CN109749954B

CN109749954B - 一株变异链霉菌、其菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109749954B
Application number: CN201811469014.2A
Authority: CN
Inventors: 咸洪泉; 李雅华; 崔德杰; 吕萌
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109749954A

Abstract

本发明公开了一株变异链霉菌，还涉及发酵培养基、菌剂制备方法和在防治土传植物真菌病害等方面的应用；所述变异链霉菌为变异链霉菌qnsv4，其保藏编号是：CGMCC No.16673。其中，所述变异链霉菌在高氏一号培养基上培养，菌落灰白色，革兰氏阳性，气生菌丝成熟后发育成孢子丝，孢子丝呈螺旋形，2‑8个螺旋，多为4‑6个螺旋，孢子球形至卵圆形；可在pH 6～9、0.5g/L～22g/L氯化钠环境中生长，耐盐碱，适应性强。上述变异链霉菌能有效抑制棉花枯黄萎病病原菌、花生白绢病菌、花生根腐病菌等植物土传病原真菌的生长，还具有一定的促进作物生长和增产作用，也有利于保护环境，经济效益和社会效益显著。

Description

一株变异链霉菌、其菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物和植物病害生物防治领域，尤其涉及一株变异链霉菌、其菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

植物土传真菌病害是一类难防治的重要植物病害，其病原真菌种类众多，如镰刀菌属、小菌核属、轮枝菌、核盘菌属、丝核菌属等，它们生活在土壤中以土壤等为媒介进行传播，条件适宜时侵染植物根或茎，引起植物的枯萎病、黄萎病、白绢病、根腐病等植物病害。尤其是各种植物枯萎病、黄萎病、根腐病等病害，如棉花的枯黄萎病、花生的根腐病和白绢病等，往往导致植株大量死亡，造成作物的严重减产、甚至绝收，给农业生产带来巨大损失。

目前植物土传真菌病害的防治措施主要有轮作、选育抗性品种、土壤熏蒸、和化学农药。由于土壤条件和集约化种植等条件的影响，轮作推广困难；土壤熏蒸成本高并破坏土壤微生态平衡，制约了该技术的应用；选育抗性品种因种质资源材料匮乏等问题而进展缓慢；长期使用化学农药容易造成农药残留超标、病原菌抗药性增强和环境污染等问题。生物防治因其经济有效、防效持久、环境友好和无药物残留等特点，已成为当前防治植物土传真菌病害的一种重要方法和手段。

植物病害的生物防治直接应用的微生物主要有：芽孢杆菌、假单胞菌等细菌，哈茨木霉、康宁木霉等真菌；有关直接利用放线菌防治植物病害相对较少。因此，如何筛选并获取高效防治植物土传真菌病害的放线菌菌种及其培养技术是植物病害生物防治研究应用需要解决的重要问题，对于丰富生防菌资源、植物土传真菌病害生物防治和植物病害的绿色防控具有重要意义。

发明内容

针对现有植物土传真菌病害防治技术成本高或破坏土壤生态环境、实施应用困难、田间防效不理想等问题，本发明提供了一株可有效防治多种土传植物真菌病害的变异链霉菌，还涉及其发酵培养、菌剂制备方法和在抑制土传植物病原菌、防治土传植物真菌病害等方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种变异链霉菌，为变异链霉菌qnsv4，其保藏编号是： CGMCCNo.16673。该变异链霉菌qnsv4分离自盐碱地土壤。

进一步地，所述变异链霉菌qnsv4具有以下生物学特性：为革兰氏阳性，菌丝纤细、无隔、多核、分枝，在高氏一号培养基上培养菌落为灰白色，菌丝分化成基内菌丝和气生菌丝；气生菌丝发达，气生菌丝成熟后发育成孢子丝，孢子丝呈螺旋形，具有2-8个螺旋，多为4-6个螺旋，孢子球形至卵圆形；明胶液化试验、硝酸盐还原试验、纤维素水解试验、淀粉水解试验和牛奶凝固胨化试验结果都为阳性；H₂S产生实验和黑色素产生实验都为阴性；能够利用D- 葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、肌醇、D-甘露醇、D-半乳糖、蔗糖、棉子糖，但qnsv4菌株利用棉子糖能力较弱，可在pH 6～9、 0.5g/L～22g/L氯化钠环境中生长，耐盐碱，适应性强。

本发明还提供一种用于培养所述变异链霉菌qnsv4的固体培养基，所述固体培养基包括固体基质、碳源、氮源和无机盐；其中，

固体基质包括玉米粉、大米粉、黄豆粉、小米粉、麸皮中的一种或几种；

碳源包括可溶性淀粉、蔗糖、糊精、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、果糖中的一种或几种；

氮源包括蛋白胨、酵母膏、黄豆饼粉、尿素、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵中的一种或几种；

无机盐包括硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸钙中的一种或几种；

培养基的初始pH6～9，料水质量比10:6～10:18。

优选地，所述的固体培养基，包括以下质量份数的各种组分：100份的大米粉、4份的可溶性淀粉、6份的黄豆饼粉、0.2份的硫酸镁；培养基的初始 pH为8.0，料水比为10:12。

本发明还提供一种如上所述的变异链霉菌的菌剂的制备方法，所述制备方法采用液固双相培养，包括以下具体步骤：

(1)将变异链霉菌qnsv4的初级种子液按照3％接种量接种于盛有高氏一号液体培养基的发酵罐中进行培养，发酵2.5-3.5d，获得扩大培养的二级种子液；其中，培养条件为：25-30℃、pH为7～8、通气量(V/V·min)0.8- 1.5:1、搅拌速度150-250转/min；

(2)将二级种子液与上述固体培养基按照14％的体积重量比混拌均匀，用 pH 8.0的无菌水调节最终料水比为10:12，于培养室进行浅盘发酵，铺料厚度 3-5cm，28℃发酵培养5～10d；优选地为8d。

(3)发酵结束后，对发酵产物进行35℃加热干燥，再向其中加入灭菌的麸皮作为填充料，调节变异链霉菌活菌数为1×10⁹cfu/g，得到菌剂。

优选地，所述的菌剂的制备方法中，步骤(1)的培养条件为：28℃、pH 至7.4、通气量(V/V·min)1:1、搅拌速度180转/min。这种条件最适于所述菌种的大量繁殖，菌体的生长速率最快，得到的菌体量最多。

本发明还提供一种变异链霉菌的菌剂，所述菌剂采用上述制备方法制取。

本发明还提供上述变异链霉菌菌剂在防治土传植物病原真菌病害中的应用，有效活菌为1×10⁹cfu/g的变异链霉菌的菌剂施用量为3kg/亩～7kg/ 亩，播种前混土均匀施用。

优选地，有效活菌为1×10⁹cfu/g的变异链霉菌的菌剂施用量为5kg/ 亩。

本发明还提供变异链霉菌在防治土传植物病原真菌病害中的应用。

优选地，所述植物为棉花、花生。所述变异链霉菌对棉花和花生土传病原真菌病害的防治效果最佳。

优选地，病原真菌包括：尖孢镰刀菌萎蔫专化型Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum；大丽轮枝菌Verticillium alboatrum；茄类镰孢 Fusarium solani；齐整小核菌Sclerotium rolfsii。本发明的变异链霉菌对上述病原真菌具有很好的抑菌效果，可以应用于防治这些病原真菌导致的植物病害。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供的变异链霉菌适应性强，耐盐碱能力强，能广泛应用于不同环境中的土传植物真菌病害的防治，在户外条件下存活能力强，持效时间长。

2.本发明提供的变异链霉菌能有效抑制棉花枯黄萎病病原菌、花生白绢病菌、花生根腐病菌等植物土传病原真菌的生长。此外，施用所述变异链霉菌不但能有效防治棉花枯黄萎病、花生根腐病等土传植物真菌病害，还具有一定的促进作物生长和增产作用，也有利于保护环境，经济效益和社会效益显著。

3.本发明提供的变异链霉菌用固体培养基，配方简单、原料成本低，菌株培养速度快，能很大程度的降低变异链霉菌菌剂的生产成本，有利于菌剂的扩大生产和应用。

附图说明

图1，变异链霉菌qnsv4对棉花枯萎病菌的抑制作用；其中，A为培养7 天的棉花枯萎病菌(CK)；B为棉花枯萎病菌平板上接种放线菌qnsv4培养7 天，放线菌qnsv4形成的抑菌圈；C为棉花枯萎病菌平板上接种放线菌qnsv4 培养21天，放线菌qnsv4形成的抑菌圈；

图2，变异链霉菌qnsv4在高氏一号平板上的培养特征；

图3，变异链霉菌qnsv4在光学显微镜下的菌丝形态；

图4，变异链霉菌qnsv4在氯化钠含量不同的高氏一号培养基中的生长曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1：拮抗放线菌的分离筛选

研究所用的培养基为高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，水 1000ml，调节pH至7.6，121℃灭菌20min。

采集山东东营市盐碱地棉花田和花生田土壤，采用10倍系列梯度稀释分离法从盐碱地土壤中用高氏一号平板进行放线菌分离，通过划线法纯化。分别将棉花枯萎病菌(尖孢镰刀菌萎蔫专化型，Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum)、棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌，Verticillium alboatrum)、花生根腐病菌(茄类镰孢，Fusarium solani)、花生白绢病菌(齐整小核菌，Sclerotium rolfsii)、立枯病菌(立枯丝核菌，Rhizoctonia solani)等土传植物病原真菌接种于PDA斜面上28℃恒温培养，制备含菌量1×10⁶～ 1×10⁷cfu/mL的菌悬液；将病原真菌菌悬液按培养基与菌悬液体积比10:1的比例，与45℃-50℃融化的PDA培养基混合均匀，分别制备含不同病原真菌的平板。将分离的放线菌点接于含菌平板中央，28℃倒置培养，通过抑菌圈筛选具有生防潜能的土传植物真菌病害拮抗放线菌菌株。

经过分离筛选，从东营盐碱地棉花田土壤中获得1株放线菌菌株qnsv4，放线菌qnsv4菌株对孢镰刀菌萎蔫专化型、大丽轮枝菌、茄类镰孢、齐整小核菌均具有明显的生长抑制作用(见表1)。并且随着培养时间的延长，放线菌 qnsv4继续生长并不断向外围扩展，与放线菌菌落交界处的病原真菌菌丝消解，病原菌菌苔逐渐萎缩、消失，直至放线菌蔓延到整个平板(见图1)。

表1 培养7天放线菌qnsv4在含病原菌平板上形成的抑菌圈直径

实施例2、拮抗菌的鉴定

1、拮抗菌的培养特征和形态学鉴定

参照李其利的文献(李其利.链霉菌JK-1的鉴定及其防病潜能和防病机制的研究[D].湖北:华中农业大学,2011.29～30)分别配制高氏一号琼脂、无机盐淀粉琼脂培养基(IPS4)、酵母提取物麦芽糖琼脂(IPS2)、甘油天冬氨酸琼脂培养基(IPS5)、燕麦琼脂培养基(IPS3)、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)，参照阮继生的文献(阮继生，放线菌分类基础，北京：科学出版社,1977年出版，142)配制马铃薯块和营养琼脂培养基。

将qnsv4分别接种到上述培养基中，28℃的恒温培养箱内培养7-14天以后，观察其培养特征。观察的内容包括在培养基的背面观察培养基内是否有可溶性的色素、色素的颜色和基内菌丝的颜色；在正面观察气生菌丝的颜色。

在高氏合成一号培养基上qnsv4菌落小、致密、圆形、放射状、不透明，表面干燥、由污白色逐渐变成灰色、粉末状，不产生可溶性色素。qnsv4接种在不同培养基上，培养特征略有差异(表2)。qnsv4菌株在上述培养基上均生长良好，可以利用多种不同底物。

表2 qnsv4在不同培养基上的培养特征

将放线菌qnsv4划线接种到高氏一号平板上，将无菌盖玻片与接种线垂直以45°角插入到培养基。28℃恒温培养7-14天以后，用镊子小心地取出盖玻片，用沾有乙醇的棉棒擦去一侧的菌体，在火焰的上方固定2-3秒，放置在载玻片上，用低倍镜、高倍镜在不同层面上显微观察其基内菌丝、气生菌丝、孢子丝的形态特征，进行形态学鉴定；进一步进行革兰氏染色观察。

qnsv4在高氏一号培养基上培养，具有典型的链霉菌属特征。培养7天后，挑取菌丝，制作涂片，40倍下进行镜检，发现该菌气生菌丝菌丝体发达，革兰氏阳性，菌丝纤细、无隔、多核、分枝，分化成基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝成熟后发育成孢子丝，孢子丝呈螺旋形，2-8个螺旋，多为4-6个螺旋，孢子球形至卵圆形(见图2和图3)。

2、生理生化特性分析

参照阮继生的方法(阮继生，放线菌分类基础，北京：科学出版社,1977 年出版：23～24、143～144)进行qnsv4菌株碳源利用试验(葡萄糖、D-蔗糖、L-阿拉伯糖、木糖、D-甘露醇、肌醇、鼠李糖、棉子糖、D-果糖、D-半乳糖)、明胶液化试验、纤维素水解试验、硫化氢产生试验、黑色素产生试验；参照中国科学院微生物研究所的方法(中国科学院微生物研究所放线菌分类组，链霉菌鉴定手册，北京：科学出版社,1975年出版，664～665)进行硝酸盐还原实验。

生理生化特性鉴定试验结果表明，qnsv4菌株明胶液化、硝酸盐还原、纤维素水解、淀粉水解和牛奶凝固胨化试验为阳性；H₂S产生、黑色素产生实验为阴性；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、L-鼠李糖、肌醇、D- 甘露醇、D-半乳糖、蔗糖、棉子糖；但qnsv4菌株利用棉子糖能力较弱(表3)。

表3 qnsv4的生理生化特征

注：+代表阳性，-代表阴性。

变异链霉菌的耐盐性测定：制备含氯化钠分别为0.5g/L、2g/L、6g/L、 10g/L、14g/L、18g/L、22g/L的高氏一号液体培养基，取10⁷cfu/mL的变异链霉菌种子液200μL分别接种于50mL上述培养基中，130r/min、28℃培养，每隔24h分别取出含不同氯化钠变异链霉菌培养液3瓶，真空抽滤收集菌体，在105℃烘箱中烘至恒重，称量菌体的干重，计算出平均值。以培养时间作横坐标，干重为纵坐标，绘制菌体的生长曲线。研究发现在氯化钠0.5g/L～10g/L范围内对变异链霉菌生长没有明显影响；当氯化钠大于10g/L，随盐度升高，适应期延长，生长速率相对有所下降，生长受到一定影响，但是在氯化钠达到22g/L时仍能继续较好生长(图4)。这表明变异链霉菌具有较强的盐耐受性，具有潜在的盐碱地应用开发前景。

3、拮抗菌的分子鉴定

挑取qnsv4菌株单菌落接种于高氏一号液体培养基中28℃、200rpm振荡培养18h，采用DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司生产)提取其基因组。

利用下述通用引物进行16S rRNA基因的PCR扩增：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO:1)

1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:2)

PCR反应体系(50μL)：

细菌基因组DNA	2.0μL
		TaqDNA聚合酶(5U/μL)	0.5μL
dNTPs(2mmol/L)	4μL
		引物27F(10μM)	2μL
引物1492R(10μM)	2μL
		10×PCR buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	34.5μL

PCR反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性0.5min、51℃退火0.5min、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，切胶回收目的条带，与pMD18-Tvector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR鉴定筛选阳性克隆测序，测序由上海生工生物工程有限公司完成。

测序获得1039bp的16S rDNA序列，如SEQ ID NO:3所示(具体见序列表)，序列如下：

登录NCBI和RDP两个数据库，进行BLAST搜索 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝B lastSearch&LINK_LOC＝blasthome)和Sequence Match搜索 (http://rdp.cme.msu.edu/seqmatch/seqmatch_intro.jsp)，获得相似性较高的相关菌株16S r RNA基因序列信息和登录号。该序列与模式菌株 Streptomyces variabilis(T)NRRL B-3984T的16S ribosomal RNA gene(DQ442551)的序列相似性为100％。

结合菌株的形态学特征、培养特征和基因序列比对结果，最终将菌株qnsv4鉴定为变异链霉菌(Streptomyces variabilis)。将筛选到的变异链霉菌(Streptomycesvariabilis)qnsv4于2018年11月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO: 16673，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

实施例3、变异链霉菌qnsv4的固体发酵

1、固体发酵培养基的配置

本实施例提供一种专用于培养所述变异链霉菌qnsv4的固体培养基，所述固体培养基包括固体基质、碳源、氮源和无机盐；其中，固体基质包括玉米粉、大米粉、黄豆粉、小米粉、麸皮中的一种或几种；碳源包括可溶性淀粉、蔗糖、糊精、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、果糖中的一种或几种；氮源包括蛋白胨、酵母膏、黄豆饼粉、尿素、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵中的一种或几种；无机盐包括硫酸镁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸钙中的一种或几种。

其中，可溶性淀粉的添加量(质量)为固体基质质量的4％～6％，黄豆饼粉的添加量为固体基质质量的2-6％，硫酸镁的添加量为固体基质质量的0.1- 0.3％，菌株的接种量为固体基质质量的6-22％(加入10⁷cfu/mL的种子液)。培养基的初始pH6～9，料水质量比10:6～10:18。

优选的实施例中，所述的固体培养基包括以下质量份数的各种组分：100 份的大米粉、4份的可溶性淀粉、6份的黄豆饼粉、0.2份的硫酸镁；培养基的初始pH为8.0，料水比为10:12。此条件下培养得到的变异链霉菌活菌数最多，达到2.81×10¹⁰cfu/g。

2、发酵周期

向大米粉中加入大米粉质量4％的可溶性淀粉、6％的黄豆饼粉、2‰的硫酸镁，料水比10:12，初始pH8.0，配制发酵固体培养基灭菌，接种14％变异链霉菌种子液。28℃培养，从第五天开始取样，平板菌落计数法测定统计不同发酵时间的变异链霉菌活菌数。不同发酵时间变异链霉菌活菌数如表4所示，第8 天变异链霉菌活菌数最多，所以固体发酵培养发酵最佳周期为8天。

表4不同培养时间对变异链霉菌活菌数的影响

实施例4、变异链霉菌菌剂的制备方法

本实施例采用液固双相发酵方法制备变异链霉菌菌剂，具体步骤如下：

变异链霉菌种子的扩大培养：变异链霉菌在高氏一号固体培养基上28℃活化、培养7d，接种于灭菌的高氏一号液体培养基中，200转/分钟，振荡培养 60h作为种子；在15L全自动机械搅拌发酵罐中按3％接种量接种于高氏一号液体培养基中，发酵过程中控制条件为28℃、pH至7.4、通气量(V/V·min) 1:1、搅拌速度180转/min，发酵3d。

菌剂制备方法：利用实施例3配置的固体发酵培养基进行变异链霉菌固体发酵培养，固体发酵培养基固体成分组成为大米粉，并加入大米粉质量4％的可溶性淀粉、6％的黄豆饼粉、2‰的硫酸镁。将扩大培养的种子液与固体发酵培养基组分按体积重量比14％比例的混拌均匀，用pH 8.0的无菌水调节最终料水比为10:12，于培养室浅盘发酵，铺料厚度3-5cm，28℃培养8d，35℃加热干燥，根据干燥后变异链霉菌活菌数，加入灭菌的麸皮作为填充料，调节变异链霉菌活菌数1×10⁹cfu/g。

实施例5、变异链霉菌对棉花枯黄萎病的防治效果

田间试验分别设在中壤土(济宁)和中度盐碱土(博兴)的历年棉花枯黄萎病发生较重的棉花连作田，试验设A、B、C、CK 4个处理；播种前混土施用，A处理为制剂3kg/亩、B处理为制剂5kg/亩，C处理为制剂7kg/亩、CK 为对照；棉花品种为鲁棉研37，大垄双行覆膜，播种密度4000株/亩，小区面积100m²，随机排列，3次重复。

棉花枯黄萎病病害调查采用“GB/T17980.92-2004农药田间药效试验准则 (二)第92部分杀菌剂防治棉花黄、枯萎病”中的棉花枯黄萎病病害调查方法及分级标准。

中壤土(济宁)试验结果见表5、表6。菌剂处理对棉花枯黄萎病均具有良好的防治效果，其中制剂5kg/亩处理，对棉花枯、黄萎病防治效果分别达到 81.9％和56.65％以上。与对照比，处理组棉花株高、单铃重增加，衣份基本不受影响；处理组籽棉、皮棉产量增加，其中制剂3kg/亩处理增产效果最好。

表5 不同生防菌剂对棉花枯黄萎病防治效果(济宁)

表6 不同生防菌剂处理对棉花生育指标及产量的影响(济宁)

中度盐碱土(滨州博兴)棉花黄萎病未发生，防治棉花枯萎病试验结果见表7、表8。3个处理对棉花枯萎病防治效果均在80％以上，防效显著；菌剂处理对棉花株高、单铃重、产量增加，增产籽棉均在20％以上。但是对照成铃数最多，可能是对照前期发病较重，大量死亡，对照组未发病的植株获得的光照、营养充足，导致成铃数增加。

表7 不同生防菌剂对棉花枯萎病防治效果(博兴)

表8 不同生防菌剂处理对棉花生育指标及产量的影响(博兴)

综合2个点的试验结果，变异链霉菌处理对棉花枯黄萎病表现出良好的防病增产效果，其中B处理对棉花枯黄萎病综合防效较好，对枯萎病防效达80％以上，对黄萎病防效达50％以上；并且具有明显的促进棉花的生长、增加单铃重作用。

实施例6、变异链霉菌对花生土传病害的防治效果

田间试验设在山东莱西历年根腐病和白绢病发生较重的花生连作田，试验设A、B、C、CK 4个处理；播种前混土施用，A处理为制剂3kg/亩、B处理为制剂5kg/亩，C处理为制剂7kg/亩、CK为对照；花生品种为花育22号，大垄双行覆膜，小区面积100m²，随机排列，3次重复。花生苗期至成熟期调查统计花生根腐病发病率，花生荚果膨大至成熟期调查花生白绢病发病率。

发病率(％)＝发病株数/调查总株数×100

防治效果(％)＝(对照发病株数－处理发病株数)/对照发病株数×100

试验结果表明，变异链霉菌处理对花生根腐病和白绢病具有较好的防治效果，变异链霉菌制剂5kg/亩防治根腐病和白绢病效果可达到60％以上，平均增产荚果10％以上(表9)。

表9 生防菌剂不同处理对花生土传病害的防治增产效果(莱西)

综上所述，本发明提供的变异链霉菌qnsv4能有效防治棉花枯黄萎病、花生根腐病等土传植物真菌病害，还具有一定的促进作物生长和增产作用，也有利于保护环境，经济效益和社会效益显著，具有广阔的应用前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株变异链霉菌、其菌剂及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1039

<212> DNA

<213> 变异链霉菌qnsv4 的16S rDNA (16S rDNA of Streptomyces variabilisqnsv4)

<400> 3

gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaacctc cttcgggagg 60

ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg ccctgcactc tgggacaagc 120

cctggaaacg gggtctaata ccggatactg acccgcttgg gcatccaagc ggttcgaaag 180

ctccggcggt gcaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtgaggta atggctcacc 240

aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa agcctgatgc 360

agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag cagggaagaa 420

gcgaaagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta 480

atacgtaggg cgcgagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt aggcggcttg 540

tcacgtcggt tgtgaaagcc cggggcttaa ccccgggtct gcagtcgata cgggcaggct 600

agagttcggt aggggagatc ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga 660

ggaacaccgg tggcgaaggc ggatctctgg gccgatactg acgctgagga gcgaaagcgt 720

ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacggtgg gcactaggtg 780

tgggcgacat tccacgtcgt ccgtgccgca gctaacgcat taagtgcccc gcctggggag 840

tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat 900

gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca ccggaaagca 960

tcagagatgg tgcccccctt gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg 1020

tgtcgtgaga tgttgggtt 1039

Claims

1.一种变异链霉菌(Streptomyces variabilis)，其特征在于，为变异链霉菌(Streptomyces variabilis)qnsv4，其保藏编号是：CGMCC No.16673。

2.一种培养如权利要求1所述的变异链霉菌的固体培养基，其特征在于，包括以下成分：固体基质、碳源、氮源和无机盐；培养基的初始pH6～9，料水质量比10:6～10:18；

其中，固体基质为大米粉；

碳源为可溶性淀粉；可溶性淀粉的添加量为固体基质质量的4％～6％，

氮源为黄豆饼粉；黄豆饼粉的添加量为固体基质质量的2-6％，

无机盐为硫酸镁；硫酸镁的添加量为固体基质质量的0.1-0.3％，菌株的接种量为固体基质质量的6-22％。

3.一种如权利要求1所述的变异链霉菌的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)将变异链霉菌qnsv4的初级种子液按照3％接种量接种于盛有高氏一号液体培养基的发酵罐中进行培养，发酵2.5-3.5d，获得扩大培养的二级种子液；其中，培养条件为：25-30℃、pH为7～8、通气量(0.8-1.5):1V/V·min、搅拌速度150-250转/min；

(2)将二级种子液与权利要求2所述的固体培养基按照14％的体积重量比混拌均匀，用pH 8.0的无菌水调节最终料水比为10:12，于培养室进行浅盘发酵，铺料厚度3-5cm，28℃发酵培养5～10d；

4.根据权利要求3所述的变异链霉菌的菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)的培养条件为：28℃、pH至7.4、通气量1:1V/V·min、搅拌速度180转/min。

5.一种变异链霉菌的菌剂，其特征在于，采用如权利要求4所述的制备方法制取。

6.如权利要求5所述的变异链霉菌菌剂在防治土传植物病原真菌病害中的应用，其特征在于，有效活菌为1×10⁹cfu/g的变异链霉菌菌剂的施用量为3kg/亩～7kg/亩，播种前混土均匀施用；病原真菌为：尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporumf.sp.vasinfectum)；大丽轮枝菌(Verticillium alboatrum)；茄类镰孢(Fusariumsolani)；齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。

7.根据权利要求1所述的变异链霉菌在防治土传植物病原真菌病害中的应用，其特征在于，所述植物为棉花、花生。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，病原真菌为：尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)；大丽轮枝菌(Verticillium alboatrum)；茄类镰孢(Fusarium solani)；齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。