CN101250495A - 一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用 - Google Patents

一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用 Download PDF

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本发明公开了一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。该植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243。该植物病原真菌拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243可以防治香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、橡胶棒孢霉落叶病菌、竹子镰刀病菌和芒果炭疽病菌引起的植物病害；特别是可以与香蕉共生，在香蕉体内稳定的生存并防治香蕉枯萎病。

Description

一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用
技术领域
本发明涉及一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。
背景技术
植物内生细菌是指一生或至少一生中的某一阶段能进入活体植物组织内，且它们的存在并未使植物组织的表型特征和功能有明显改变的细菌。1926年Perotti在许多健康植物根组织内发现存在内生细菌，随后这方面的研究有了很大进展，在许多植物的组织内发现了多种内生细菌。这些内生细菌将植物组织作为其栖息场所，且往往对宿主植物起到促生、防病虫、固氮、抗逆境(如干旱等)、抗动物(昆虫、线虫、食草哺乳动物等)摄食，抗病原真菌和细菌等作用，能够产生对宿主有利的活性代谢产物，还可作为外源基因载体而发挥作用，与病原菌不同，和植物是一种互利共生关系。
内生细菌在宿主植物体内稳定存在，并能长期发挥作用，因而利用拮抗性内生细菌进行病害防治有几个优点。首先，和抗病育种相比，拮抗性内生细菌能够起到类似抗病基因的作用而不需要进行抗病基因的分离以及相关的转基因试验操作，节省时间和资金，也不需要考虑转基因食品的生物安全性问题。其次，内生细菌存在于宿主组织内，基本不受外界环境(干燥、紫外线辐射、营养缺乏等)的影响，利用它进行病害防治不必考虑常规生物防治的防效稳定性问题。第三，内生菌在植物体内稳定存在，只需接种一次即可长期起到防病效果，和化学农药防治相比成本较低而且不存在环境污染问题。近年来，利用拮抗性内生细菌进行植物病害的生物防治已经成为人们研究的热点。植物内生细菌生防机制主要有产生抗生素、竞争生态位和营养、诱导宿主产生系统抗性、灭活病菌萌发因子、产生胞外酶溶解病原菌细胞壁和降解毒素等几种方式。
由土壤真菌古巴尖镰孢菌[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Simth)Snyder etHansen]引起的香蕉枯萎病(也称巴拿马病)是一种毁灭性的土传病害。自1874年在澳大利亚首次发现以来，该病已经广泛发生于世界各香蕉主产区，在我国广东、广西、福建、台湾和海南等省(区)也屡有发生，对香蕉生产造成很大危害。病原菌从香蕉根部侵入导管，产生毒素，使维管束坏死，蕉苗、流水、土壤、农具等均可带病，病原菌在土壤中存活时间长达几年甚至20年。采用化学药剂防治该病特别困难，因为在杀死土壤中病原菌的同时也抑制有益菌的生长，破坏土壤的微生态，同时对果实、环境也会造成很大不利影响。采用抗病品种又由于育种周期长，所需人力和经费多而在生产中受到较大限制。应用内生细菌防治植物病害已经有很多的报道，而有关运用香蕉内生细菌防治香蕉枯萎病在国内外还没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用。
本发明所提供的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2CGMCC No.2243。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2，已于2007年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2243。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243为革兰氏阳性杆菌，菌体大小约0.5～1.0μm×1.5～2.3μm之间，有芽孢，极生鞭毛，能运动。菌体在NA培养基(每1000mL含有蛋白胨5g、酵母浸膏1g、牛肉膏3g、琼脂粉15g、葡萄糖10g，pH 7.0)平板上能形成浅白色的菌落，菌落边缘突起，表面干燥，边缘锯齿状。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243最适培养基为KingB2培养基；培养温度为26～33℃，最适温度为28℃，最适PH值7。
以上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
实验证明，本发明的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2CGMCC No.2243对香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌、竹子镰刀病菌、水稻稻瘟病菌、橡胶棒孢霉落叶病菌等病原真菌都有很强的抑菌作用，具有对这些病原菌引起的真菌病害起到防治作用的潜力。
本发明的植物病原真菌拮抗菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2分离自健康的香蕉植株体内，是一株香蕉内生细菌，实验证明该菌株接种香蕉后能够在香蕉植株组织内部稳定存在并能有效防治香蕉枯萎病，为香蕉枯萎病的防治提供了一条环保、简单、有效的途径。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243对香蕉枯萎病菌的抑菌作用；图1中I为BEB2和香蕉枯萎病菌对峙培养试验；II为对照香蕉枯萎病菌生长情况；III为BEB2菌液对香蕉枯萎病菌的抑制试验。
图2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243对香蕉枯萎病的离体叶片防治试验结果；图中，A表示处理I组的离体叶片防治试验结果；B表示处理II组的离体叶片防治试验结果；C表示处理III组的离体叶片防治试验结果；D表示对照组的离体叶片防治试验结果。
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243对香蕉枯萎病的盆栽防治试验结果；其中，图3中A、B、C、D分别为处理I组的植株、假茎、假茎剖面以及球茎剖面图，图3中E、F、G、H分别为处理II组的植株、假茎、假茎剖面以及球茎剖面图，图3中I、J、K、L分别为处理III组的植株、假茎、假茎剖面以及球茎剖面图，图3中M为对照组的植株图。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、植物病原真菌拮抗菌的筛选及其鉴定
1、植物病原真菌拮抗菌的筛选
本发明的菌株是从海南儋州西庆农场健康香蕉植株内部分离到的，具体方法为：称取健康香蕉植株组织1g，表面消毒后，放入有10mL无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石英砂研磨均匀，静置15min。取1mL稀释至10-3、10-4、10-5浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1mL，用无菌涂布棒涂于NA培养基(每1000mL含有蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，琼脂粉15g，葡萄糖10g，pH 7.0)平板上，以最后1次洗过样品的无菌水为对照。28℃倒置培养，连续观察7天，挑取菌落形态不同的菌株，再次划线纯化保存备用。在倒好的PDA平板一侧接入新鲜的香蕉枯萎病菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC No.31272)菌块，在另一侧划线接种筛选纯化后的菌株，对峙培养，筛选抑菌作用最强(抑菌活性最强)的菌株，结果得到一株对香蕉枯萎病菌具有很强拮抗作用的菌株，将该菌株命名为BEB2。
2、BEB2菌株的种属鉴定
采用常规生理生化及16s rDNA序列分析对BEB2菌株进行鉴定，确认该菌株应属于假单孢菌。该菌株的基本生物学特性见表1。
表1.BEB2菌株的基本生物学特性
  菌体大小   0.5～1.0μm×1.5～2.3μm   pH值范围   4～10
  菌落颜色   浅白色   最适pH值   7
  菌落形状   表面干燥、边缘突起   葡萄糖   +
  革兰氏   G+   蔗糖   +
  鞭毛   极生   乳糖   +
  荚膜   有   D-果糖   +
  芽孢   有   甘露糖   +
  抗酸性   阳性   鼠李糖   +
  接触酶反应   阳性   D-木糖   +
  需氧性测定   好氧   甜醇   -
  VP试验   阳性   甘露醇   +
  淀粉水解   阳性   苹果酸   +
  硝酸盐还原   阳性   尿素   -
  精氨酸双水解酶   阳性   硝酸钾   -
  明胶液化   阳性   草酸铵   -
  葡萄糖氧化发酵   阳性   氯化铵   -
  温度生长范围   15℃～45℃   干洛素   -
  最适温度   28℃   牛肉膏   +
  蛋白胨   +
注：+表示能够利用该炭源(或氮源)，-表示不能利用
显微观察结果表明BEB2菌体大小约0.7～1.0×1.5～2.3μm之间，革兰氏染色阳性，有芽孢，极生鞭毛，能运动。在NA培养基上为浅白色，菌落表面干燥，边缘突起、锯齿状。生化试验结果表明，BEB2能氧化葡萄糖产酸，具有运动性，好氧，V-P反应阳性，接触酶反应呈阳性，能还原硝酸盐和水解淀粉，能在含质量百分含量为1％-7％氯化钠的NB培养液(每1000mL含有蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，pH 7.0)中生长，依据《常见细菌鉴定手册》，BEB2菌株以上生理生化特征均与枯草芽孢杆菌相同，因此将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BEB2。该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2菌株，已于2007年11月02日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2243。
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.2243的基因组DNA为模板，以细菌16S rDNA序列通用引物作为引物，PCR扩增出约为0.7kb左右的产物片段，测序结果表明序列长度为732个碱基，具有序列表中序列1的核苷酸序列；将该序列与枯草芽孢杆菌属的其他菌株进行blast对比，结果表明枯草芽孢杆菌BEB2的16SrDNA序列与Bacillus subtilis strain B-FS01菌(DQ520955)的同源性为100％。
3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243最适培养条件的确以
1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243生长最适培养基的确定
分别将200mL的PDB培养液(每1000mL含有马铃薯200g，葡萄糖20g，pH7.0)、NB培养液(每1000mL含有蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，pH7.0)、胡萝卜培养液(每1000mL含有新鲜胡萝卜200g)、玉米粉培养液(每1000mL含有玉米粉30g)、LB培养液(每1000mL含有胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，pH 7.0)、King B1培养液(每1000mL含有蛋白胨20g，硫酸钾10g，甘油10ml，氯化镁1.4g)、King B2培养液(每1000mL含有蛋白胨20g，甘油10ml，K2HPO41.5g，MgSO4·7H2O 1.5g)装入500mL三角瓶中，灭菌后，分别接种100μL OD600值为0.5的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243菌液，分别在28℃下180rpm振荡培养24小时后，测量OD600值，结果表明各种培养基所获菌液OD600值差别不大，用King B2培养液培养所获得的菌液OD600值最大，为2.683，表明该培养基为其生长最适培养基(结果见表2)。
表2.BEB2菌株在不同培养基条件下的生长状况
  培养基   King B1   胡萝卜   NB   LB
  OD600值   2.513±0.012   2.489±0.015   2.551±0.021   2.534±0.016
  培养基   玉米粉   King B2   PDB
  OD600值   2.422±0.022   2.683±0.013   2.527±0.025
2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243菌株生长最适温度的确定
按照步骤1)所述的方法，将12份100μL OD600值为0.5的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BEB2 CGMCC No.2243菌液分别接种于12个装有200mL NB液体培养基的500mL三角瓶中，在不同温度(10～45℃，具体取值如表3所示)条件下180rpm恒温培养24小时后测量其OD600值。结果如表3所示，结果表明在26～33℃培养时，所获菌液OD600值为2.385～2.551，表明该菌株培养温度26～33℃为宜，最适温度为28℃，OD600值为2.551。
表3.BEB2菌株在不同温度条件培养时生长状况
  温度   10℃   15℃   20℃   24℃
  OD600值   0   1.908±0.030   2.013±0.154   2.275±0.014
  温度   26℃   28℃   30℃   33℃
  OD600值   2.423±0.037   2.551±0.008   2.407±0.028   2.385±0.017
  温度   36℃   39℃   42℃   45℃
  D600值   2.212±0.056   1.839±0.036   0.679±0.012   0
3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243生长最适pH值的确定
按照步骤1)所述的方法，将13份100μL OD600值为0.5的假单孢菌(Pseudomonas)BEB2 CGMCC No.2243菌液分别接种于13个装有200mL NB液体培养基的500mL三角瓶中，分别将培养液调节至起始pH值(4～12，如表4所示)条件下，180rpm28℃培养24小时后测量其OD600值。结果表明在培养基pH值6.5～8.0培养时，菌液OD600值为2.531～2.551，表明该菌株培养PH值以6.5～8.0为宜，最适pH值为7，OD600值达2.551(结果见表4)。
表4.BEB2菌株在不同pH值时生长状况
  pH值   3   4   5   5.5   6   6.5   7   7.5
OD600值 0   0.237±0.005   1.875±0.023   2.369±0.026   2.487±0.018   2.531±0.021   2.551±0.017   2.546±0.019
  pH值   8   8.5   9   9.5   10   11   12
OD600值   2.547±0.023   2.516±0.022   2.489±0.017   2.368±0.011   2.135±0.025   1.687±0.016 0
注：OD600值是接种BEB2菌体后，28℃、180rpm、不同PH条件下培养24小时后所测数据
4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243对香蕉枯萎病菌的拮抗作用检测及拮抗活性遗传稳定性鉴定
1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243对香蕉枯萎病菌的拮抗作用检测
将BEB2与香蕉枯萎病菌(购买自中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC 31272)菌块共同培养检测其对香蕉枯萎病菌的拮抗作用，主要进行以下两种处理：1)对峙培养实验：倒好的PDA平板中间接入新鲜的香蕉枯萎病菌(购买自中国农业微生物菌株保藏管理中心，保藏编号ACCC 31272)菌块，在两侧划线接种筛选纯化后的菌株，放入28℃对峙培养7天(图1中I)；2)抑制试验：将BEB2菌悬液2mL(28℃，摇床培养24小时，OD600值约为2.5)倒入冷却至45℃左右的15mL PDA培养基中，混匀，在平板中央接种香蕉枯萎病菌(图1中III)。同时将香蕉枯萎病菌接种于一PDA平板中间，放入28℃条件下培养7天，作为对照(图1中II)。
该菌株对香蕉枯萎病菌拮抗作用结果如图1所示，结果表明筛选得到的菌株对香蕉枯萎病菌具有很强的拮抗作用。图1中I为BEB2和香蕉枯萎病菌对峙培养试验；II为对照香蕉枯萎病菌生长情况；III为BEB2菌液对香蕉枯萎病菌的抑制试验。
2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243拮抗活性遗传稳定性鉴定
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243接种在NA斜面培养基上，28℃培养24小时，4℃冰箱保存，15天后再接种NA斜面培养基，28℃培养24小时，4℃冰箱保存。按此方法连续转接培养20代后，活化第5、10、15和20代菌株，按照步骤1)所述的方法测定其抑菌活性，结果表明各世代所活化的菌体抑菌活性均与初始菌株一致，表明其拮抗活性是稳定遗传的。
实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243抑菌谱测定
分别取用NB培养液(每1000mL含有蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，pH 7.0)培养好的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243菌液(28℃，摇床培养24小时，OD600值约为2.5)2mL倒入冷却至45℃左右的15mLPDA培养基中，轻轻摇动使枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2菌液与培养基充分混匀，倒入直径为9cm的培养皿中，冷却制成平板，分别将直径5mm的供试病原菌菌块(香蕉枯萎病菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCCNo.31272)、香蕉炭疽病菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCCNo.31247)、水稻稻瘟病菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCCNo.30320)、橡胶树棒孢霉落叶病菌(购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No.3.10072)、芒果炭疽病菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC No.31219)、竹子镰刀病菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC No.31353)接入上述制备的平板中央(每个平板接一种菌)，置28℃下暗培养(处理组)，以加入同体积无菌水的培养基培养的菌块为对照，每处理3次重复，培养至对照病原菌长满皿后测量病原菌生长距离，计算平均抑菌效果。抑制率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/(对照组病原菌生长直径-接种菌饼直径)]×100％。结果该菌株对香蕉枯萎病菌的抑制率为100％，对其余几种病原菌的抑制率在82.7～96.1％之间，表明该菌株对多种病原真菌具有很强的拮抗活性(结果见表5)。
表5.BEB2
  病原菌   抑菌率(％)   病原菌   抑菌率(％)
  香蕉枯萎病菌   100.0±0.0   橡胶棒孢霉落叶病菌   85.5±3.2
  香蕉炭疽病菌   88.2±1.9   竹子镰刀病菌   82.7±2.7
  水稻稻瘟病菌   96.1±2.1   芒果炭疽病菌   90.6±1.5
实施例3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243的内生性测定
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243的氯霉素和链霉素耐性的获得
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243接种至含有10μg/mL氯霉素与10μg/mL链霉素的NB培养液中，摇菌培养约48小时至菌液变浑，取少量培养的菌液接种至含有20μg/mL氯霉素与20μg/mL链霉素的NB培养液中，摇菌培养约48小时至菌液变浑。按此方法逐步增加氯霉素和链霉素的浓度进行培养，最终获得能在含有100μg/mL氯霉素与链霉素的NB培养液中正常生长的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243菌体，按照实施例1中的方法确认该菌体的生物学特性以及抑菌活性与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCCNo.2243相当后4℃保存备用。
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243内生性测定
1)离体实验
用大头针刺伤香蕉的离体叶片，将步骤1获得的具有氯霉素与链霉素耐性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2菌体(28℃、180rpm，NB培养液培养至OD600值约0.5)接种叶片伤口处于28℃的培养箱中保湿培养7天。然后对接种后的香蕉叶片表面消毒后研磨均匀取100μL的研磨液涂布于分别含有100μg/mL的氯霉素与100μg/mL链霉素的NA培养基(NB培养基添加1.6％琼脂)平板上，28℃下培养3～5天，以接种了无菌水的香蕉叶片为对照，结果涂布有接种了步骤1获得的具有氯霉素与链霉素耐性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2菌体的香蕉叶片的研磨液的平板上获得了和接种时一样的单一白色菌落，经按照实施例1中的方法确认该菌体的生物学特性以及抑菌活性与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCCNo.2243相当，表明该菌落为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2的氯霉素与链霉素耐性菌体，而涂布有接种了无菌水的香蕉叶片的研磨液的抗性平板上没有菌体生长，表明该菌株能够在离体香蕉叶片内稳定存在并正常繁殖。
2)活体实验
通过伤根法将步骤1获得的氯霉素与链霉素耐性的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BEB2菌体(28℃、180rpm，NB培养液培养至OD600值约0.5)接种于长有3～4叶的香蕉苗内，分别于第3、5、7、9、15、20、25、30天按照步骤1)的方法对接种植株取样表面消毒后研磨均匀取100μL的研磨液涂布于分别含有100μg/mL的氯霉素与100μg/mL链霉素的NA培养基平板上，28℃下培养3～5天，以接种了无菌水香蕉苗为对照，结果在各个时间段所取样品制备研磨液后，涂布有接种了步骤1获得的氯霉素与链霉素耐性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2菌体的香蕉苗各时间段取样研磨液的抗性平板均获得了和接种时一样的单一白色菌落，按照实施例1中的方法确认该菌体的生物学特性以及抑菌活性，表明该菌落为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2的氯霉素与链霉素耐性菌体，而接种了无菌水香蕉苗的取样研磨液的抗性平板上没有菌体生长，说明该菌株能够在香蕉植株稳定存在并正常繁殖。
实施例4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243对香蕉枯萎病的防治效果实验
1、离体叶片实验
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243接种于NB液体培养基中，摇床(28℃、180rpm)培养24小时后，配成OD600值约0.5的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243菌体悬浮液。香蕉枯萎病菌(购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ACCC 31272)用PDA培养基培养，然后配成108cfu/mL的孢子悬浮液备用。将香蕉叶片剪成5cm×5cm大小，用大头针刺破香蕉叶片，在伤口接种各10μL制备好的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2菌液、香蕉枯萎病菌孢子悬浮液。设3个接种处理：处理I为同时接香蕉枯萎病菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2；处理II为先接枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2，2天后接香蕉枯萎病菌；处理III为先接香蕉枯萎病菌2天后接枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2；以只接香蕉枯萎病菌为对照，三次重复。将接种后的香蕉叶片在28℃保湿培养5天后测量发病面积，计算抑菌率。抑菌率＝(对照面积-处理面积)/对照面积×100％。结果如表6所示，结果表明处理II先接枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BEB2，2天后接枯萎病菌处理几乎没有病斑，防治效果最好；处理I同时接枯萎病菌和菌株BEB2处理的病斑也很小，和处理II差别不大；处理III先接枯萎病菌2天后接枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2的病斑较大，但是也比对照小，其中各处理的接种叶片的病斑照片如图2所示，结果表明该枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BEB2 CGMCC No.2243对香蕉枯萎病有防治效果。图中，A表示处理I组的离体叶片防治试验结果；B表示处理II组的离体叶片防治试验结果；C表示处理III组的离体叶片防治试验结果；D表示对照组的离体叶片防治试验结果。
表6.离体香蕉叶片防治试验结果
  处理   病斑面积(cm2)   抑菌率％
  处理I   0.12±0.01   98.34±0.18
  处理II   0   100.00±0.00
  处理III   5.22±0.16   28.00±2.21
  对照   7.25±0.21   0
2、室内盆栽防治试验
按照步骤1的方法制备枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243菌体悬浮液和香蕉枯萎病菌孢子悬浮液，通过伤根法接种于长有3～4叶的香蕉苗内。设3个接种处理：处理I为同时接香蕉枯萎病菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243；处理II为先接枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2CGMCCNo.2243，2天后接香蕉枯萎病菌；处理III为先接香蕉枯萎病菌2天后接枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243；以只接香蕉枯萎病菌为对照，每一处理10株，共三次重复。2个月后统计香蕉植株发病情况，计算病情指数及防病效果，并拍照植株、假茎、假茎剖面以及球茎剖面图。计算公式：病情指数＝∑[(各级病株数×相对病级数值)/(调查总株数×7)]×100；防效(％)＝[(处理病指-CK病指)/CK病指〕×100％。香蕉苗期枯萎病分级：0级为叶片无症状，解剖假茎、球茎组织未见变褐；1级为外围1～2叶片出现小面积黄色斑块，占叶面积的1/2以下，或球茎组织变褐面积占球茎面积的1/4以下；3级为外围叶片出现大面积黄色斑块，占叶面积的1/2以上，或球茎组织变褐面积占球茎面积的1/4～1/2；5级为叶片出现大面积黄色斑块，叶片出现萎蔫，球茎组织变褐面积占球茎面积的1/2以上，植株出现轻度萎蔫；7级为植株出现萎蔫，或枯死，球茎组织全部变褐或腐烂，假茎折断。
结果如表7和图3所示，结果表明只接种香蕉枯萎病菌的对照处理(图3中M)，盆栽苗2个月后叶片发黄，假茎的基部出现龟裂，并且慢慢向上扩张，剖开其假茎发现棕红色的镰刀菌色素，没有香蕉汁液流出，表现为枯干，整株叶片枯萎、发黄，最后植株枯死。处理II(先接枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB22天后接香蕉枯萎病菌)的香蕉苗2个月后的表现基本与正常的没有接种病原菌的香蕉苗一致，仅其中一株的基部叶片出现少许黄色病叶，剖开其假茎没有发现棕红色的镰刀菌色素，伴随有大量的香蕉汁液流出，表现为抗香蕉镰刀菌；处理I(图3中A、B、C、D)(同时接香蕉枯萎病菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2)植株和叶片有少许病斑，和处理II(图3中E、F、G、H)防效相比稍低。处理III(图3中I、J、K、L)(先接香蕉枯萎病菌2天后接枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2)叶片上有大片病斑、假茎基部有轻微龟裂。但是和对照整株枯死相比，防效也很明显，表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243的不同接种处理对香蕉枯萎病均表现出稳定的防治作用。其中，图3中A、B、C、D分别为处理I组的植株、假茎、假茎剖面以及球茎剖面图，图3中E、F、G、H分别为处理II组的植株、假茎、假茎剖面以及球茎剖面图，图3中I、J、K、L分别为处理III组的植株、假茎、假茎剖面以及球茎剖面图，图3中M为对照组的植株图。
表7.室内盆栽防治效果
  处理   病情指数   防治效果％
  处理I   12.50±2.30   81.68±3.47
  处理II   1.52±0.12   97.78±0.21
  处理III   49.87±1.35   26.91±1.93
  对照   68.23±2.67   0
上述结果表明，离体叶片与盆栽防治的效果呈正相关关系，通过离体叶片的防治试验能够快速的检测内生细菌的防病效果。这些接种结果为后来的大田实验提供了初步的防效基础，说明BEB2菌株具有良好的开发前景。
序列表
Figure S2008101012710D00131

Claims (5)

1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243。
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243在防治植物病害中的应用。
3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物病害为香蕉枯萎病菌和/或香蕉炭疽病菌和/或水稻稻瘟病菌和/或橡胶棒孢霉落叶病菌和/或竹子镰刀病菌和/或芒果炭疽病菌引起的植物病害。
4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植物病害为香蕉枯萎病菌引起的香蕉病害。
5、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BEB2 CGMCC No.2243为活性成分的生物菌剂。
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