화성비료에서 나타날 수 있는 토양잔류와 축적, 먹이사슬에 의한 가축과 인체에 이행, 합성농약의 과다사용으로 인한 생태계 파괴를 막을 수 있는 농약을 제공한다.

곰팡이의 포자 및 균사체 파괴능이 높은 리포펩티드(lipopeptide)를 생산하는 것을 특징으로 하는 신규한 미생물인, 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균(NCBI 신종등록번호 : AYO48851, 기탁번호 제KFCC-11289호).

바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 16s rRNA 의 유전자 염기배열의 구조가 하기와 같은 특이한 구조임.

(- 염기구조 : 1번부터 320번 염기까지 염기서열이 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subrilis)와 99.6%와 상동성을 가지며, 321부터 1501번 염기까지의 염기서열이 바실러스 서렌지네시스(B. thuringienesis)와 99.7%의 상동성을 가진다.

- 전체염기서열의 상동성 : 바실러스 서브틸리스(B. subrilis)와는 95.6% 의상동성을 가지고, 바실러스 세레우스군 (B. cereus group)과는 96.7%의 상동성을 가진다.

- 분자량 부분 : 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균이 생성하는 항공팡이성 물질인 리포펩티드 분자량이 1081, 1073, 1067, 1095 Da 과 1463, 1499, 1477, 1485, 1491 Da을 나타낸다.)

하기와 같은 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균수의 수치 및 리포펩티드의 생성을 동시에 증강시키는 다음과 같은 조건하에서 배양된 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균으로부터 합성분비되는 식물곰팡이균의 살균성을 갖는 리포펩티드의 제조방법.

(- 배양조건:

. 배양온도 : 28℃ ∼ 37℃

. 최적 배양 pH : 6 ∼ 8

. DO요구량 : 10ppm이상

- 첨가물 조건

. 페닐알라닌의 첨가에 따라 리포펩티드 생성량 증가

. M9 최소 배지를 사용시 균수의 증가와 리포펩티드 생성이 동시 증가

. 균수의 증가 및 리포펩티드 생성유발 탄소원으로서 글루코스를 이용

. 균수의 증가 및 리포펩티드 생성유발 질소원으로서 소듐 암모늄

히드로겐 포스페이트 (sodium ammonium hydrogen phpsphate)를 사용)

바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 고체분리물 또는 액상배양액, 또는 상기 균주로부터 생성된 합성분비물인 리포펩티드, 또는 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 및 이로부터 생성되어 합성분비된 리포펩티드를 이용하여 식물곰팡이균의 병해 예방 또는 살균하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제.

상기 농약은 과수, 농원예작물, 화훼 등의 작물에 기생하여 피해를 발생시키는 곰팡이균 중 흰가루병, 만고병, 겹무늬 썩음병, 시들음병, 탄저병, 잿빛, 역병또는 문고병 등의 병해 예방 또는 살균하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제.

작물기생 곰팡이의 병해 예방 및 살균시키기 위해서 상기 살균제를 원액 내지 2,000배 희석하여 엽면살포, 관주 또는 엽면살포와 관주를 병행처리하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제이다.

Description

신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균, 이를 이용한 리포펩티드의 제조방법, 상기 바실러스속 CMB26균 및/또는 리포펩티드를 유효성분으로 함유하는 식물곰팡이균의 살균제.{NEW BACILLUS CMB26 STRAIN, PRODUCTION OF LIPOPEPTIDE USING CMB26 STRAIN, AND GERMICIDE OF PLANT FUNGAL PATHOGENS CONTAINING CMB26 STRAIN AND/OR LIPOPEPTIDE}

본 발명은 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균, 이를 이용한 리포펩티드의 제조방법, 상기 바실러스속 CMB26균 및/또는 리포펩티드를 유효성분으로 함유하는 식물곰팡이균의 살균제에 관한 것이다.

본 발명과 관련된 종래 기술로서, 1980년 이후부터 현재까지의 바실러스속 (Bacillus sp.) 계열을 사용하여 특허출원된 내용으로서는, 특허출원 제2000-26728호의 경우는 고초균(Bacillus subtilis), 슈도모나스속 미생물 (Pseudomonas sp.), 방선균 (Streptomyces), 광합성 세균 (Rhodospirillum), 아조토박터(Azotobacter), 유산균 (Lactobacillus) 등을 포함하는 토양미생물제제와, 락토바실러스 플랜타룸 (Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 스트렙토코커스 패슘 (Streptococcus faecium)을 포함하는 엽면 살포용 유산균제와, 이들의 활성을 촉진하는 토양개량용 숯, 목초액 및 발효액비등을 포함하는 보조제제들을 이용하는 단계를 포함하는 BIO-C 유기농법에 관한 것이었다.

특허 제0314323호의 경우는, 식물병해 방제 효과가 있는 균주로서 토양으로부터 길항미생물인 바실러스 속(Bacillus sp.) GB-0365(수탁번호: KFCC-11071)와 바실러스 속(Bacillus sp.) GB-017(수탁번호 : KFCC-11070)을 분리 제공하고, 또한 곰팡이에 의한 작물의 병해, 이를테면 잿빛곰팡이병, 잘록병, 입고병, 시들음병 및 브라운 패취, 라지패취 등의 주요 원인 미생물들에 대해 생육저지 효과와 과채류 수확후 선도유지 효과를 갖는 상기 균주를 함유한 미생물제제였으며, 이 경우 미생물제제 내에 포함되어 있는 배양액 중에 생성된 활성성분이 1차로 작용하여 곰팡이의 생육을 억제하고, 2차로 미생물제제 내의 생균이 적용현장에서 서식하면서 활성성분을 생산하여 곰팡이의 생육을 원천적으로 억제하므로 각종 작물의 병해 발병률을 감소시킬 수 있게 할 수 있다고 하였다.

특허출원 제2000-3114호에서는 바실러스균과 다른 종을 혼합하여 본 발명과 유사한 효과가 나타나게 한 경우로서, 여기에서는 트리코더마 속 미생물을 포함하여 적어도 2종 이상의 곰팡이 또는 바실러스 속 미생물을 포함하여 적어도 2종이상의 세균 또는 상기 곰팡이류와 세균류를 모두 포함하는 혼합미생물을 활성성분으로 하는 식물 병원균 방제용 무독성 생물농약에 관한 것으로 균주를 배양한 균체와 배양여액을 희석해 골프장 잔디나 농작물에 살포하거나 활성탄과 같은 미생물고정 담체에 고정하여 살포하였을 때 뛰어난 식물 병원균 방제효과를 보이는 생물농약으로서 특허출원한 경우였고, 특허 제0319135호와 특허 제0294023호의 경우는 식물 병해에 길항성을 지니는 미생물을 분리하고, 이를 제제화 시킨 식물 병해에 길항성을 지니는 미생물 제제 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 자연에서 분리된 식물 병해에 길항성을 지니는 바실러스속중 Bacillus subtilis를 사용하는 배지에서 성장 발육시키고, 희석배율 약100∼1,000배 정도로 희석시켜 제조된 식물병해 길항성을 지니는 미생물 제제에 관한 것이었다.

그리고 적용부분의 경우에서는 곰팡이성 질병중 잿빛곰팡이병, 잘록병, 입고병, 시들음병 및 브라운 패취, 라지패취 등의 주요 원인 미생물들에 대해 생육저지효과와 과채류 수확 후 선도유지 효과를 갖는 상기 균주를 함유한 미생물제제를 제공한다. 여기에서는 미생물제제를 사용하면 미생물제제 내에 포함되어 있는 배양액중에 생성된 활성성분이 1차로 작용하여 곰팡이의 생육을 억제하고, 2차로 미생물제제 내의 생균이 적용현장에서 서식하면서 활성성분을 생산하여 곰팡이의 생육을 원천적으로 억제하므로 각종 작물의 병해 발병률을 감소시킬 수 있게 된다.

특허 제0252198호에서는 신규한 세균 Bacillus sp. BS555(KCTC 8821P) 균주를 제공한다. 이 균주는 소금에 대한 내성범위가 넓고 광범위한 곰팡이에 대한 생육 억제능을 가지고 있다. 또 이 생육억제능은 열과 단백질 분해효소에 의하여 저항력이 있는 저분자량의 생합성 물질로 추정되는 물질을 이용하여 병해충을 억제시켰다.

그 외의 특허출원, 특허공개 및 획득된 사례로서, 특허 제0314323호 Bacillus sp. GB-0365(수탁번호 : KFCC-11071)와 Bacillus sp. GB-017(수탁번호: KFCC-11070)], 특허출원 제2000-41858호의 경우 Bacillus sp. 균주로서 프로테아제와 아밀라아제 분해력이 있는 Bacillus cereus WRD-1(KCTC 18090P) 균주를 분리·동정사용 하였으며, 특허출원 제2000-3114호에서는 트리코더마 속 미생물을 포함하여 적어도 2종 이상의 곰팡이 또는 바실러스속 미생물을 포함하여 적어도 2종이상의 세균 또는 상기 곰팡이류와 세균류를 모두 포함하는 혼합미생물의 활성성분을 이용하였고, 특허 제0319135호에서는 바실러스속 미생물 바실러스 서브틸리스 CP220(Bacillus subtilis CP220 : 기탁번호 KCTC-8831P호), 그리고, 특허 제0294023호의 경우는 Bacillus subtilis GB-0365 (수탁번호: KFCC - 11071)와 Bacillus sp. GB-017(수탁번호: KFCC - 11070)을 분리하여 잿빛곰팡이병, 잘록병, 입고병, 시들음병 및 브라운 패취, 라지패취 등의 주요 원인 미생물들에 대해 생육저지 효과와 과채류 수확후 선도유지 효과를 갖는 상기 균주를 함유한 미생물제제를 사용하여 미생물제제 내에 포함되어 있는 배양액 중에 생성된 활성성분이 1차로 작용하여 곰팡이의 생육을 억제하고, 2차로 미생물제제 내의 생균이 적용현장에서 서식하면서 활성성분을 생산하여 곰팡이의 생육을 원천적으로 억제하므로 각종 작물의 병해 발병률을 감소시킬 수 있게 되었다고 하였다.

특허출원 제2000-41858호의 경우에서는 바실러스 속(Bacillus sp.)을 이용하여 이들이 배출하는 프로테아제와 아밀라아제의 분해력이 있는 바실러스 세레우스 WRD-1(Bacillus cereus WRD-1) (KCTC 18030P) 균주를 분리·동정하였으며, 균주의 배양액은 항진균활성을 나타내 토양 내 잠재되어 있는 식물병원균의 억제능이 있고 식물의 생육을 촉진하는 뛰어난 효과가 있다고 하였다.

본 발명에서 청구할 예정인 항목과 유사한 역병의 경우는, 고추에 적용된 사례가 있는데, 특허 제 0049807호에서 생물농약인 고추 역병 방제용 길항 미생물 및 이 길항 미생물을 이용한 고추 역병 방제 방법에 관한 것으로서, 이는 현재 고추 역병의 방제가 지금까지 주로 농약 사용에 의존하고 있으나 역병과 같이 토양전염성인 경우는 큰 효과가 없고 약해가 우려되는 등의 문제점이 있고, 또한 미생물 농약제제는 지금까지 알려진 바가 없어 이를 대체하기 위하여 전국의 토양으로 부터 고추 역병 방제용 길항 미생물인 바실러스속 스트레인 AC-1 (Bacillus Strain AC-1,KCTC 8330P)을 분리하였고 이를 이용하여 고추 역병균에 감염된 고추작물의 살균에 유효량을 처리함으로써 고추 역병을 방제할 수 있음을 발표하였다.

결론적으로, 미생물중 바실러스속 (Bacillus sp.)AC-1균을 이용하여, 곰팡이에 대한 생장 저해능은 단백질 분해효소에 의하여 저항력이 있는 저분자량의 생합성 물질로 추정되는 물질을 이용하여 병해충을 억제시키는 것으로 이와 유사한 특허는 다종 발표되어 있다.

이는 위와 같이 병원성 곰팡이에 대하여 길항력을 갖는 바실러스(Bacillus)속이라고 하더라도 균마다 유전자의 조절 특성이 다름에 따라, 얼마든지 효과는 다르게 나을 수 있음을 설명하는 것이라고 할 수 있다.

본원 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 바실러스속 CMB26균 및/또는 리포펩티드를 유효성분으로 함유하는 식물곰팡이균의 살균제를 제공하고, 화성비료에서 나타날 수 있는 토양잔류와 축적, 먹이사슬에 의한 가축과 인체에 이행, 합성농약의 과다사용으로 인한 생태계 파괴를 막을 수 있는 농약을 제공하는데 그 목적이 있다.

본원 발명에서는 발명이 이루고자 하는 기술적 과제를 해결하기 위하여,

삭제

청구항 4에서와 같은 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 고체분리 물 또는 액상배양액, 또는 상기 균주로부터 생성된 합성분비물인 리포펩티드, 또는 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 및 이로부터 생성되어 합성분비된 리포펩티드를 이용하여 식물곰팡이균의 병해 예방 또는 살균하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제를 제공하며,

제 4 항에서와 같이, 과수, 농원예작물, 화훼 등의 작물에 기생하여 피해를 발생시키는 곰팡이균 중 흰가루병, 만고병, 겹무늬 썩음병, 시들음병, 탄저병, 잿빛, 역병 또는 문고병 등의 병해 예방 또는 살균하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제를 제공하며,

제 4항 또는 제5항에 있어서, 작물기생 곰팡이의 병해 예방 및 살균시키기 위해서 상기 살균제를 원액 내지 2,000배 희석하여 엽면살포, 관주 또는 엽 면살포와 관주를 병행처리하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제를 제공한다.

〈 발명의 바람직한 실시태양 〉

본 발명은 농업현장에서 주용 경제적 작물에 질병을 일으켜 농가소득에 막대한 피해를 일으키는 곰팡이성 질병인 흰가루병, 역병, 탄저병등에 탁월한 효과가 있으며, 이들 곰팡이균 및 해충의 생존간 주요한 포자, 균사체 및 막을 용해시켜 사멸 시키는 물질인 항균성 리포펩티드를 생산하는 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균, 및 상기 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균으로부터 최적조건하에서 리포펩티드를 제조하는 방법, 및 상기 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균과 항균성 물질인 리포펩티드를 이용하여 작물에 감염된 곰팡이균을 살균시키는 효과를 나타내는 미생물 농약에 관한 것이다.

작물 병원성 곰팡이는 균사체와 포자에 의하여 번식을 하고, 이는 현장 감염속도와 피해로 연결되며, 이들의 생육조건으로 온도, 수분 및 영양원이 중요한 요인으로 작용한다. 곰팡이 번식간 균사체와 포자중 피해를 일으키는 것은 대부분이 포자와 관련되어 있으므로, 이들의 세포벽을 파괴하는 것이 중요하다. 이들 포자와 균사체의 세포벽은 글루칸(Glucan), 만난(Mannan), 키틴(Chitin), 단백질 등으로 이루어져 있고, 이들을 용해할 수 있는 균은 많이 존재하고 있으며, 대표적인 것이 바실러스(Bacillus)속이다. 그러나, 이러한 기작은 키티나제(chitinase), 글루카나제 (glucanase), 키토사나제 (chitosanase)와 같은 효소나 아함노리피드(ahamnollipids), 트레할로이드 (trehaloids), 소프로리피드(sophorolipids)와 글리코리피드 (glycolipids) 또는 리포펩티드 (lipopeptide)나 지질단백질(lipoproteins) 또는 지방산, 인지질, 중성지질 또는 생물학적 계면활성제(biosurfantants)의 종류에 따라서 각기 다르므로 무엇보다 다양한 물질을 생산하는 미생물의 선발이 중요하다.

이들은 배양조건과 오염정도 그리고 생존률 등에 따라 효과가 다르게 나타나기 때문에 오염억제와 생존률등을 증가시켜 농약으로서의 효과를 증가시키는 방법의 해결을 위해서 본 발명에서는 이의 해결에 접근하기 위한 결과는 다음과 같다.

본 발명은 흰가루병, 역병, 탄저균 및 해충의 포자와 균사체의 구성요소인 세포벽과 세포막(membrane)의 파괴능력이 우수한 균주를 찾아내고, 이 균주를 이용하여 세포벽을 용해시킬 수 있는 최적 사용조건을 찾는데 성공하였다. 국내의 여러지역에서 채취한 토양 샘플중 우선 곰팡이성균에 효과가 있다고 판정되는 균을 다수 탐색하여 선정한 후, 현장 실험을 실시하여, 이중 최우량의 균 1종을 선정하였다.

그리고, 이차적으로 생산 현장에서 고질적이며 난방제성인 곰팡이균을 대상으로 용해 활성도를 측정하여 용해 활성도가 가장 큰 균주를 선정하였다. 본 발명과 관련한 균주의 형태학적과 유전학적 특성을 상술하면 다음과 같다. 본 발명의 균주를 현미경상에서 관찰 한 바, 형태는 간균의 형태와 꼬리를 보유하고 있어 운동성을 나타내고 있었으며, 연쇄의 형태는 보유하지 않은 단일개체의 형태를 보유하고 있었다(도 1).

그리고, 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB26균의 16S rRNA유전자 분석결과, 첫 번째 염기부터 320번 염기까지 염기서열로 Bacillus subtilis와 99.6%의 상동성을 갖고 있었으며, 321부터 1501번까지 염기서열은 B. thuringienesis 99.7%의 상동성을 보이고 있었며, 전체염기서열의 상동성은 B. subtilis와는 95.6%, B. cereus group과는 96.7%의 상동성을 보이는등 지금까지 어떠한 Bacillus sp.의 균주에도 속하지 않는 신규한 균주로 판명되었다(도 2, GeneBank, 도 3, 도4, 비교표 3, 4). 그리고, 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균을 배양할 때, 합성 분비되는 곰팡이 포자 및 균사체를 파괴시키는 물질인 lipopeptise의 항미생물성 HPL 스펙트럼(도 5)과 NMR분석결과를 도 6에 나타내었다.

따라서, 자연에서 분리된 식물 병해에 길항성을 지니는 바실러스속중에서 상기와 같은 특성을 갖는 신종( NCBI 신종등록번호 : AY048851)으로 확인된 미생물을 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균으로 명명하였으며, 2001년 11월 29에 한국미생물보존센터에 기탁하여 기탁번호 KFCC-11289호를 부여받았다.

본 발명은 원예작물 재배 시 상이한 race들이나 농업현장에서 농약등에 내성을 보유함으로서 치료가 불가능하다고 인정되고 있는 곰팡이성병 원균을 대상으로 치료에 특효가 있는 신종으로 분리되고 동정된 토양미생물을 이용하여 농업생산현장에 적용이 가능한 미생물농약에 대한 것이다. 즉, 원예작물의 재배 시 작물의 지상부에 기생하며 피해를 일으키는 곰팡이균에 대한 미생물 농약 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 식물병해충 길항성을 지니는 미생물농약을 이용하여 발병률을 감소 시킬 수 있는 곰팡이균으로는 흰가루병, 만고병, 겹무늬 색음병, 시들음병, 탄저병, 잿빛곰팡이병, 역병, 문고병이 있고 이는 엽면살포 및 관주를 동시에 처리하여, 작물의 병해 발생률을 감소 시킬 수 있게 된다.

이를 위하여, 자연에서 분리된 식물 병해에 길항성을 지니는 상기 미생물 바실러스 균(Bacillus sp. CMB26 : 기탁번호 KFCC-11289호)을 배지에서 성장 발육시키고, 희석배율 약 100∼1,000배 정도로 희석시켜 제조된 식물 병해 길항성을 지니는 미생물 농약으로의 이용에 관한 것이다.

하기 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 이는 본원발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

신규한 바실러스속 ( Bacillus sp. ) CMB26균의 역병균에 대한 실험실적항곰팡이 효과검정

토양내 존재하는 토양미생물을 분리하기 위하여 표층에서 5∼10cm범위에서 토양을 채취한 후 LB 아가 플레이트를 사용하여 단일 콜로니 분리과정을 일반적인 방법으로 수차례 반복 실시하여 120종을 분리하였다. 즉, 전라남도일대에서 수집한 토양중에서 150여종의 미생물을 LB 아가 플레이트(효모 추출물 0.5%, 트립토판 1%, NaCl 1%)에서 분리한 후 분리된 미생물중 항곰팡이능을 갖는 균주중 1종을 선별하고 이를 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균으로 명명하였다. 그리고 우선 표준 곰팡이로 고추 역병의 원인균인 Collectotrichum glieosporioides을 이용 하여 항곰팡이성 효과를 확인하였다. 그리고, 식물 병원균에 대한 길항력 시험은 paper disk 법을 이용하였다(도 5).

억제율(Inhibition rate)은 100 - (대치길이/초기길이 ×100)으로 계산하였다.

[실시예 2]

신규한 바실러스속( Bacillus sp. ) CMB26균의 현장 감염 흰가루병에 대한 항곰팡이 효과검정

작물 활물기생 곰팡이균인 흰가루병에 탁월한 길항력을 가진 균주를 선별하기 위하여 전남대학교 농과대학 실험 온실과 담양 및 장성의 현지농가에서 실험을 수행하였다.

실시예중 흰가루병은 자연발생 하였으며, 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 준비를 위하여 LB 배지에 배양한 후 처리 후 그 흰가루병의 발병 진행 상태를 발병도수치로 환산하여 확인하였다(도 5∼도 6, 표 1).

실시방법으로는 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 준비는 M9선택배지에서 최종 균수가 1x108cfu/ml로 증가하도록 24시간 배양한 후 이를 엽면살포처리방법으로 효과를 검정하였으며, 엽면살포는 100∼1,000배를 범위로 희석하여 1회 처리 하였고, 5일이 경과 시, 물만을 뿌린 대조구와 비교하여 흰가루병의 발병 진행을 확인하였다(도 5 ∼ 도 6).

흰가루병의 발병도는 가장 심한상태를 4로 하여 1엽부터 10엽까지의 평균값으로 확인하였다. 처리구로서는 엽면살포만을 실시한 처리구와 시중 판매되고 있는 흰가루병 치료용 농약을 비교구로하여 치료효과를 검정하였다. 결과적으로 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균용액을 100∼1,000배로 희석하여 엽면살포시 처리전 발병지수 4가 0으로 저하되어, 대조구와 비교구 및 엽면살포처리구와 비교 시, 오이에 대한 흰가루병 치료효과는 탁월한 것으로 확인되었다(표 1).

〈표 1〉

오이에 감염된 흰가루 곰팡이균에 대하여 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 배양액을 100배∼1,000배 범위로 희석하여 엽면살포 후 5일경과시의 항곰팡이효과

[실시예 3]

신규한 바실러스속( Bacillus sp. ) CMB26균의 고추역병에 대한 치료효과검정

본 발명에서는 노지에서 고추재배중에 발생한 역병감염 고추묘(전남 영광, 고흥)에 대하여, 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 치료효과를 재배현장에서 엽면살포 및 관주를 통하여 검정하였다(도 8 ∼도 12).

실시예중 고추역병은 자연발생하였으며, 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균의 준비는 M9선택배지에서 24시간 배양후 균수가 1x108cfu/ml로 증가하도록 24시간 배양한 후 이를 엽면 살포 혹은 관주로 처리하여 효과를 검정하였으며, 100배에서 1,000배를 범위로 희석하여 엽면살포방법으로 1회 처리하였고, 관주는 200배로 희석하여 처리 후, 5일이 경과 시, 처리하지 않은 대조구와 비교하여 결과를 도출하였다.

처리구로서는 엽면살포만을 실시한 엽면살포처리구, 관주만을 처리한 관주처리구, 그리고, 엽면살포와 관주를 동시에 처리한 병행처리구로 구분 실시하였다.

그리고, 최초 처리시의 발병율은 25%(1 기준)범위를 나타냈다.

결과적으로, 대조구에 비하여 관주와 엽면살포를 병행한 처리구가 역병발병율 수치가 가장 높게 감소 하였고, 다음으로는 엽면살포, 관주처리순이였다. 그리고 최종 5일이 경과 시, 대조구의 발병수치는 처리전 1에서 3.1배로 증가한 반면에, 전체처리구는 1일부터 급격히 발병율은 급격히 감소하여 5일이 경과시 관주처리구는 0.3, 엽면살포구와 관주와 엽면병행 처리구의 경우는 0.08로 감소되어 대조구에 비하여 39배의 감소효과를 나타내었다(도 10).

또한, 엽면살포처리구의 경우 처리후 5일이 경과 시 파괴조사를 실시하여, 초장(cm), 경경(mm), 근중(g), 경경(mm), 착과수(ea), 과중(g)을 조사하였다. 그 결과 대조구(1 기준)와 비교시, 엽면살포경우는 1.2배, 관주처리의 경우는 1.1배, 관주와 엽면 처리시의 경우는 1.1배로 초장은 생장이 이루어지고 있었으며, 경경의 두께 역시 1.4∼1.2배, 뿌리무게의 경우는 최대 3.1배에서 최저 2.8배 그리고 줄기의 무게는 최대 7.6배에서 최저 6.6배로 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 용액을 처리 후 치료 효과가 나타남에 따라 큰 차이를 나타냈다. 그리고, 고추수와 무게를 비교하여 보았더니, 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균을 처리하지 않은 대조구에 비하여 수확량은 최대 20.5배에서 최저 13.5배의 과실수 증대와 수확 후 계측한 고추 무게의 경우 최대 76배에서 최저 53.3배의 수확량 증가를 나타냄으로서 치료가 됨에 따라 전체적으로 높은 수치의 증가가 있었다(도 9∼도 12).

그리고 처리구별 이러한 생장특성의 차이는 전반적으로 엽면살포, 관주와 엽면살포병행처리구, 그리고 관주처리구 및 대조구순이였으며, 과실수량에 관련하여서는 엽면살포 병행처리구, 엽면살포, 관주처리구와 대조구 순이였다.

[실시예 4]

신규한 바실러스속( Bacillus sp. ) CMB26균의 고추탄저병에 대한 치료효과검정

본 발명에서는 노지에서 고추재배중 발생한 탄저병감염 고추묘(전남 영광, 백수, 2001. 8.)에 대하여, 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 치료효과는 엽면살포법을 통하여 검정하였으며, 치료후 파괴조사를 실시하여 기관별 생장 및 수확량 조사를 병행하여 조사하였다(도 7, 도 13 ∼ 도 14).

실시예중 고추탄저병은 자연발생하였으며, 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 준비는 M9선택배지에서 24시간 배양 후 균수가 1x108cfu/ml로 증가하도록 24시간 배양한 후 이를 엽면살포법으로만 처리하여 효과를 검정하였으며, 엽면살포는 100배에서 1,000배 범위로 희석하여 1회 처리하였고, 살포 후 5일이 경과 시, 처리하지 않은 대조구와 비교하여 결과를 도출하였다.

처리구로서는 엽면살포만을 실시한 처리구로만으로 실시하였다. 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 용액을 처리 후 5일이 경과 시 파괴조사를 실시하여 병원성 곰팡이균의 치료에 따른 생장과 수확량을 조사하여 보았다(도 7).

결과로서, 엽면살포처리 후 5일에 파괴조사를 실시하여 초장(cm), 경경(mm), 근중(g), 경경(mm), 착과수(ea), 과중(g)을 조사하였다. 그 결과로서 초장의 경우 대조구(1기준)은 95cm, 경경의 두께는 13,5cm, 뿌리의 무게의 경우는 20g, 과실수의 경우는 12개였으며, 과중의 무게는 130g이였는데 반하여 엽면살포처리구의 경우는 초장은 1.2배, 경경 1.1배, 근중의 경우 1.3배였으며, 경경의 무게는 1.4배로 증가하였으며, 과실수 는 1.3배와 과중의 무게는 1.2배로 전체가 증가하였다(도 13∼도 14).

[실시예 5]

신규한 바실러스속( Bacillus sp. ) CMB26균의 다종 곰팡이균에 대한 길항성 조사결과

신규한 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26이 다른 곰팡이균에 대하여 추가적인 길항력 측정을 실험실에서 실시하였다(표 2). 이를 위하여 공시시험균으로서 토마토 역병(Phytophthora infestans), 사과 겹무늬썩음병(부패병)(Botmyosphaeria dothidea), 오이 잿빛 곰팡이병(Botrytis cinerea), 오이시들음병(Fusarium oxysporum), 수박 만고병(덩굴마름병)(Mycosphaerella melonis), 고추 탄저병(Collectotrichum gloeosporioides)과 벼 문고병(Rhizoctonia solani)을 사용하였다. 그러나, 흰가루병의 경우는 활물기생으로 실험실 조건에서 배양이 곤란함으로 인하여 현장감염된 작물에 대하여 길항성 효과실험을 실시하였다. 결과로서 길항성 검정 결과 모든 병원성 곰팡이에 대한 길항력이 관찰 되었다(표 2, 도 5). 이를 위하여, 식물 병원균에 대한 길항력 테스트는 paper disk법을 이용하였으며, 결과는 억제율로 표현하였고, clear zone 형성이 가장 뚜렷한 경우는 c를 덧붙혀 표현하였으며, 항곰팡이 효과가 아주 좋은 경우는 ++++, 중간일때는 +++, 보통일때는 ++ 그리고 효과가 약간 있는 경우는 +로 표기하였다.

억제율(Inhibition rate)은 100 - (대치길이/초기길이 × 100)으로 계산하였다.

〈표2〉

신규한 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균의 식물감염균 종류별로 처리시 길항성효과 확인

[실시예 6]

신규한 바실러스속 ( Bacillus sp. ) CMB26균의 배양을 위한 선택배지 선정

바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균만을 대상으로 최소 배지에서의 생육을 확인하기 위하여 분리된 균 stock을 루리아 배양액(Luria Broth(LB))에 접종하여 37℃에서 12시간 배양한 후 최소배지(M9 agar plate)와 최소 배지에 여러 가지 물질을 첨가하여 활성화된 각각의 균을 스트리킹하여 37℃에서 하룻동안 배양한 후 그들의 생육정도를 확인하였다. 그 결과로 본 발명의 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균은 M9배지에서 생육조건이 최적의 조건을 나타내어 신규균은 M9 및 LB 배지에서 배양시 최적 조건임을 확인하였다(표 3).

〈표 3〉

[실시예 7]

바실러스속( Bacillus sp. ) CMB26균의 형태적 관찰

순수 분리한 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26 균을 LB 배지에 배양하여, SAM(Scanning Electron Microscope ; JSM 5410LV)을 이용하여 형태를 관찰하였다. 관찰 결과 bacllli form을 확인 할 수 있었으며, 또한 여러개의 편모가 존재하는 것을 TEM(Transmission Electron Microscope)으로 확인 할 수 있었다(도 1).

[실시예 8]

바실러스속( Bacillus sp. ) CMB26균의 유전자 16s rRNA 염기서열분석

신규한 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균의 유전적 분석을 실시하고, 이를 동정하기 위하여 16s rRNA의 전체 염기서열 분석을 통하여 동정을 수행 하고자 하였다. 게놈 DNA 추출은 페놀 추출법을 이용하였다. 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 4쌍의 프라이머를 가지고(표 4), PCR을 수행(94℃ 10분 →(94℃ 30초 →59℃ 30초→72℃ 30초 : 30cycle) →72℃ 7분 →4℃ )한 후, 전기영동을 통하여 증폭된 DNA를 확인한 후 T-easy 벡터에 결찰 (ligation)(Promega co.)한 후 대장균에 도입하여 증식시킨 후, 플라스미드를 추출하고 전기영동을 통하여 원하는 밴드를 확인한 후 염기서열을 분석하였다. 또한, BIOLOG system에 의한 동정을 다음과 같이 실시하였다. 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB26균을 혈액 아가 플레이트(blood agar plate)에서 3번 계대 배양 후 증식된 콜로니들을 항온배양액(BIOLOG co.)에 현탁하여, 동정용 플레이트인 GP(BIOLOG co.)에 200㎕씩 분주하여 37℃ 배양기에서 12시간 배양후 그 결과를 확인하였다. 염기서열의 상동성 분석 결과 Bacillus cereus와는 99.7%, B. thuringiensis와는 99.7%, B. anthracis와는 97.5%의 유사도를 확인할 수 있었고 이 결과를 NCBI의 GenBank에 등록하여 최종 등록번호 AY048851을 획득하였다(도 2).

〈표 4〉

본 발명에서 신종균임을 증명하기 위하여 사용된 4쌍의 프라이머

[실시예 9]

항곰팡이성 물질인 리포펩티드의 물성 분석과 효과 확인

실시예 9-1

리포펩티드 유도물질 구명결과

아미노산이 리포펩티드의 생산을 위한 운도 물질 탐색을 위하여 본 발명에서는 20개의 아미노산 중 19개의 아미노산을 M9 염+글루코스(0.4%)에 첨가(최종 농도 20㎍/㎖) 후 멸균하여 종배양액을 20㎕ 접종하여 37℃에서 진탕하면서 72시간 배양하여 각각의 배양액을 6,000rpm으로 20분간 원심분리 후 pore size 0.45㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과한 후 PDA에 각각의 배양액이 10%가 되게 첨가하여 플레이팅하여 C.gloeosporioides를 이식한 후 28℃에서 곰팡이의 생장환의 크기를 측정하여 항곰팡이능을 확인하였다( 도 15 ∼ 도 19)

결과로서, 20가지의 아미노산중에 페닐알라닌을 첨가해준 실험구에서 다른 실험구에서보다 항곰팡이능이 뛰어남을 관찰할 수 있었으며(표 5), 항곰팡이성 물질인 리포펩티드d가 생성됨에 있어 리포펩티드 생산이 페닐알라닌에 의해 촉진됨을 확인하였다.

또한 리포펩티드의 생산량이 최대가 되는 페닐알라닌의 적정 농도를 확인하고자 하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, M9 기본배지에 탄소원으로 글루코스를 기본으로 하여 페닐알라닌을 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 15㎍/㎖, 20㎍/㎖, 30㎍/㎖를 각각 정량 첨가하여 5일동안 37℃에서 배양한 후 일련의 과정을 통하여 리포펩티드를 정제한 후 TLC를 통하여 리포펩티드의 농도를 확인 하였다. 실험결과 페닐알라닌을 30㎍/㎖ 첨가해주었을 때 생산되는 리포펩티드의 양이 최대가 됨을 확인하였다(도 9).

〈표 5〉

신규한 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균 배양액에 첨가한 아미노산의 종류별, 첨가량별 항곰팡이성을 나타내는 리포펩티드의 생성검정 효과(공시균 : 역병균 C. gloeosporioides)

실시예 9-2

리포펩티드 특성 규명

[리포멥티드의 순수 분리]

본 발명에서는 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균이 생산하는 리포펩티드를 순수 분리하기 위하여 먼저 LB 배지를 이용하여 37℃에서 하룻밤 배양한 종배양액을 변형된(modified) M9 배양액에 1/1000 접종하여 37℃에서 5일간 배양하였다. 배양 후 원심분리기를 이용하여 세포를 제거한 후 남은 상등액을 가지고 다음 실험을 수행하였다. 먼저 여러 가지 유기용매를 이용하여 용매추출법에 의한 추출을 시도하였다(도 15). 또한 HCI을 이용하여 산 침전법(acid precipitation)을 이용하여 리포펩티드를 순수 분리하고자 하였다. 상기 실험 결과에 의해서 리포펩티드의 순수 분리는 산 침전법이 가장 효율적임을 확인할 수 있었다. 이렇게 얻어진 추출물을 TLC 및 HPLC를 통하여 리포펩티드를 순수 분리 정제 하였으며, 분리한 리포펩티드를 확인하기 위하여 박막 크로마토그래피 (Thin layer Chromatography(TLC))분석을 실시하였다. 즉, 실리카겔 60 F254 플레이트(Merck)에 반응시료를 5㎍씩 흡수시킨후 클로로포름:MeOH:H20 = 65:25:2을 전개용매로 하여 TLC를 수행한 후 30% H2SO4 용액을 이용하여 생성물을 발색시켰다. 그리고, 신규한 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균 배양액을 산 침전법을 통하여 얻은 crude 상태의 리포펩티드를 MeOH에 녹여 pore size 0.22㎛ 필터를 이용하여 여과한 후 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography(HPLC))에 주입하여 리포펩티드를 분리하였다. 분석을 위한 HPLC 조건은 표 6과 같다. 예비 검정에 의해서 리포펩티드의 순수 분리는 산 침전법이 가장 효율적임을 확인할 수 있었다. 이렇게 얻어진 추출물을 TLC 및 HPLC를 통하여 리포펩티드를 순수 분리 정제 하였다(도 17∼도 18).

＜표 6＞

1. 장치

· System : SHIMADZU Model( LC10 )

· Pump A : LC-8A

· Pump B : LC-8A

· Detector : SPD-10A

2. 조건

· Column: Shim-pack PREP-ODS C₁₈ (20㎜ID ×25cm L, 15㎛ particle diameter)

· Moble phase : Acetonitrile gradient

· Flow rate : 10㎖/min

· Injection volumn : 4㎖

항곰팡이성 리포펩티드 분석을 위한 HPLC 조건

[항균성 검색]

본 발명에서는 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 배양시 생성되는 리포펩티드의 조추출물(crude extract)를 이용하여 그 자체의 항곰팡이성의 이용 가능성을 확인하기 위하여, 배양액을 TLC에 올려본 결과 5개의 밴드를 관찰하였다. 각각의 밴드를 긁어 다시 농축하여 항곰팡이능을 측정해본 결과 2번째 밴드에서 활성이 관찰 되었다(도 20와 도 21).

또한, HPLC 결과 broad한 peak 패턴을 확인할 수 있었다. 그래서 본 발명에서는 HFLC에서 2'30" 부터 25'30"까지 30초 간격으로 분획을 받아 농축한 후 곰팡이에 대한 항균력(test균 : C. gloeosporioides 외 8종)을 확인한 결과, 아세토니트릴의 농도가 75%일 때 용출됨을 확인할수 있었다(도 12-13). 이를 위하여, 신규한 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균 배양액을 산 침전법을 통하여 얻은 crude 상태의 리포펩티드를 HPLC를 통해서 순수 분리한 후 농축하여 paper disk method을 이용하여 여러 식물 병원균에 대한 항곰팡이 효과를 검증하였다. 검증을 위한 병원균으로는 Botmyosphaeria dothidea, Mycosphaerella melonis, C. goloeosporioides, Fusarium oxysporum, KACC 40802 C. coccodes, KACC 40014 C.dematium, KACC 40689 C.gloeosporioides, KACC 40700 C. acutatum을 사용하였다. 또한, 계속해서 20분, 23분, 25분, 26분, 28분 그리고 30분 분획을 받은 후 농축하여 TLC로 순도를 확인한 결과 TLC 2번째 밴드와 HPLC 분획 No. 28번은 동일한 물질임을 확인할 수 있었고, HPLC를 이용하여 분획을 받은 후 농축하여 역시 도 12와 13의 구조 분석을 수행하였으며, 그리고 항곰팡이 효과를 검정하였더니 조배양액과 유사하게 항곰팡이 효과가 나타나 20분-30분 까지의 분획 범위에서 항곰팡이 효과를 나타내는 주요한 범위임을 알 수 있었다(도 20 ∼ 도 21).

[부분 필티드 서열 분석]

본 발명에서 순수 분리된 리포펩티드의 구조를 분석하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 먼저 순수 분리된 리포펩티드를 6N HCl로 처리한 다음 n-헥산으로 추출하여 농축시킨 다음 TLC를 전개시켜 지질의 분리를 확인하였다. 이렇게 지질 사슬이 떨어져 나간 펩티드의 아미노산 조성을 확인하기 위하여 HCl을 가하여 120℃에서 하룻밤 반응시켜 펩티드를 완전히 가수분해 시킨후 HPLC를 이용하여 아미노산 조성을 확인하였고, 또한 리포펩티드의 분자량을 확인하기 위하여 MALDI-TOF를 이용하여 MS-scan을 수행하였고, 또한 이의 구조를 확인하기 위하여 NMR을 통해 분석하였다. 결과로서 몇 개의 아미노산(글루타민, 글루탐산, 아르기닌등)이 존재한다는 것을 알 수 있었다. 이를 추가적으로 확인하기 위하여 MALDI-TOF스펙트럼 분석을 실시하였으며, MALDI-TOF 분석 결과 하나의 리포펩티드가 아닌 두개의 리포펩티드가 존재함을 확인할 수 있었다(도 4). 각각의 분자량은 1081Da와 1463Da로 확인되었고, 각각의 항곰팡이 활성이 강함을 확인하였다.

[실시예 10]

리포펩티드생성을 위한 발효 최적 조건 확립

본 발명에서는 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 배양시 항곰팡이성 효과를 나타내는 리포펩티드의 생성에 미치는 양적인 증가를 위하여 탄소원의 첨가량별, 온도 및 pH, 질소원의 첨가량을 조절하여 이의 최적 조건을 확립하였다.

실시예 10-1

탄소원의 종류별 바실러스속 ( Bacillus sp. ) CMB26균의 활성에 미치는 영향

신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 최적 발효 조건을 확립하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다(표 7).

즉, M9최소배지를 기본으로 하여 단일 탄소원(소비톨, 말토스, 글리신, 수크로스, 글루코스)을 일정량(0.4%) 배지에 첨가한 후 미생물의 생육 정도를 탁도(OD600)로 확인하였다. 검정간 질소원은 NH4Cl을 이용하였다. 실험결과, 리포펩티드 생성을 위한 미생물의 활성유발에는 소비톨, 말토스, 글리신, 수크로스보다 글루코스를 탄소원으로 더 잘 이용하는 것으로 확인되었다.

＜표 7＞

탄소원을 달리하여 첨가시 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균의 생육활성에 미치는 영향

실시예 10-2

온도, pH의 종류별 바실러스속( Bacillus sp. ) CMB26균의 활성에 미치는 영향

위의 [실시예 10-1]결과를 기준으로 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB 26균의 발효에 최적인 탄소원은 글루코스임이 확인되었다(표 8).

이 결과를 근거로 M9 salt에 글루코스를 0.4%되게 첨가한 후 각각 28℃와 37℃에서 배양(120rpm)시켜 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균의 생장을 확인한 결과, 37℃에서 배양한 것의 생육이 28℃에서 배양한 것보다 뛰어남을 확인하였다. 5일동안 37℃에서 배양하는동안 pH 변화를 관찰하였다. PH는 6.8에서 7.0정도로 거의 변화가 없음이 관찰되었다.

＜표 8＞

탄소원을 달리한 경우에서, 온도별 조건에 따른 바실러스속(Bacillus sp.)CMB26균의 생육에 미치는 영향 조사

실시예 10-3

질소원을 달리한 경우에서의 바실러스속 ( Bacillus sp. ) CMB26균의 생장력검정

본 발명에서는 질소원이 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균의 생육조건에 미치는 최적 발효 조건을 확립하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다(도 22). 첫 번째로, M9 최소배지를 기본으로 하여 우선 탄소원의 일정량을 동일하게 첨가한 후 단일 질소원(소이톤, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물)을 일정량(0.2%) 배지에 첨가한 후 미생물의 생육 정도를 확인하였다. 그리고 앞의 첫 번째 실험조건의 질소원에서는 생산되는 리포펩티드의 양이 많지 않음이 확인되어 M9최소배지를 기본으로하여 질소원(우레아, KNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNH4HPO4)을 일정량(0.1%)배지에 첨가한 후 미생물의 생육 정도를 확인하였다. 전체실험에서 탄소원은 글루코스(0.4%)를 이용하였다. 그 결과로서, 실시예 10-1 및 10-2를 통하여 확인된 최적온도와 PH, 그리고 탄소원을 기본으로 M9 salt를 이용하여 단일 질소원(우레아, KNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNH4HPO4)을 일정량(0.1%) 배지에 첨가한 후 미생물의 생육 정도를 확인한 결과 소듐 암모늄 포스페이트가 다른 질소원보다 생육이 더 활발한 것을 확인할 수 있었다. 그리고 질소원별 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB 26에 의해 생산되는 리포펩티드의 양의 검정을 실시하였다. 이를 위하여 질소원을 첨가한 후 배양한 균액을 100㎖씩을 취해 일련의 과정을 거쳐 리포펩티드를 추출한 후 TLC를 이용하여 생산되는 리포펩티드의 양을 확인하였다(도 22). 실험결과 소듐 암모늄 히드로겐 포스페이트를 질소원으로 첨가한 배지에서 다른 질소원을 첨가한 배양액 보다 리포펩티드의 생산량이 현저하게 더 많음이 확인되었다(도 22, 도 24).

실시예 10-4

공기량을 달리한 경우에서의 바실러스속 ( Bacillus sp. ) CMB26균의 생장력검정

본 발명의 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 배양중 온도 및 공기량이 리포펩티드의 생성에 영향을 주는 균수의 증가에 영향을 주는지를 역시 검정하여 보았다. 500㎖ 삼각 플라스크에 M9 배지를 각각 50㎖, 100㎖, 200㎖, 300㎖, 400㎖씩 채운 후 전날 LB 배지에 배양한 종배양액을 1/100으로 하여 접종한 후 37℃ 진탕 항온배양기에서 150rpm으로 배양 시킨 후 그 생육 정도를 스펙트로포토미터를 이용하여 확인하였다.

결과로 통기가 원활하게 이루어지는 조건에서 생육이 더 활발함을 확인 할 수 있었다(도 23).

본 발명은 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 배양액을 작물의 지상부에 기생하며 피해를 일으키는 곰팡이 병원성균에 대한 치료를 할 수 있는 미생물농약 및 그의 제조방법에 관한 것과 이를 이용하여 원예작물 재배 시, 치료 및 발병률을 감소 시킬 수 있는 곰팡이균으로는 흰가루병, 만고병, 겹무늬 썩음병, 시들음병, 탄저병, 잿빛곰팡이병, 역병, 문고병이 있고 이는 엽면살포 및 관주를 동시에 처리하여, 전체 작물의 병해 발생률을 감소 시킬 수 있게 된다.

도 1은 본원발명과 관련한 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB26균의 형태학적 분석을 위한 전자현미경 사진이다.

도 2는 신규균 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균 ribosomal RNA gene 분석결과이다.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=15822789&dopt=GenBank

도 3은 포자 및 균사체 파괴능이 높은 바실러스속(Bacillus sp.) CMB26균이 내는 항곰팡이성 물질 Lipopeptide의 항미생물성 구명 HPLC스펙스럼이다.

도 4는 포자 및 균사체 파괴능이 높은 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균이 내는 항곰팡이성 물질 Lipopeptide 물질분석 그래프이다.(MALDI-TOF profile, HPLC, fraction No.29, main pick : 1465 Da)

도 5는 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB26균이 내는 항곰팡이성 물질 Lipopeptide에 의하여 파괴되는 고추역병(좌) 및 고추탄저균(중), 오이흰가루병(우) 의 포자 및 균사체 파괴과정 사진이다.

도 6은 흰가루 곰팡이균에 감염된 현장오이의 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB26균의 1회 엽면살포시 일정별 치료과정 사진이다.(희석배수 500배,전남담양, 2002.7. 1)

도 7은 탄저병에 감염된 고추를 대상으로 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB26균을 엽면살포시 탄저병감염 고추의 치료전(좌)과 치료후(우)의 결과 사진이다. (전남 영광, 2001. 8. 5.)

도 8은 역병균감염 고추를 대상으로한 신규한 바실러스속 (Bacillus sp.)CMB26균 배양액의 엽면 살포 및 관주 후의 치료 전(좌)과 치료 후(우)의 현장실험결과 사진이다. (전남 영광, 2001. 8. 5)

도 9는 역명에 자연감염된 고추묘를 대상으로한 신규균 바실러스 (Bacillus sp.) CMB26균을 처리방법을 달리한 경우의 일정별 발병율 변화 그래프이다.

도 10은 역병에 자연감염된 고추묘를 대상으로한 신규균 바실러스 (Bacillus sp.) CMB26균을 처리방법별 5일 경과시의 초장과 경경의 크기변화 그래프이다.

도 11은 역병에 자연감염된 고추묘를 대상으로한 신규균 바실러스 (Bacillus sp.) CMB26균을 처리방법별 5일 경과시의 뿌리와 경경 무게의 변화 그래프이다.

도12는 역병에 자연감염된 고추묘를 대상으로한 신규균 바실러스 (Bacillus sp.) CMB26균을 처리방법별 5일 경과시의 과실수와 무게의 변화 그래프이다.

도 13은 탄저병에 자연감염된 고추묘를 대상으로한 신규균 바실러스(Bacillus sp.) CMB26균을 처리방법을 달리한 경우의 일정별 발병율 변화 그래프이다.

도 14는 탄저병에 자연감염된 고추묘를 대상으로한 신규균 바실러스(Bacillus sp.) CMB26균을 엽면살포 한 후 5일 경과시 초장, 근장(위), 경경의 두께 및 무게(중간), 과실수와 과중(아래)의 변화 그래프이다.

도 15는 바실러스 (Bacillus sp.) CMB26균에 의하여 생성되는 항곰팡이성 물질의 추출과 분석을 위한 순서도이다.

도 16은 신규균 바실러스 (Bacillus sp.) CMB26균 배양액에 첨가한 phenylalanine에 의한 리포펩티드 생성량 변화 사진이다 (좌로부터; 무첨가, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖, 15㎍/㎖, 20㎍/㎖, 30㎍/㎖)

도 17은 항곰팡이성 신규균 바실러스 (Bacillus sp.) CMB26균 배양액에 나타나는 리포펩티드물질을 분석한 TLC검정결과 사진이다. (Lane I : 0.2% nihydrin, Lane II: 30% H2S04염색)

도 18은 항곰팡이성 리포렙티드를 추출한 후 HPLC로 분석한 결과 그래프이다.

도 19는 항곰팡이성 효과가 확인된 리포펩티드를 HPLC로 분획을 채취, 가수 분해한 후 전개한 TLC 분석결과 사진이다. {Lane I는 최초 HPLC에서 채취한 분획분의 TLC 정성분석(분획시간:2' 30' '- 25' 30' ' 까지 30초 간격, Lane Ⅱ는 Lane I을 6N HCl으로 가수분해한 후 이를 30% H2S04로 전개한 TLC분석결과)}

도 20은 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균배양액의 HPLC 분석중 시간별 분취한 리포펩티드 시료의 fraction별 항공팡이효과 확인 그래프이다. (공시균 : C. gloeosporioides)

도 21은 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균배양액(crude)과 HPLC 분석중 시간별 분취한 리포펩티드 시료의 fraction(20' - 30')별 항곰팡이효과 사진이다 (공시균:C. gloeosporioides)

도 22는 질소원을 달리하여 배양한 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균용액내의 리포펩티드의 생성량 조사 사진이다. (좌로부터, Urea, KNO3, NaNO3, (NH4)2SO3, NaNH4HPO4,NH4Cl, 각각 0.1%)

도 23은 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 배양에 미치는 공기량의 영향그래프이다. (1,000ml 삼각 플라스크에 50ml, 100ml, 200ml, 300ml, 400ml를 왕복 shaking 항온조에서 24시간 배양, 30℃, 150rpm)

도 24는 신규균 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 생장에 미치는 질소원의 영향 그래프이다.

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식물곰팡이균의 병해 예방 또는 살균하는 리포펩티드를 이용하며, 상기 리포펩티드는 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균의 고체분리물 또는 액상배양액, 또는 상기 균주로부터 생성된 합성분비물, 또는 바실러스속 (Bacillus sp.) CMB26균 및 이로부터 생성되어 합성분비되는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제.
제 4 항에 있어서, 과수, 농원예작물, 화훼 등의 작물에 기생하여 피해를 발생시키는 곰팡이균 중 흰가루병, 만고병, 겹무늬 썩음병, 시들음병, 탄저병, 잿빛, 역병 또는 문고병 등의 병해 예방 또는 살균하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제.
제4항 또는 제5항에 있어서, 작물기생 곰팡이의 병해 예방 및 살균시키기 위해서 상기 살균제를 원액 내지 2,000배 희석하여 엽면살포, 관주 또는 엽면살포와 관주를 병행처리하는 것을 특징으로 하는 식물곰팡이균의 살균제.