CN104250621A - 一种海洋烬灰红链霉菌及其应用于制备橙酮化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海洋烬灰红链霉菌及其应用于制备橙酮化合物的方法。本发明的海洋烬灰红链霉菌为保藏号为CGMCC No.6922的海洋烬灰红链霉菌。本发明制备橙酮化合物的方法包括在适于本发明海洋烬灰红链霉菌发酵的培养条件下培养所述海洋烬灰红链霉菌。本发明还包括采用所述方法制备得到的橙酮化合物以及该化合物在杀虫、抗菌和除草活性的农药组合物中的应用，以及用于制备橙酮衍生物中的应用。使用本发明的方法，可通过发酵实现大规模生产，相比从植物中提取橙酮化合物更具有工业化生产的前景。

Description

一种海洋烬灰红链霉菌及其应用于制备橙酮化合物的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体地说，是关于一种海洋烬灰红链霉菌及其应用。

背景技术

随着陆生生物资源的逐步减少，人们开始把目光转向海洋生态系统。海洋微生物资源极其丰富，而且在其特殊的生存环境中，海洋微生物能产生结构更加新颖和功能强大天然的活性物质。目前，已有从放线菌、真菌、细菌、海藻等海洋微生物中分离出具有抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、免疫调节功能以及包括生物农药等在内的其他用途的生物活性物质的相关报道。

橙酮类化合物是一类稀有的黄酮体类型，是苯并呋喃的衍生物。这类化合物中许多在医药用途中具有镇痛、消炎和一定的抗肿瘤活性，在农业用途中具有杀虫、抗菌和除草活性。因此，这类化合物，尤其是橙酮，作为这类化合物的代表，是医药、农药分子中重要的母体结构，可通过对它的结构改造得到各种活性的化合物。然而橙酮类化合物通常只微量存在于菊科植物组织内，目前主要通过植物组织提取的方法制备这类化合物，也有通过化学合成的手段得到橙酮类化合物的研究。

由于微生物具有生长周期短，代谢易于调控，可通过发酵实现大规模生产的特点，所以利用微生物发酵技术制备生物活性物质相比从植物中提取更具有工业化生产的前景。

发明内容

本发明人通过将采集于海南潮间带的沙土中分离微生物的方法，分离获得了一株海洋烬灰红链霉菌（Streptomyces cinereoruber）。进一步的研究发现，通过发酵培养该海洋烬灰红链霉菌（S.cinereoruber），可得到具有生物活性的橙酮化合物。

因此，本发明的第一个目的在于提供保藏号为CGMCC No.6922的海洋烬灰红链霉菌。

本发明的第二个目的是提供一种橙酮化合物的制备方法，该方法包括发酵培养本发明的海洋烬灰红链霉菌。

发酵培养后可运用分离纯化手段制备橙酮化合物。

因此，本发明提供一种制备橙酮化合物的方法，所述方法包括在适于本发明所述的海洋烬灰红链霉菌发酵的培养条件下培养所述海洋烬灰红链霉菌。

本发明的方法还包括从培养基上清液中分离出橙酮化合物。

本发明的方法中，可使用含有以培养基总重计0.5-10％的碳源、0.1-8％的氮源和0-5％的无机盐的培养基培养所述海洋烬灰红链霉菌。

本发明所使用的培养基中，碳源可选自淀粉、葡萄糖、果糖、甘露醇及其混合物；氮源可选自肉胨、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母、肉膏、玉米浆、棉籽粉、尿素、铵盐、硝酸盐及其混合物；无机盐可选自钠、钾、钙、镁、铁、锰的盐。

在一具体实施例中，所述培养基含有葡萄糖0.5-5%、淀粉0.1-5%、花生饼粉0.1-8%、食盐0.5-5%、氯化镁0.01-0.5%和磷酸氢二钾0.01-0.5%，pH6-8。

在一具体实施例中，所述培养基含有葡萄糖2%、淀粉1%、花生饼粉2%、食盐2%，氯化镁0.05%，磷酸氢二钾0.05%，pH7.2。

在一具体实施例中，所述方法包括在20-35℃培养所述海洋烬灰红链霉菌。

在一具体实施例中，所述方法包括在26-30℃培养所述海洋烬灰红链霉菌

本发明还包括一种培养物，所述培养物含有本发明所述的海洋烬灰红链霉菌。

在一具体实施例中，所述培养物还含有培养或发酵所述海洋烬灰红链霉菌的培养基。在一具体实施例中，所述培养基包括本文所述的各种培养基。

本发明的制备橙酮化合物的方法包括包括分离出所述培养物中的橙酮化合物。

本发明还包括采用本发明的所述方法制备得到的产品。

附图说明

图1为本发明的海洋烬灰红链霉菌（Streptomyces cinereoruber）的孢子丝形态的电镜照片。

图2显示利用发酵培养海洋烬灰红链霉菌（S.cinereoruber）TXC6，分离纯化获得的橙酮化合物的质谱图。

图3显示利用发酵培养海洋烬灰红链霉菌（S.cinereoruber）TXC6，分离纯化获得的橙酮化合物的氢谱图。

具体实施方式

本发明涉及利用保藏号为CGMCC No.6922的海洋烬灰红链霉菌制备橙酮化合物的方法。适用于本发明方法制备的橙酮化合物为下式所示的化合物：

本发明的方法包括在适于所述海洋烬灰红链霉菌发酵的培养条件下培养所述海洋烬灰红链霉菌。通过该培养，海洋烬灰红链霉菌将橙酮化合物分泌到培养基中。

海洋烬灰红链霉菌的培养方法既可以为深层液体培养，也可以为固体培养。为有利于工业性的培养，宜将上述生产菌的孢子悬浮液接种到培养基上，并进行通气搅拌培养。

对培养基中的营养源，并无特殊的要求，通常包括常用于微生物培养的碳源、氮源及其他营养源。必要时可添加一些动植物、矿物油等作为消泡剂。

碳源包括但不限于各种碳水化合物。优选的碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、果糖和甘露醇，以及它们的任意混合物；更优选为D-葡萄糖、D-果糖和D-甘露醇，以及它们的任意混合物。以培养基总重计，碳源的含量范围在0.5-10％，例如1-8％或1-5％。

氮源可为肉胨、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母、肉膏、玉米浆、棉籽粉、尿素、铵盐、硝酸盐等，以及其它有机或无机含氮化合物，及它们的任意混合物。以培养基总重计，氮源的含量范围在0.1-8%，例如1-5％或1-3％。

其他营养源包括一些无机盐类，例如钠、钾、钙、镁、铁、锰的盐及其混合物。在具体实施例中，所述盐可以是盐酸盐、磷酸盐等。例如，所述盐可以是氯化钠、氯化镁和磷酸氢二钾及其混合物。以培养基总重计，其他营养源的含量范围在0-5％，例如0.01-5％、0.01-3％、0.1-3％、0.5-3％不等。

可从市场上购得上述培养基成分，然后按照配方进行配制。应理解，培养基除含有上述营养源外，还含有常用于微生物培养的其它成分，例如水。

通常，可将培养基的pH范围可为6-8，以接近中性为好。用于调节培养基pH值的物质是本领域周知的，例如可加入某些弱酸或弱碱进行调节。

在一具体的实施例中，发酵培养基含有：选自葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉或其混合物的碳源；选自花生饼粉的氮源；和无机盐。

在一具体实施例中，无机盐包括食盐、氯化镁和磷酸氢二钾。

在一具体实施例中，培养基含有葡萄糖0.5-5%、淀粉0.1-5%、花生饼粉0.1-8%、食盐0.5-5%、氯化镁0.01-0.5%和磷酸氢二钾0.01-0.5%，pH6-8。

在另一实施例中，培养基含有葡萄糖2%、淀粉1%、花生饼粉2%、食盐2%、氯化镁0.05%和磷酸氢二钾0.05%，pH7.2。

对培养时的温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适应菌株的生产为准，并以选择活性组分产量最高的条件为好。培养温度在20-35℃，通气比1:0.2-1:3之间（通气比：指每分钟通过培养液的空气体积与培养液体积之比）。这些培养基的组份、pH、培养温度、通气条件等均应根据实际情况进行适当调整，以获得最好的效果。

在一优选实施例中，培养温度为26℃至30℃。在一优选实施例中，培养时间为4-6天。

在一具体实施例中，本发明的制备橙酮化合物的方法包括：在适于保藏号为CGMCC No.6922的海洋烬灰红链霉菌发酵的培养条件下培养该海洋烬灰红链霉菌，其中，所述培养条件包括：用含有葡萄糖2%、淀粉1%、花生饼粉2%、食盐2%、氯化镁0.05%和磷酸氢二钾0.05%，pH7.2的培养基在20-35℃的温度下培养所述海洋烬灰红链霉菌。

在另一具体实施例中，培养时通气比为1:0.2-1:3。

发酵培养结束后，可用本领域常用的萃取、层析等分离提取手段从发酵产物中分离得到橙酮化合物。

例如，在发酵培养结束后，过滤除去固体物质，得到的清液用萃取溶剂萃取，浓缩获得的有机相，除去有机溶剂后即可获得含有橙酮化合物的提取物。萃取溶剂可以是极性溶剂，包括但不限于正丁醇、戊醇、异戊醇、乙酸乙酯等。萃取溶剂的用量可根据实际情况确定，通常为清液的1－10倍体积，更通常为1－5倍体积。可将每次萃取所得的有机相合并后减压浓缩。之后可除去有机溶剂。

由此获得的提取物通常为粗提物。粗提物可再经过硅胶色谱层析分离，以例如60:1的二氯甲烷:甲醇的混合溶剂为洗脱剂洗脱。收集活性组分，浓缩后即可得到纯度90%以上的橙酮化合物。进一步地，可再通过薄层层析纯化，可得到含量98%以上的高纯度化合物。

应理解，上述萃取、层析所用的技术手段可与制备橙酮化合物的其它方法中所用的技术手段相同。

本发明还包括采用上述方法制备得到的产品，所述产品包括但不限于：发酵完成后含有所述海洋烬灰红链霉菌及培养基的培养物、滤除培养物的固体后所得的液体、以及上述粗提物和进一步纯化得到的纯度在90％以上或98％以上的产物。

本发明也包括本发明海洋烬灰红链霉菌在制备橙酮化合物中的应用。

本发明还包括上述发酵完成后含有海洋烬灰红链霉菌及培养基的培养物、滤除培养物的固体后所得的液体、以及上述粗提物和进一步纯化得到的纯度在90％以上或98％以上的产物的应用，例如用于制备具有镇痛、消炎和抗肿瘤活性的药物中的应用，用于制备具有杀虫、抗菌和除草活性的农药组合物中的应用，以及用于制备橙酮衍生物中的应用。

因此，本发明还包括一种农药组合物，该组合物含有，例如上述发酵完成后含有海洋烬灰红链霉菌及培养基的培养物或滤除培养物的固体后所得的液体，以及农药学上可接受的载体。应理解，鉴于农药组合物是直接施加于植物，因此，可直接将上述发酵完成后含有海洋烬灰红链霉菌及培养基的培养物或滤除培养物的固体后所得的液体用作农药，或在加入适当的农药学上可接受的载体之后作为农药组合物使用。

可根据发酵培养基或所得液体中橙酮化合物的含量以及现有已知的橙酮化合物起活性作用所需的用量来配制农药组合物。这在本领域技术人员所掌握的技术范围之内。

以下结合实施例，对本发明作进一步详细说明以理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。对于实施例中未指明的试剂及其用量，均为常规的试剂及用量。

实施例1、菌株的理化特性

本发明人在采集于海南潮间带的沙土中分离到一株微生物，并对其形态特征、培养特征、生理生化特征及16S rDNA的序列进行了分析，结果如下：

1、形态特征和培养特征

该菌株在葡萄糖天门冬素琼脂培养基上孢子丝直、柔曲，较长，表面光滑；基内菌丝体无断裂，无横膈；气生菌丝体，生长茂盛，无分支；孢子球形至柱形，表面光滑，呈粉红色。具体见图1。在各种培养基上的生长特征如下表1所示。

表1

2、生理生化及碳源利用特征

该菌株的生理生化及碳源利用特征见表2。

表2

3、经由商业公司测得本发明的菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

根据形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析可判断，该菌株属于链霉菌属（Streptomyces）的烬灰红链霉菌（S.cinereoruber），定名为海洋烬灰红链霉菌（S.cinereoruber）TXC6。该菌株已于2012年11月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏号：CGMCC No.6922。

实施例2、菌株的培养

以葡萄糖2%、淀粉1%、食盐2%、花生饼粉1%的比例制成培养基，pH调节到7.2，消毒灭菌。将生长于葡萄糖天门冬素培养基斜面的海洋烬灰红链霉菌（S.cinereoruber）TXC6菌种接种于该培养基中，在28℃下振荡培养30小时；以此培养物为种子，以10%的比例接种于上述培养基组成的发酵培养液中，28℃通气搅拌培养100小时。

实施例3、利用发酵培养海洋烬灰红链霉菌（S.cinereoruber）TXC6，分离纯化获得橙酮化合物

将根据实施例2得到的培养物，过滤除去固体物质后，得到的清液用2倍体积的正丁醇萃取3次，合并萃取液。将有机相减压浓缩，除去有机溶剂后得到粗提物260克。粗提物再经过硅胶色谱层析分离，以二氯甲烷和甲醇60:1比例的混合溶剂为洗脱剂，洗脱。收集活性组分，浓缩后即可得到纯度90%以上的代谢物78克，再进一步通过薄层层析纯化后即可得到70克纯度含量98%以上的高纯度化合物。该化合物具有如下理化学性质：

1.外观：淡黄色粉末状固体

2.溶解性：溶于甲醇、乙醇等极性溶剂

3.质谱（TOF MS）：表明分子量为254，附图2

4.氢谱：附图3

根据紫外、质谱、氢谱、碳谱和其他数据分析，确定该化合物分子式为C₁₅H₁₀O₄,结构式如下所述，与橙酮（Aurones）相同：

虽然以具体实施例的方式对本发明做出了详细描述。但应理解的是，在不偏离本发明精神的情况下对本发明做出的修改和变动，都应包括在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种海洋烬灰红链霉菌（Streptomyces cinereoruber），其特征在于，所述海洋烬灰红链霉菌为保藏号为CGMCC No.6922的海洋烬灰红链霉菌。

2.一种培养物，所述培养物含有权利要求1所述的海洋烬灰红链霉菌。

3.一种制备如下所示的橙酮化合物的方法，

其特征在于，所述方法包括：

在适于权利要求1所述的海洋烬灰红链霉菌发酵的培养条件下培养所述海洋烬灰红链霉菌。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从培养基上清液中分离出橙酮化合物。

5.如权利要求3－4中任一项所述的方法，其特征在于，使用含有以培养基总重计0.5-10％的碳源、0.1-8％的氮源和0-5％的无机盐的培养基培养所述海洋烬灰红链霉菌。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碳源选自淀粉、葡萄糖、果糖、甘露醇及其混合物；所述氮源选自肉胨、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母、肉膏、玉米浆、棉籽粉、尿素、铵盐、硝酸盐及其混合物；所述无机盐选自钠、钾、钙、镁、铁、锰的盐。

7.如权利要求4－5中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基含有葡萄糖0.5-5%、淀粉0.1-5%、花生饼粉0.1-8%、食盐0.5-5%、氯化镁0.01-0.5%和磷酸氢二钾0.01-0.5%，pH6-8。

8.如权利要求3－7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括在20-35℃培养所述海洋烬灰红链霉菌。

9.采用权利要求3－8中任一项所述的方法制备得到的产品。

10.权利要求9所述的产品在制备具有杀虫、抗菌和除草活性的农药组合物中的应用，以及用于制备橙酮衍生物中的应用。