CN102433281A - 卡特拉链霉菌nb20及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了卡特拉链霉菌NB20及其培养方法和应用，该菌株于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.5382。经研究发现，该菌株对香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌均具有强烈的抑制作用，为广谱拮抗菌，可用于多种植物病害的防治，尤其是对香蕉果实炭疽病的防治效果较好，且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点，应用前景广阔。

Description

卡特拉链霉菌NB20及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于植物保护（微生物农药）领域，具体涉及一种卡特拉链霉菌NB20及其培养方法和应用。

背景技术

植物病原菌（包括真菌、细菌、病毒等）引起的植物病害给农业生产造成了重大的经济损失。香蕉是世界著名的热带水果，也是华南地区四大名果之一，香蕉产业在华南地区的农业和社会发展中起着重要的作用。香蕉采后果实腐烂一直是制约我国香蕉产业发展的重要因素之一，腐烂损失高达15%～30%，而由香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）引起的炭疽病（anthracnose）是导致香蕉果实腐烂的重要原因之一，严重影响着我国香蕉的北运和出口。目前多采用杀菌剂浸果防治香蕉果实腐烂，以延长货架期。随着人们环保意识的增强和病原菌抗药性的出现，生物防治已经成为控制香蕉果实采后病害的研究热点。

植物周围不仅存在病原菌，而且还存在着大量的非病原菌，其中有的还是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌，达到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物对环境安全，不像化学农药那样造成环境污染以及对人畜的毒害，同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单。因此，利用拮抗微生物来防治植物病害的研究正越来越受到国内外的重视。目前，人们已经分离到多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己经进入实际应用阶段，产生了相当的社会效益和环境效益。

除了运用化学农药和植物提取物防控植物病害外，在微生物方面，也有关于利用枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等拮抗微生物进行植物病害防治的报道，如中国专利文献：一种植物内生枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，公开日：2004/06/23，公开号为：1506455；一株可产生铁载体的植物病原真菌拮抗菌及其应用，公开日：2008/07/30，公开号为：101230327；一株植物病原真菌拮抗菌及其在防治植物病害中的应用，公开日：2008/08/27，公开号为：101250495；一种铜绿假单胞菌D10及其制备方法与应用，公开日：2010/04/28，公开号为：101698828A；一种枯草芽孢杆菌A16及其制备方法与应用，公开日：2010/04/28，公开号为：101698829A。其它文献：罗萍等. 香蕉炭疽菌拮抗生防菌株的筛选及鉴定. 现代食品科技，2011-4-19；陈旭玉等. 香蕉炭疽病拮抗细菌的分离和初步鉴定. 微生物学杂志，2011-01-18；许曼琳等. 芽孢杆菌两菌株对香蕉炭疽病菌的抑制作用及其机制. 云南农业大学学报，2009-08-21；赵志颖等. 香蕉炭疽病生防拮抗菌筛选及其作用机制. 福建农业大学学报，1998-06-12；何红等. 辣椒内生枯草芽孢杆菌BS-2和BS-1防治香蕉炭疽病. 福建农业大学学报，2002-12-30。未见有关于卡特拉链霉菌在植物病害防治方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一株具有可抑制包括香蕉炭疽病菌在内的多种植物病原菌的放线菌菌株。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

卡特拉链霉菌NB20，分类命名为：卡特拉链霉菌Streptomyces katrae，于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.5382。本发明中对上述菌株简称为卡特拉链霉菌NB20。该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种生物菌剂，该生物菌剂含有卡特拉链霉菌NB20或含有卡特拉链霉菌NB20发酵液（即培养液）经过滤后的无菌滤液，所述无菌滤液优选用卡特拉链霉菌NB20培养液经过离心取得的上清再经过细菌过滤器过滤获得。

该卡特拉链霉菌NB20的培养方法，培养条件如下：以大豆粉发酵液（大豆粉10.0 g，NaCl 2.5 g，CaCO₃ 2.0 g，蛋白胨 3.0 g，葡萄糖10.0 g，加水混匀至1 L）为培养基，在28 ℃、转速180 r/min条件下培养4 d，即得到可直接应用的菌液。

卡特拉链霉菌NB20在制备防治植物病原菌引起的植物病害菌剂中的应用。所述植物病原菌为香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）、荔枝霜疫霉菌（Peronophythora litchii）、甘蔗黑腐病菌（Ceratocystis adiposum）、番茄叶霉病菌（Fulvia fulva）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和/或水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

经过实验证实，本发明的卡特拉链霉菌NB20发酵液（菌剂）对香蕉炭疽病菌菌丝的抑制率为91.57%。室内生防试验结果表明，该菌株的发酵液（菌剂）对香蕉果实炭疽病具有较好的防治效果，达50.90%。此外，该生防菌株对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌等重要经济作物病原菌也具有强烈的抑制作用。因此，该菌株是一种对多种植物病原真菌和细菌都具有抑制作用的广谱的生防菌株，且具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点，能够进行商业开发，应用前景广阔。

附图说明

图1. 菌株NB20的培养形态，A为培养形态，a为高氏一号培养基上的培养结果，b为LB培养基上的培养结果，B为菌株NB20的孢子丝形态。

图2. 菌株NB的16S rDNA序列与相近菌株序列的系统发育树。

图3. 卡特拉链霉菌NB20对香蕉果实炭疽病的防治效果，1为CK1；2～5为菌株NB20实验组；6～7为CK2。

具体实施方式

实施例1 卡特拉链霉菌NB20的筛选及鉴定

1、菌株的筛选

（1）土壤样品的采集

本实验从华南农业大学农场果园采集土样，根据采集地的地形等采用5点取样，取样深度为耕作层或地表以下15 cm，取量200～250 g，每个地点采集的5个样本均匀混合，装入灭菌的封口聚乙烯袋，带回实验室马上分离。

（2）样品悬浮液的制备

将土壤样品加入灭菌水中激烈震荡。样品:水=1:9（质量与体积比），如：10 g土壤加入装有90 mL灭菌水的三角瓶中所得悬浮液浓度为10^-1，每种样品各准备5支装有9 mL灭菌水的试管按10倍梯度稀释法，将上述浓度为10^-1的悬浮液稀释成10^-2～10^-6的系列浓度悬浮液，即从1号试管中吸取1 mL悬浮液放入2号试管（盛有9 mL灭菌水）中，充分震荡混匀，再从2号试管中吸取1 mL悬浮液放入3号试管（盛有9 mL灭菌水）中，依此类推，直至第6支试管为止，得到系列稀释浓度的土样悬浮液。

（3）分离方法

采用高氏1号培养基（加入重铬酸钾，终浓度为0.05 g/1000 mL）和低稀释度土样悬浮液（10^-2～10^-4）进行实验。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.5 mL，滴加于培养基平板上（3平板/稀释度），用灭菌的L型玻棒涂布均匀，稍晾干，作好标记和日期，培养皿倒置，于25～28℃温箱中培养2～3 d，根据平板上长出的单菌落挑出到新的含重铬酸钾的高氏1号培养基上纯化培养，对全部分离到的菌株（称为待测菌株）进行编号，然后对其拮抗活性进行初筛和复筛，以获得本专利菌株。

（4）拮抗菌的初筛和复筛

采用平板对峙培养法，检测上述各种待测菌株对香蕉炭疽病菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培养好的香蕉炭疽病菌等病原菌的菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块，接种在PDA平板中央，再将已经活化的各种待测菌株接种在香蕉炭疽病菌等病原菌的菌丝块四周2~3cm处，每个PDA平板接种4个待测菌株，设置不接种待测菌株的对照，每处理3次重复。在25~28℃下培养3~5 d，然后测量待测菌株与香蕉炭疽病菌等病原菌之间的抑菌带宽度，作为拮抗活性强弱的指标。

 经过上述初筛和复筛，获得一株对香蕉炭疽病菌等多种病原菌具有强烈抑制作用的菌株，编号为NB20，保存备用。

、鉴定过程实验数据

（1）形态学观察

在高氏1号培养基上培养，NB20菌株的菌丝浓密，生长初其为乳白色，后变为紫红色。基内菌丝发育良好，交织紧密，有大量分枝，无横隔膜，不断裂；气生菌丝生长良好，多分支，可形成孢子链，孢子丝直形或波曲，顶端卷曲，孢子圆柱形、表面光滑；在LB培养基上，菌落近圆形，乳黄色，边缘较整齐，菌体表面有褶皱，产生黑褐色可溶性色素（图1）。

（2）培养性状观察

菌株NB20在所选的8种培养基上，其气生菌丝和基内菌丝的颜色有一定变化，气生菌丝的颜色多为灰白至牵牛紫色。另外，该菌株只在马铃薯块上形成黑色可溶性色素，在其它培养基上都均不形成可溶性色素。详细结果见表1。

表1 菌株NB20的培养性状

培养基	气生菌丝	基内菌丝	可溶性色素
				察氏琼脂	少、灰白色	豆汁黄	无
葡萄糖酵母培养基	丰富、乳白色（间带紫红色）	棕红色	无
				克氏一号琼脂	中等、蚌肉白	豆汁黄	无
葡萄糖天门冬素琼脂	丰富、牵牛紫	铁棕	无
				淀粉琼脂	中等、紫灰色	象牙黄	无
马铃薯块	丰富、牵牛紫	灰白色	黑色
				PDA	丰富、椹汁紫	淡可可棕	无
高氏1号	丰富，牵牛紫	豆汁黄	无

（3）生理生化特性

我们对菌株NB20的多种生理生化特征进行了测定，结果如表2所示。

表2 菌株NB20的生理生化特性

生理生化特性	结果
		明胶液化	－
牛奶凝固	±
		牛奶胨化	－
淀粉水解	－
		纤维素水解	＋＋
硫化氢产生	＋＋＋
		葡萄糖	±
蔗糖	＋＋
		D-木糖	＋＋
D-果糖	＋
		L-鼠利糖	±
麦芽糖	＋
		乳糖	±
D-半乳糖	＋
		甘露醇	±
D-山梨醇	±
		肌醇	±

注：“－”表示阴性反应；“±”表示结果不好判断为阴性或阳性；“＋” 、“＋＋” 、“＋＋＋”表示反应为阳性的强弱程度，分别为弱、中强、很强。

（4）分子生物学鉴定

经克隆和测序，菌株NB20的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1。

 将菌株NB20的16S rDNA序列用Blast软件与从GenBank中搜索到的已经登录的Streptomyces katrae（EF654092）、Streptomyces polychromogenes（AB184292）、Streptomyces racemochromogenes（AB184235）、Streptomyces herbaricolor（DQ442505）、Streptomyces toxytricini（DQ442548）和Streptomyces globosus（AJ781330）的16S rDNA序列进行同源性比较，用DNAStar软件分析，采用Clustal W程序进行序列多重比较，构建系统发育树（图2），并计算序列相似系数（表3）。

表3 菌株NB20和其它不同菌株间16S rDNA序列相似系数的比较

	1	2	3	4	5	6	7
								1	***	99.0	98.9	98.6	98.9	98.9	98.6
2		***	99.0	98.6	99.2	99.3	98.5
								3			***	99.1	99.8	100	99.0
4				***	98.8	99.2	99.9
								5					***	99.9	98.8
6						***	99.0
								7							***

注：1. 本研究的菌株NB20；2. Streptomyces katrae；3. Streptomyces racemochromogenes；4. Streptomyces globosus；5. Streptomyces herbaricolor；6. Streptomyces polychromogenes；7. Streptomyces toxytricini。

菌株NB20与搜索到的菌株Streptomyces katrae（EF654092）处于同一分支，用BLAST进行同源性比对，与它的同源性也最高，为98%，菌株间的相似系数达到99.0%，说明菌株NB20 与其亲缘关系最近。

经过形态、生理生化特性及16S rDNA序列比对分析，最终将本发明的菌株NB20鉴定为卡特拉链霉菌Streptomyces katrae。该菌株命名为卡特拉链霉菌Streptomyces katrae NB20，简称卡特拉链霉菌NB20，是一种放线菌。

实施例2 卡特拉链霉菌NB20对植物病原菌的抑制作用

1、卡特拉链霉菌NB20对多种植物病原菌的抑制作用

（1）供试的病原真菌和细菌菌株

本实验所用的植物病原真菌和病原细菌均为本实验室保存的菌株。

（2）对病原真菌的抑制作用

用灭菌接种针将卡特拉链霉菌NB20菌株接种于PDA培养基平板一边，同时将香蕉炭疽病菌（C. musae）、稻瘟病菌（P. oryzae）、小麦赤霉病菌（G. zeae）、香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）、荔枝霜疫霉菌（P. litchii）、甘蔗黑腐病菌（C. adiposum）和番茄叶霉病菌（C. fulvum）等病原真菌的菌丝块接种于PDA培养基平板另一边进行对峙培养（即同一平板上接种一种病原菌和卡特拉链霉菌NB20对峙培养），置生化培养箱中在28 ℃下培养2～3 d，观察抑菌状况及抑菌圈大小，实验结果见表4。

（3）对病原细菌的抑制作用

用灭菌的接种针将卡特拉链霉菌NB20菌株接种于PSA平板中心，37 ℃下培养到菌落约为5 mm大小(24～48 h)。在培养皿盖上加3.0 mL氯仿，反扣培养皿2 h以杀死细菌。在通风厨抽去氯仿后在培养皿中倒入约200 μL水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae）或水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）等病原菌的菌液（见表4），均匀铺于培养基表面，在超净台上吹干，然后28 ℃下培养24 h左右，观察抑菌状况及抑菌圈大小，实验结果见表4。

表4 卡特拉链霉菌NB20菌株对植物病原真菌和细菌的抑制结果

病原菌	NB20抑菌圈半径（cm）
		香蕉炭疽病菌(Cm)	1.49±0.17
稻瘟病菌(Po)	1.55±0.05
		小麦赤霉病菌(Gz)	1.57±0.15
香蕉枯萎病(Foc)	1.68±0.16
		荔枝霜疫霉(Pl)	1.87±0.15
甘蔗黑腐病菌(Ca)	0.68±0.23
		番茄叶霉病(Cf)	1.27±0.18
水稻白叶枯病菌(Xooe)	1.88±0.19
		水稻细菌性条斑病菌(Xooa)	1.42±0.21

2、卡特拉链霉菌NB20对香蕉果实炭疽病菌的抑制作用

（1）供试香蕉炭疽病菌菌株

用于接种的香蕉炭疽病菌（C. musae）菌株系从发病的香蕉果实上分离纯化获得，并由本实验室鉴定和保存。

（2）卡特拉链霉菌NB20对香蕉炭疽菌菌丝生长的抑制作用

菌株NB20不同稀释度的发酵液对香蕉炭疽菌的菌丝生长有不同程度的抑制作用，10倍稀释度的抑制率为91.57%（见表5）。

表5 卡特拉链霉菌NB20不同稀释度的发酵液对香蕉炭疽病菌菌丝生长的抑制作用

发酵液稀释度（×）	菌落直径 (cm)	菌丝生长抑制率（%）
			10	0.70± 0.04 E	91.57± 1.42 A
100	4.41± 0.23 D	44.41± 3.51 B
			200	4.71± 0.31 C	40.52± 5.93 B
500	7.35± 0.11 B	7.08± 3.41 C
			1000	7.85± 0.09 A	0.74± 3.10 D

注：表中数据为3次重复的平均值，同列数据采用LSR法进行差异显著性分析，具有不同字母者表示差异极显著（LSR_0.01），反之，则差异不显著。

（3）卡特拉链霉菌NB20对香蕉果实炭疽病的防治效果

卡特拉链霉菌NB20（生防菌）在以大豆粉发酵液（大豆粉10.0 g，NaCl 2.5 g，CaCO₃ 2.0 g，蛋白胨 3.0 g，葡萄糖10.0 g，加水混匀至1 L）为培养基，在28 ℃、转速180 r/min条件下培养4 d后，离心后收集上清液，用细菌过滤器过滤，获得无菌滤液。选取七八分成熟度的香蕉果实，用70%酒精进行表面消毒后，分别在上、中、下三个位置打孔作为加样孔。实验组加入20μL无菌滤液，自然风干后加入20 μL的香蕉炭疽病菌孢子悬浮液；对照组（CK1）只接种20μL的香蕉炭疽病菌孢子悬浮液；对照组（CK2）只接种20 μL的卡特拉链霉菌NB20。每个处理做10个重复，各组均在28 ℃保湿培养，5 d后观察结果，测量病斑大小。

防治效果的计算方法：

防治效果（%）=[对照(CK1)病斑面积﹣实验组病斑面积]/对照(CK1)病斑面积×100

防治效果：卡特拉链霉菌NB20对香蕉果实炭疽病的防效为50.90%（图3）。

综上所述，卡特拉链霉菌NB20对多种重要的植物病原真菌和细菌均具有拮抗作用，为广谱拮抗菌，可以用于防治多种病害，尤其对香蕉果实炭疽病的防治效果较好。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  卡特拉链霉菌NB20及其培养方法和应用

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1479

<212>  DNA

<213>  16S rDNA

 

<400>  1

gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaacctc cttcgggagg     60

 

ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg cccttcactc tgggacaagc    120

 

cctggaaacg gggtctaata ccggatacga ctgcgggagg catctcctgt tgtggaaagc    180

 

tccggcggtg aaggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt ggtggggtaa tggcccacca    240

 

aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc    300

 

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca    360

 

gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag    420

 

cgaaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa    480

 

tacgtagggc gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt    540

 

cacgtcggat gtgaaagccc gaggcttaac ctcgggtctg cattcgatac gggctagcta    600

 

gagtgtggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag    660

 

gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga cgctgaggag cgaaagcgtg    720

 

gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgttggg aactaggtgt    780

 

tggcgacatt ccacgtcgtc ggtgccgcag ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt    840

 

acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg    900

 

tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatatac cggaaacact    960

 

cagagatggg tgcccccttg tggtcggtat acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt   1020

 

gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctgt gttgccagca   1080

 

tgcccttcgg ggtgatgggg actcacagga gaccgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg   1140

 

ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct acaatggccg   1200

 

gtacaatgag ctgcgatacc gtgaggtgga gcgaatctca aaaagccggt ctcagttcgg   1260

 

attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcatt   1320

 

gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt   1380

 

aatacccgaa gccggtggcc caacccttgt ggagggagct gtcgaaggtg ggactggcga   1440

 

ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaaggt                          1479

Claims (6)

1.卡特拉链霉菌NB20，于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.5382。

2.权利要求1所述卡特拉链霉菌NB20，其特征在于该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种生物菌剂，其特征在于含有权利要求1或2所述卡特拉链霉菌NB20或含有卡特拉链霉菌NB20发酵液经过滤后的无菌滤液。

4.权利要求1或2所述卡特拉链霉菌NB20的扩大培养方法，其特征在于培养条件如下： 以大豆粉发酵液为培养基，在28 ℃、转速180 r/min条件下培养4 d；

其中大豆粉发酵液配方为：大豆粉10.0 g，NaCl 2.5 g，CaCO₃ 2.0 g，蛋白胨 3.0 g，葡萄糖10.0 g，加水混匀至1 L。

5.权利要求1或2所述卡特拉链霉菌NB20在制备防治植物病原真菌和/或植物病原细菌引起的植物病害菌剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物病原真菌为香蕉炭疽病菌、稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌或番茄叶霉病菌；所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。

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