CN101899098B

CN101899098B - 一种环脂肽类化合物Maribasin B制备及其应用

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Publication number: CN101899098B
Application number: CN201019063051.8A
Authority: CN
Inventors: 李元广; 张道敬; 刘荣峰; 罗远婵; 魏鸿刚; 李淑兰; 陶黎明; 田黎; 沈国敏
Original assignee: ZEYUAN MARINE LIFE TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI; East China University of Science and Technology
Current assignee: ZEYUAN MARINE LIFE TECHNOLOGY Co Ltd SHANGHAI; East China University of Science and Technology
Priority date: 2010-02-08
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2030-02-08
Also published as: WO2011095082A1; CN101899098A

Abstract

本发明提供了海洋芽孢杆菌B-9987所产生的一种新的脂肽类化合物Maribasin B。本发明还涉及所述化合物Maribasin B的制备方法以及该化合物作为农药的应用。

Description

一种环脂肽类化合物Maribasin B制备及其应用

技术领域

本发明涉及源于渤海潮间带植物盐地碱蓬(Suaeda salsa)的海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987产生的具有拮抗植物病原菌活性的新的环脂肽化合物Maribasin B及其制备方法和在农药方面的应用。

背景技术

由于海洋生物生活在一定的水压、高盐度、小温差、有限的溶解氧、有限的光照及化学缓冲海水体系，故其新陈代谢、生存繁殖方式、适应机制具有不同于陆地生物的显著特性，海洋生物能够产生大量的结构新颖的活性代谢产物，其中许多已经开发成产品。如从海洋真菌顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)中分离并成功上市的第一个海洋新抗生素——头孢菌素。沙蚕毒素是日本人从动物沙蚕的提取物发明的一种杀虫剂。

海洋芽孢杆菌能产生许多有价值的物质。Carisse等(2003年)从堆肥中(包括造纸厂淤泥、植物残体等成分)分离出海洋芽孢杆菌，平板拮抗实验和盆栽试验均表明其对黄瓜猝倒病菌——终极腐霉(Pythium ultimum)的生长有较强抑制作用。张海龙等(2004年)从海洋芽孢杆菌中发现了3个新的环脂肽化合物MixirinA-C，它们具有细胞毒活性。Ashish等(2006年)发现海洋芽孢杆菌产的纤维素酶在pH 6和50℃时活性较好。Noureddin等(2006年)发现海洋芽孢杆菌可以产葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶。田黎等(2007年)报道了一株海洋芽孢杆菌B.marinus B-9987产生的3个新的大环内酯类化合物Macrolactin O、P和Q，研究发现，这3个新化合物对交链孢和稻瘟霉具有很好的抑制活性。此外，还发现含有该类物质的海洋芽孢杆菌B.marinus B-9987发酵浓缩液可有效地抑制植物病原菌的生长。海洋芽孢杆菌因其具有抑菌作用强、抗逆性强及易于加工成剂型等诸多优势，十分适合于开发成微生物农药。发明人所在课题组已成功研发的10亿CFU/g海洋芽孢杆菌可湿性粉剂作为农药非常安全，属微毒类农药，初步的盆栽和田间小区试验结果表明该可湿性粉剂对灰霉病、白粉病、青枯病、软腐病、早疫病、霜霉病具有较好的防治效果(中国发明专利公开号：CN101331881)。

脂肽类物质主要来源于微生物的次级代谢产物，由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成，分为线性脂肽和环状脂肽两大类。由于其特殊的两亲分子结构造就了微生物脂肽具有优良的表面活性，在医药、食品、化妆品、生物防治、环境治理及微生物采油等领域具有重要的应用前景。

环脂肽类化合物多数具有抗菌活性，其中最为成功的例子是达托霉素，它是第一个应用于临床的环脂肽类抗生素，用于治疗由革兰阳性菌感染所致的并发性皮肤及皮肤感染，包括甲氧西林耐药菌金葡菌及对万古霉素抗性的粪肠球菌，作用机制独特。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类重要的根际微生物，能够促进植物抵抗病原菌的侵染，因而被广泛应用于植物病害的生物防治。B.subtilis能够产生几十种不同结构的抗生素，其中非核糖体合成的脂肽类抗生素是其中最常见的一类，主要包括iturin、surfactin和fengycin3个家族。脂肽类抗生素由氨基酸链和脂肪酸侧链组成，稳定性好，对人畜无害，不污染环境，是具有重要开发价值的新型生物源农药。国外有报道iturin成功应用于生物防治的例子(KlichMA，1994年)。

Catherine等(2001年)发现脂肽类生物表面活性剂能选择性除去土壤中的Pb、Zn、Cu和Cd等金属离子，其中Cu²⁺最易去除。

黄现青等(2006年)研究发现，枯草芽孢杆菌fmbJ株产生的抗微生物脂肽可以直接作用于体外抗伪狂犬病病毒(Pseudorabies viru)和猪细小病毒(Porcine parvoviru)南京株，从而抑制其对猪肾(Porcine Kidney)细胞的感染作用。

Kim等(2007年)研究发现，环脂肽Surfactin(MW 1036)能够抑制Lovo细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其作用机制可能为抑制细胞生存调节信号通路ERK和PI3K/Akt。

王大威等(2008年)研究发现，从大庆油田中分离到的一株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ZW-3产生的脂肽类生物表面活性剂具有优良的乳化和降低油水界面张力的能力，并可以适应油藏中复杂的环境，可提高采收率9.2％，在微生物采油中具有非常好的应用前景。

薛春美等(2008年)报道从海洋芽孢杆菌中分离得到了Macrolactin T和U以及已知结构Macrolactin A、B、D、O、S，其中Macrolactin T、B、D对稻瘟病菌、番茄早疫病菌及金黄色葡萄球菌具有拮抗作用。

发明内容

本发明者经过研究发现，由海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987产生的1个新环脂肽化合物Maribasin B对番茄早疫病菌(Alternaria solani)和香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cuberse)等植物病原菌均具有很好的抑制活性，因此可以用作农药来防治由这些病原菌引起的植物病害。

本发明的目的在于提供海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987产生的一个新的具有应用价值的环脂肽化合物及其制备方法和应用。具体地说，本发明第一方面提供具有新结构环脂肽化合物Maribasin B，所述化合物结构如附图所示。

当用于本发明时，术语″本发明的化合物″或类似术语的含义不仅包括了上述结构式所定义的化合物，还包括了它们的盐。所述盐可以是水溶、脂溶或可分散产物的形式，其可通过和无机酸或有机酸或碱反应形成。这些酸加成盐的例子包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、十二烷基磺酸盐、盐酸盐、草酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐。碱性盐包括铵盐，碱金属盐，如钠盐和钾盐，碱土金属盐，如钙盐和镁盐，有机碱的盐，如二环己胺盐等。

本发明的化合物也可以其互变异构形式存在。尽管未在这里描述的化合物中明确指出这些形式，但它们也包含在本发明的范围之内。除非另有说明，这里所述化合物的化学名包括所有可能的、所述化合物可包含的立体化学异构形式的混合物。所述混合物可含有所述化合物基础分子结构的所有非对映异构体和/或对映异构体。本发明化合物所有的立体化学异构形式可以是纯化形式，或者是相互混合的形式，这都包含在本发明范围之内。

本发明第二方面提供了一种制备上述化合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)培养海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987，得到发酵液；

(2)用选自有机溶剂萃取、酸沉淀、浸提或层析的方法从所述发酵液中分离获得所述化合物。

本发明方法所涉及的菌株为海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987，该菌株从渤海潮间带植物盐地碱蓬中分离得到，该菌株已于2007年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.2095，并公开于中国专利申请CN 101333206A中。

本发明所用的术语“发酵”或“培养”具有本领域技术人员通常熟知且承认的含义。所述“发酵液”或“培养液”可通过在适合生长的条件下培养本发明的海洋芽孢杆菌B.marinus B-9987，使其生长至一定的细菌浓度来获得。

用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其它营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麦皮、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其它有机或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐(如磷酸氢二钾和磷酸二氢钾等)、硫酸铵、硫酸锰、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等。在一个具体实施方案中，用于培养本发明菌株的培养基具有以下组成(％表示质量/体积)：葡萄糖0.1％～1％、蔗糖0.1％～2％、酵母粉0.01％～1.5％、蛋白粉0.1％～1％、MgCl₂ 0.001％～0.1％、KCl 0.01％～0.5％、KH₂PO₄ 0.01％～0.5％和NaCl 0.1％～6％、pH 6.0～7.0。然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。

培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。

在培养时可采用豆油、泡敌等消泡剂进行消泡。在一些较佳的实施方案中，pH宜控制在5.5～8.0之间，培养温度宜在20～35℃之间。培养时间通常在12h～200h之间，最终的菌浓度通常可高达5×10⁷cfu/ml～1×10¹¹cfu/ml。

在本发明的一个较佳的实施方案中，通过以下方法培养所述海洋芽孢杆菌来得到发酵液：在含有碳源、氮源、无机盐的培养基中，在通气量控制在气液比为0.2∶1～2∶1、转速在100r/min或以上，培养所述海洋芽孢杆菌24小时以上，其中所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉和大米粉中的1种或几种，所述氮源选自蛋白粉、酵母粉、花生饼粉和大豆粉中的1种或几种，所述无机盐包括常规的无机盐(如MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、KCl、KH₂PO₄、NaCl、K₂HPO₄和CaCO₃)。

上述列举的这些参数只是实现本发明的较佳方案。因此，本领域技术人员在上述范围以外选择合适的培养条件也能获得本发明的发酵液。

在获得了上述发酵液后，用选自有机溶剂萃取、酸沉淀、浸提或层析的方法从发酵液中分离获得目标化合物。本发明的化合物可以从发酵液的发酵清液中分离得到，也可以从发酵液中的菌体分离得到。在优选的实施方案中，也可分别从发酵清液(也称上清液或发酵上清液)和菌体中分离得到含本发明的化合物的粗品或浸提液，然后再进行进一步的分离纯化。

因此，作为本发明方法的一个优选方案，首先从所述发酵液分离得到上清液，用选自氯仿、乙酸乙酯、醋酸丁酯或正丁醇的溶剂萃取，然后用柱层析以氯仿/甲醇梯度洗脱，收集氯仿/甲醇为2∶1至0∶1的洗脱部位，用HPLC制备得到本发明所述的化合物。

从发酵液来分离上清液可采用常规的分离手段如离心过滤等。然后，在获得上清液后，一种可行的方式是用有机溶剂(例如，氯仿、乙酸乙酯、醋酸丁酯或正丁醇)进行萃取。优选的方案是采用有机溶剂的组合进行所述萃取，例如，依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃取；依次采用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取；依次采用醋酸丁酯和正丁醇进行萃取等。

另一个可行的方案是，先如上所述获得上清液，然后使上清液酸化沉淀，用无水甲醇对酸化沉淀浸提。具体地说，在上清液中加入酸(如盐酸)，使溶液静置，然后离心得到酸化沉淀和酸化上清液。在本申请的一个方案中，采用5N盐酸溶液进行酸化。本领域技术人员也可以适当地调整盐酸浓度同样可以得到酸化沉淀。随后，将酸化沉淀的pH调至中性后冷冻干燥，用无水甲醇浸提一次或多次，每次浸提时间为6-12小时。

还有一种可行的方式是采用诸如离心分离等常规手段从发酵液分离得到菌体。然后，用无水甲醇浸提所述菌体一次或多次，每次浸提时间6-12小时。

随后，用柱层析进行氯仿/甲醇梯度洗脱前述步骤得到的正丁醇萃取活性部位或无水甲醇浸提物，收集氯仿/甲醇为2∶1至0∶1的洗脱部位(优选氯仿/甲醇1∶1的洗脱部位)。所用的柱层析例如可以是硅胶柱层析。最后，用Sephadex LH-20和/或HPLC(分析和制备条件均为70％甲醇水溶液)等制备获得所述化合物。

然而，本领域技术人员应当理解，完全能够根据常规技术采用其它的分离手段、溶剂或洗脱剂来分离得到本发明的化合物。因此，本发明方法的范围并不局限于说明书实施例中所用的具体方法。

本发明另一方面提供了一种农药组合物，其特征在于，所述组合物包含本发明所述的化合物作为活性组分，以及农药学上可接受的载体。本发明的农药组合物可用于抑制番茄早疫病菌(A.solani)、甜瓜果腐病菌(F.oxysporum)、棉花黄萎病菌(V.alboatrum)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、白术白绢病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌(Penicillium sp.)、黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、玉米小斑病菌(D.turcica)、水稻纹枯病菌(R.solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)、香蕉枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cuberse)、番茄青枯病菌(R.solanacearum)和白菜软腐病菌(E.carotovora var.carotovora)等植物病原菌。

本发明的化合物或农业组合物可以直接以发酵液形式施用，也可将其适当稀释(例如稀释10倍、100倍、1000倍或更高)以稀释液形式施用。本发明的化合物或其组合物可以施加到植物的根、叶、茎等部位上。施加方法是本领域中的常规技术，例如可以是在播种时浸种，移栽前将植物根部浸在发酵液或其稀释液中，或者直接将发酵液或稀释液泼浇在苗床上。可定植时进行灌根，也可在植物生长过程中灌根。如果所述农药组合物是以载体形式保存的，则可在临用前用水稀释后再进行施加。至于本发明的最适施药剂量，本领域技术人员无需经过过多试验即可确定。

附图说明

附图所示结构图即为化合物Maribasin B的结构图。

具体实施方式

实施例1利用酸沉淀法从海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987发酵清液中分离得到新环脂肽化合物Maribasin B

本实施例通过常规的分离手段从海洋芽孢杆菌B.marinus B-9987的发酵液中获得了新的环脂肽化合物Maribasin B。具体分离纯化步骤如下：

(1)将海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987在合适的条件下培养得到30L发酵液。海洋芽孢杆菌B-9987菌种经平板活化后接种于一级种子摇瓶培养12-24h后作为一级种子，将该一级种子接种于二级种子摇瓶，培养12-24h后接种于50L发酵罐中。在28℃、300rpm下培养20h左右即可结束。

(2)30L发酵液4000rpm离心后得到发酵上清液和湿菌体。发酵上清液加5N盐酸溶液酸化并静置沉淀后离心(4000rpm)得到酸化沉淀和酸化上清液。将酸化沉淀pH调至7.0后冷冻干燥，得到冻干沉淀174.8g，用无水甲醇(440mL，220mL，220mL)依次浸提3次，每次浸提时间12小时，将浸提液合并减压浓缩至干，得到酸化沉淀浸提粗品共10.2g。将酸化沉淀浸提粗品经硅胶柱层析以氯仿/甲醇10∶1→0∶1梯度洗脱(500mL/流分)，对洗脱的流分进行生物活性检测，指示菌为番茄早疫病菌(A.solani)，结果显示抑菌活性物质主要集中在氯仿/甲醇1∶1和甲醇洗脱部位，且以氯仿/甲醇1∶1洗脱部位活性更强，将上述活性流分经TLC检测后合并。将合并后的活性流分经Sephadex LH-20柱层析以甲醇洗脱，对洗脱流分进行如上的生物活性检测，生物活性检测后的活性流分经TLC检测后合并。将合并后的活性流分经HPLC分析并制备(分析和制备条件均为70％甲醇水溶液)，最终制备得到化合物Maribasin B。

实施例2利用有机溶剂提取法从海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987菌体中分离得到新环脂肽化合物Maribasin B

本实施例通过常规的分离手段从海洋芽孢杆菌B.marinus B-9987菌体中获得了新的环脂肽化合物Maribasin B。具体分离纯化步骤如下：

(1)将海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987在合适的条件下培养得到30L发酵液(具体的培养条件和步骤同实施例1)。

(2)30L发酵液4000rpm离心后得到发酵上清液和湿菌体。湿菌体经过水洗离心后冷冻干燥，得到干菌体92.0g，用无水甲醇(600mL，300mL，300mL)依次浸提3次，每次浸提时间12小时，将浸提液合并减压浓缩至干得到菌体浸提粗品共17.3g。将菌体浸提粗品经硅胶柱层析以氯仿/甲醇10∶1→0∶1梯度洗脱(500mL/流分)，对洗脱的流分进行生物活性检测，指示菌为番茄早疫病菌(A.solani)，结果显示抑菌活性物质主要集中在氯仿/甲醇1∶1和甲醇洗脱部位，且以氯仿/甲醇1∶1洗脱部位活性更强，将上述活性流分经TLC检测后合并。将合并后的活性流分经Sephadex LH-20柱层析以甲醇洗脱，对洗脱流分进行生物活性检测，指示菌为番茄早疫病菌(A.solani)，生物活性检测后的活性流分经TLC检测后合并。将合并后的活性流分经HPLC分析并制备(分析和制备条件均为70％甲醇水溶液)，最终制备得到化合物Maribasin B。

实施例3利用有机溶剂萃取法从海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987发酵清液中分离得到新环脂肽化合物Maribasin B

本实施例通过常规的分离手段从海洋芽孢杆菌B.marinus B-9987的发酵清液中获得了新的环脂肽化合物Maribasin B。具体分离纯化步骤如下：

(1)将海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987在合适的条件下培养得到10L发酵液。海洋芽孢杆菌B-9987菌种经平板活化后接种于一级种子摇瓶培养12-24h后作为一级种子，将该一级种子接种于二级种子摇瓶，培养12-24h后接种于5L发酵罐中。在28℃、300rpm下培养20h左右即可结束。共发酵3个5L罐获得10L发酵液。

(2)10L发酵液4000rpm离心后得到发酵上清液和湿菌体。发酵上清液用等体积乙酸乙酯分别萃取3次，每次萃取时间12小时，将乙酸乙酯萃取相合并减压浓缩至原发酵液体积。再用等体积正丁醇对乙酸乙酯萃余相分别萃取3次，每次萃取时间12小时，将正丁醇萃取相合并减压浓缩至原发酵液体积。对上述乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相与萃余相进行生物活性检测，指示菌为番茄早疫病菌(A.solani)，确定正丁醇部位为主要抑菌活性部位。将正丁醇萃取相合并减压浓缩至干，得到正丁醇萃取物粗品共13.8g。将正丁醇萃取物粗品经硅胶柱层析以氯仿/甲醇10∶1→0∶1梯度洗脱(500mL/流分)，对洗脱的流分进行生物活性检测，指示菌为番茄早疫病菌(A.solani)，结果显示抑菌活性物质主要集中在氯仿/甲醇1∶1和甲醇洗脱部位，且以氯仿/甲醇1∶1洗脱部位活性更强，将上述活性流分经TLC检测后合并。将合并后的活性流分经Sephadex LH-20柱层析以甲醇洗脱，对洗脱流分进行生物活性检测，指示菌为番茄早疫病菌(A.solani)，生物活性检测后的活性流分经TLC检测后合并。将合并后的活性流分经HPLC分析并制备(分析和制备条件均为70％甲醇水溶液)，最终制备得到化合物Maribasin B。

实施例4新环脂肽化合物Maribasin B的结构鉴定和分析

(1)Maribasin B结构鉴定和分析

将实施例1获得的新的环脂肽化合物Maribasin B进行分析和鉴定，其结果如下：

Maribasin B化学结构如附图所示。其为无色固体粉末，UV254nm下有暗斑，碘蒸汽显色下呈黄色。mp＞250℃；IR(KBr)v_max(cm^-1)：3333，2929，2864，1659，1545，1449，1423，1247，1128。HRFAB-MS m/z 1079.5507[M+Na]⁺(calcd for C₄₉H₇₆N₁₂O₁₄)。¹H、¹³C NMR数据见表1。

表1 化合物Maribasin B的结构鉴定数据表(DMSO-d₆)

实施例5Maribasin B对植物病原菌的抑制作用

本实施例考察了实施例1获得的化合物Maribasin B对植物病原菌的抑制作用。

采用平板拮抗法考察Maribasin B对番茄早疫病菌(A.solani)、甜瓜果腐病菌(F.oxysporum)、棉花黄萎病菌(V.alboatrum)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、白术白绢病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌(Penicillium sp.)、黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、玉米小斑病菌(D.turcica)、水稻纹枯病菌(R.solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)和香蕉枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cuberse)等植物病原菌的抑制作用。

Maribasin B对植物病原菌的MIC如表2所示。

表2 Maribasin B对植物病原菌的抑制作用(μg/ml)

病原菌	MIC
		番茄早疫病菌(A.solani)	100
甜瓜果腐病菌(F.oxysporum)	＞200
		棉花黄萎病菌(V.alboatrum)	200
小麦赤霉病菌(F.graminearum)	200
		白术白绢病菌(Sclerotium sp.)	100
青霉病菌(Penicillium sp.)	100
		黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)	50
番茄灰霉病菌(B.cinerea)	100
		玉米小斑病菌(D.turcica)	100
水稻纹枯病菌(R.solani)	200
		瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)	50
香蕉枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cuberse)	100

从表2中可以看出Maribasin B对黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)和瓜炭疽病菌(Colletotrichumsp.)等植物病原菌具有较强的抑菌活性。

实施例6含有Maribasin B的海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987发酵液对植物病原菌的抑制活性

本实施例考察了含有本发明所述的化合物Maribasin B的海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987发酵液可有效抑制植物病原菌的生长。

本实施例采用平板拮抗法考察含有Maribasin B的海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987发酵液对植物病原菌的抑制作用。

病原真菌抑菌谱的测定：将于4℃斜面中保存的的植物致病真菌接于PDA平板在28℃的条件下活化培养大约一周，待真菌长满整个平板后结束培养，用已灭菌的直径为14.50mm的打孔器在活化的病原真菌菌落外缘打一菌饼，将菌饼正面向上放置于对峙培养平板的一侧，靠近皿壁约1cm，用接种针取1环培养获得的B-9987发酵液，在对峙平板内平行于菌块划一条菌线，划线距离视病原真菌的生长速度而定，将对峙培养平板放入28℃培养5d后记录抑菌带宽度。

病原细菌抑菌谱的测定：将培养24h的病原菌液混入相应半固体培养基中(使含菌平板达到10⁹cfu/mL)，然后倒在制备好的水琼脂平板上，冷却后在半固体平板中央打直径为14.00mm的孔，然后将B-9987发酵液加入孔中，每孔150μL，30℃培养24h后记录抑菌圈大小。其结果如表3所示。

表3 海洋芽孢杆菌B-9987发酵液对植物病原菌的抑制作用

病原菌	抑菌带(圈)/mm
		玉米小斑病菌(C.lunata)	11.00
黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)	12.00
		瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)	6.50
番茄早疫病菌(Alternaria sp.)	6.40
		烟草赤星病菌(A.alternate)	6.30
稻瘟病菌(P.grisea)	5.67
		香蕉枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.cuberse)	5.60
甜瓜枯萎病菌(F.oxysporum)	3.10
		小麦赤霉病菌(F.graminearum)	3.06
番茄青枯病菌(R.solanacearum)	23.0
		白菜软腐病菌(E.carotovora var.carotovora)	18.8

由表3的抑制活性可知，含有化合物Maribasin B的海洋芽孢杆菌(B.marinus)B-9987发酵液可有效地抑制植物病原菌的生长。

尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims

1.脂肽类化合物，所述化合物具有以下结构：

2.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)培养海洋芽孢杆菌(Bacillus marinus)B-9987，得到发酵液；

(2)用选自有机溶剂萃取、浸提或层析的方法从所述发酵液中分离获得所述化合物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括以下一个或多个步骤：

(a)从所述发酵液分离得到上清液，用选自氯仿、乙酸乙酯、醋酸丁酯或正丁醇的溶剂萃取，然后用柱层析以氯仿／甲醇梯度洗脱，收集氯仿／甲醇为2：1至0：1的洗脱部位，用SephadexLH-20和／或HPLC制备得到权利要求1所述的化合物；

(b)从所述发酵液分离得到上清液，使上清液酸化沉淀，用无水甲醇对酸化沉淀浸提，浸提液用柱层析以氯仿／甲醇梯度洗脱，收集氯仿／甲醇为2：1至0：1的洗脱部位，用SephadexLH-20和／或HPLC制备得到权利要求1所述的化合物；

(c)从所述发酵液分离得到菌体，用无水甲醇浸提，浸提液用柱层析以氯仿／甲醇梯度洗脱，收集氯仿／甲醇为2：1至0：1的洗脱部位，用Sephadex LH-20和／或HPLC制备得到权利要求1所述的化合物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述柱层析是硅胶柱层析。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述HPLC的制备条件均为70％甲醇水溶液。

6.一种农药组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的化合物作为活性组分，以及农药学上可接受的载体。

7.权利要求1所述的化合物在作为农药中的应用，所述农药用于抑制番茄早疫病菌(A.solani)、甜瓜果腐病菌(F.oxysporum)、棉花黄萎病菌(V.alboatrum)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、白术白绢病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌(Penicillium sp.)、黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、玉米小斑病菌(D.turcica)、水稻纹枯病菌(R.solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)和香蕉枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.cuberse)的植物病原菌。

8.一种防治植物病害的方法，其特征在于，将权利要求1所述的化合物或权利要求6所述的农药组合物施加到所述植物上，所述植物病害的病原菌选自番茄早疫病菌(A.solani)、甜瓜果腐病菌(F.oxysporum)、棉花黄萎病菌(V.alboatrum)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、白术白绢病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌(Penicillium sp.)、黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、玉米小斑病菌(D.turcica)、水稻纹枯病菌(R.solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)、香蕉枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.cuberse)。