CN103382449B - 广谱杀虫、抗菌活性的链霉菌株t2-10及其应用 - Google Patents

广谱杀虫、抗菌活性的链霉菌株t2-10及其应用 Download PDF

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本发明分离到一种新菌株：链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10CGMCC7449，该菌株为放线菌株，经实验证实，该菌株对农业害虫、根结线虫和植物致病真菌具有极强的杀灭和抑制作用。本发明还提供利用该菌株发酵生产杀虫、抗菌活性物质的方法。

Description

广谱杀虫、抗菌活性的链霉菌株T2-10及其应用
技术领域：
本发明涉及微生物及其应用领域，特别是涉及一种新的具有广谱杀虫和抗菌活性的链霉菌株，本发明还涉及该菌株及其发酵制品在生物农药及生物菌肥等方面的应用。
背景技术：
从微生物中发现和开发高效、安全、经济、无公害的新型杀虫剂是当今发展的必然趋势，可避免环境污染、害虫抗药性产生、杀伤天敌等严重问题。
从放线菌筛选生物活性物质一直是微生物药物研究的热点，目前大约有2/3的天然抗生素是来自放线菌。放线菌是土壤中的优势菌群，除极少数致病菌外，大多数放线菌具有重要的生物学意义；其最重要的特性是可以产生多种活性物质，如抗生素、杀虫剂、细胞抑制剂等。
发明内容：
本发明的目的是提供一种新的具有广谱杀虫和抗菌活性，特别是对小菜蛾、蚜虫、红蜘蛛、小麦孢囊线虫和植物致病真菌具有极强抑制活性的链霉菌株；本发明的直接目的是提供一种新的链霉菌株。
本发明的另一个目的是提供一种方法，利用该新的链霉菌株生产杀虫、抗菌活性物质。
本发明人从我国海南省某地区的土壤样品中分离到了一种新菌株：链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10（以下简称T2-10），该菌株属于放线菌株，该菌株已于2013年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7449。
本发明所述的链霉菌T2-10的形态特征和培养特征为：
菌落密集成褶皱，起初呈象灰色，后变为棕黑色，产生大量可溶性色素；在光学显微镜下，菌丝呈垂直状，0.39-1.07um宽，图1；电镜下观察孢子呈柱形，表面光滑，见图2。
将T2-10接种到鉴定培养基上培养10天后，观察发现除了在查氏培养基上T2-10生长非常缓慢，菌丝始终呈白色外，在其它鉴定培养基上T2-10气生菌丝和基内菌丝均生长良好，且呈现不同颜色，只在马铃薯块和燕麦粉琼脂培养基上产生可溶性色素，分别呈浅棕黑色和丁香棕色。如表2、图3所示。
提取此菌的DNA，以27F和1492R为引物，扩增16S rDNA的序列。该16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
将该序列进行Blast比较，与链霉菌属（Streptomyces sp.）菌株的同源性最高，相似性均大于99％，系统进化树分析表明T2-10与Streptomyces sp.KACC91020亲缘关系最近，如图4。
结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，参照《链霉菌鉴定手册》初步鉴定T2-10为链霉菌属中的吸水紫类群。
T2-10具有广谱的杀虫和抗菌活性，特别是对小菜蛾、蚜虫、红蜘蛛、小麦孢囊线虫和植物致病真菌具有极强抑制作用。该菌株在生产生物农药和生物菌肥方面具有极大的应用潜力。
本发明所述的利用链霉菌T2-10生产抗菌活性物质的方法，是将链霉菌T2-10接种到筛选培养基中培养，得到含有抗菌活性代谢产物的培养液。
所述筛选培养基包括碳源、氮源、无机盐和水。
其中，所述碳源选自下述化合物中一种或几种：燕麦粉、淀粉、黄豆饼粉、大米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖；
所述氮源选自下述化合物中一种或几种：酵母粉、蛋白胨、硝酸钾、酪蛋白、牛肉膏；
所述无机盐选自NaCl、K2HPO4、MgSO4、CaCO3，所述NaCl的终浓度为1.0g/L，K2HPO4的终浓度为1.0g/L，MgSO4的终浓度为0.5g/L，CaCO3的终浓度为3.0g/L；
所述水是无污染的清洁水，来源不限，如可为蒸馏水、自来水或井水等。
所述碳源及在液体筛选培养基中的终浓度优选：可溶性淀粉10g/L、黄豆饼粉5g/L、葡萄糖5g/L。
所述氮源优选酵母粉，终浓度优选5g/L。
以上所述碳源、氮源和无机盐的浓度均为在1L水中的含量。
所述链霉菌T2-10的接种量无特别限制，一般为105～107个孢子/mL培养基。
所述培养温度是25～29℃，优选28℃。
所述培养方式是：可以150～260rpm的转速振荡培养2～5天，也可静置培养3-10天。
由链霉菌T2-10发酵上述培养基得到的发酵制品也属于本产品的保护范围。
所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体形式。
本发明的链霉菌T2-10的优点如下：
1、对小菜蛾、蚜虫和朱砂叶螨等农业害虫具有极强的杀灭作用，说明具有广谱的杀虫效果（见实施例1）；
2、对根结线虫具有极强的杀灭作用（见实施例2）；
3、对多种植物病源真菌都具有较强的抗菌活性，抑菌率均在50%以上（见实施例3）。
因此，T2-10是生产杀虫、抗菌活性物质理想的出发材料菌株。在抑制农业害虫、根结线虫和植物致病真菌，生产生物农药和生物菌肥等领域具有实现工业化生产的极大可能，并具有广阔的工农业应用和市场前景。
附图说明：
图1为链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10的光学显微镜图；
图2为链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10的电子显微镜图；
图3为链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10在不同鉴定培养基上的菌落形态图，从左到右依次为在高氏Ⅰ号培养基、查氏培养基、马铃薯块、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、燕麦粉琼脂培养基、淀粉铵琼脂上培养10天后的菌落形态图；
图4为链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10系统进化树图。
生物材料保藏信息：
名称：链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10
保藏编号：CGMCC No.7449
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
保藏时间：2013年4月10日。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。
除了实施例1中观察T2-10培养特征用的是鉴定培养基外，其余实施例中所提到培养基如无具体说明，均为筛选培养基，所用的各种培养基配方具体如下：
1、液体筛选培养基（以下亦称为筛选培养基）：可溶性淀粉1%、黄豆饼粉0.5%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.5%、NaCl0.1%、K2HPO40.1%、MgSO40.05%、CaCO30.3%，自然pH，112℃灭菌20min备用。
2、鉴定培养基：
1)高氏Ⅰ号培养基：KNO31.0g、K2HPO40.5g、硫酸镁0.5g、NaCl0.5g、硫酸亚铁0.01g、可溶性淀粉20g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，121℃下灭菌30min。
2)查氏培养基Ⅰ号：蔗糖30.0g、NaNO32.0g、K2HPO41.0g、硫酸镁0.5g、KCl0.5g、硫酸亚铁0.01g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，112℃下灭菌30min。
3)马铃薯块：去皮马铃薯，削成斜面装入试管内，底部放一点棉花，加水使棉花湿润，然后将马铃薯块放在试管内的棉花上，121℃下灭菌30min。
4)葡萄糖酵母膏琼脂培养基：葡萄糖10g、酵母膏10g、琼脂15g、、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，112℃下灭菌30min。
5)燕麦粉琼脂培养基：燕麦粉20g、琼脂18g、痕量盐溶液1.0ml、琼脂18g、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4，121℃下灭菌30min。痕量盐溶液配方：硫酸亚铁0.1g、氯化锰0.1g、硫酸锌0.1g、蒸馏水100ml。燕麦粉在自来水中蒸或煮20min，四层滤布，蒸馏水补至1000ml。
6)淀粉铵琼脂培养基：可溶性淀粉10.0g、硫酸铵2.0g、K2HPO41.0g、硫酸镁1.0g、NaCl1.0g、碳酸钙3.0g、琼脂18g、蒸馏水1000ml，121℃下灭菌30min。
3、PDA综合培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂20g、水1000ml、pH自然。新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热10min，然后用四层纱布过滤得土豆营养液，添加其它成分，补足水至1000ml，112℃灭菌20min，混匀后铺平板或制作斜面培养基。
实施例1链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10的分离、筛选及菌种鉴定
一、菌株分离纯化
1、链霉菌（Streptomyces sp.）T2-10的分离样品采自我国海南省某地区的土壤样品。将采集到的土壤样品120℃加热1h后，置于无菌三角瓶中，加入10倍体积无菌水打散均匀，取5ml悬液加入盛有50ml加入抑制剂（K2Cr2O775ug/ml及青霉素2ug/ml）的筛选培养基的三角瓶中，在28℃、150rpm下，振荡培养后7d，移取5ml培养液至另一盛有新鲜筛选培养基的三角瓶中培养3-5d。取富集后的培养液做一系列的稀释梯度，分别涂布筛选平板（筛选培养基+抑制剂），倒置28℃恒温培养，分离能够旺盛生长菌株。
2、将得到的纯菌种接种到斜面培养基（筛选培养基）上，4℃保存。
二、广谱杀虫活性菌株筛选
方法：
取以上筛选菌株进行发酵培养，培养基为筛选培养基，每支试管装5ml，28℃、200rpm培养3d，过滤除菌。取发酵液，以小菜蛾、棉蚜和朱砂叶螨为指示虫进行杀虫活性分析。发酵液稀释5倍用于测定小菜蛾和红蜘蛛的生物活性，处理时间分别为72h和48h；发酵液稀释3.33倍用于测定蚜虫的生物活性，处理时间为24h。对照药剂：多杀菌素为5μg/ml，吡虫啉为5μg/ml，哒螨啉为50μg/ml。
结果：由表1可知，T2-10具有广谱的杀虫活性，三种指示虫的死亡率均大于65%以上。
表1  T2-10发酵液对小菜蛾、蚜虫和朱砂叶螨的杀虫活性分析
三、菌种鉴定
对筛选出的T2-10菌株的表型特征、培养特征和16S rDNA进行系统鉴定，结果如下：
表型特征
菌落密集成褶皱，起初呈象灰色，后变为棕黑色，产生大量可溶性色素；在光学显微镜下，菌丝呈垂直状，0.39-1.07um宽，图1；电镜下观察孢子呈柱形，表面光滑，见图2。
培养特征
将T2-10接种到鉴定培养基上培养10天后，观察发现除了在查氏培养基上T2-10生长非常缓慢，菌丝始终呈白色外，在其它鉴定培养基上T2-10气生菌丝和基内菌丝均生长良好，且呈现不同颜色，只在马铃薯块和燕麦粉琼脂培养基上产生可溶性色素，分别呈浅棕黑色和丁香棕色。如表2、图3所示。
表2  T2-10在各种培养基上的培养特征
提取T2-10的基因组，以27F和1492R为引物，扩增16S rDNA的序列，该16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
将该序列进行Blast比较，与链霉菌属（Streptomyces sp.）菌株的同源性最高，相似性均大于99％，系统进化树分析表明T2-10与Streptomyces sp.KACC91020亲缘关系最近，如图4。
结合菌株形态观察、培养特性及16S rDNA的鉴定结果，参照《链霉菌鉴定手册》初步鉴定T2-10为链霉菌属吸水类群。
实施例2T2-10对根结线虫的生物学活性分析
材料：
T2-10发酵液：T2-10接种到液体筛选培养基中，28℃、200rpm培养3d；
生物学活性分析指示虫：小麦孢囊线虫
方法：
T2-10发酵液稀释10、20、40、80、100倍后，各取1ml分别加入0.5ml线虫悬浮液（约200头线虫），16℃培养24h，统计线虫存活数。按下述公式计算死亡率和校正死亡率：
死亡率（%）=死亡的线虫数/总线虫数
校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）
空白对照实验；用纯蒸馏水代替T2-10发酵液平行进行上述实验。
结果：T2-10发酵液对小麦孢囊线虫具有极强的杀灭作用；稀释10倍后，仍可使95%的小麦孢囊线虫死亡；稀释100倍后，小麦孢囊线虫死亡率仍高达20.21%。
见表3。
表3  T2-10对小麦孢囊线虫的生物学活性分析
实施例3T2-10对植物病源真菌的抑菌活性分析
方法：
T2-10接种到液体筛选培养基中，28℃、200rpm培养3d，取发酵液对9种病原真菌进行抑菌活性分析。采用生长速率法，取1ml发酵液与9ml融化的PDA培养基充分混匀，倒入无菌培养皿中制成平板。待培养基凝固后，在平板中央接入一直径为7mm的病原菌饼（带有菌丝的一面贴在培养基表面），每个处理重复3次，以加1ml蒸馏水的PDA平板为空白对照。培养至对照长到50cm左右时，十字交叉法测量菌落直径，并通过以下公式计算抑制率。
结果：
如表4所示：T2-10发酵液除了对核盘菌的抑菌活性较差外，对其它8种病原真菌均有较强的抑制效果，对菌丝生长的抑制率均在50%以上；其中，对和谷镰刀菌、辣椒疫霉、茄链格孢和匍枝根霉的菌丝生长抑制率菌在60%以上。
表4  T2-10对9种植物病原菌的抑制作用

Claims (7)

1.链霉菌(Streptomyces sp.)T2-10 CGMCC 7449。
2.用权利要求1所述的链霉菌生产广谱杀虫和抗菌活性物质的用途。
3.一种生产杀虫、抗菌活性物质的方法，将权利要求1所述的链霉菌接种到液体筛选培养基中培养，得到活性物质。
4.权利要求3所述的方法，所述液体筛选培养基包括碳源、氮源、无机盐和水；所述碳源选自燕麦粉、淀粉、黄豆饼粉、大米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖中一种或几种；所述氮源选自酵母粉、蛋白胨、硝酸钾、酪蛋白、牛肉膏中一种或几种；所述无机盐选自NaCl、K2HPO4、MgSO4或CaCO3中一种或几种。
5.权利要求4所述的方法，所述碳源及在液体筛选培养基中的终浓度是：淀粉10g/L、黄豆饼粉5g/L、葡萄糖5g/L；所述氮源是终浓度为5g/L的酵母粉。
6.权利要求4所述的方法，在液体筛选培养基中所述NaCl的终浓度为1.0g/L，K2HPO4的终浓度为1.0g/L，MgSO4的终浓度为0.5g/L，CaCO3的终浓度为3.0g/L。
7.权利要求3所述的方法，所述链霉菌的接种量为105～107个孢子/mL培养基，培养温度是25～29℃，培养方式是150～260rpm振荡培养2～5天或静置培养3～10天。
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