CN102168020B - 一株海洋来源真菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株海洋来源真菌——青霉属(Penicillium sp.)ENP701,及其在微生物发酵制备喹啉生物碱的二聚物盐中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,430072,保藏编号:CCTCC No:M2010088,保藏日期:2010年4月19日。本发明的有益效果主要体现在:提供了一株能够产生具有抗肿瘤活性的喹啉生物碱二聚物盐的海洋来源真菌,并对其发酵条件进行了优化,为新药研发提供了基础。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株海洋来源真菌Penicillium sp.701,及其在微生物发酵制备喹啉生物碱的二聚物盐中的应用。
(二)背景技术
海洋中蕴藏着丰富的微生物资源,高盐、高压、低温、特殊光照、寡营养等生存环境特征决定了海洋微生物的特殊代谢方式,次级代谢产物结构复杂、多样。海洋真菌是指一类在海洋、咸水或河口环境中生长并形成孢子繁殖的真菌,多数附生、共生在海洋动植物或漂流木中。海洋真菌作为海洋微生物的一个重要组成部分,近年来成为开发新生物活性物质的新资源,能产生丰富的生物活性次级代谢产物,如萜类、肽类、生物碱类和酯类等,许多化合物具有一定的抗菌、细胞毒、抗氧化、抗肿瘤、抗滤过性病原体、酶抑制等活性,因此许多海洋天然产物具有巨大的潜力用于开发新药。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株海洋来源真菌Penicillium sp.701,及其在微生物发酵制备喹啉生物碱的二聚物盐中的应用。
本发明采用的技术方案是:
一株海洋来源真菌——青霉属(Penicillium sp.)ENP701,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,430072,保藏编号:CCTCC No:M2010088,保藏日期:2010年4月19日。
该菌株从中国东海北纬28.2690度、东经121.6047度海域的海水中分离得到。其菌体照片见图1,菌落特征如下:菌落呈白色且略带青色,被散毛的,紧贴于培养基。种子液移至三角瓶中培养,真菌则长成许多球状的菌丝体,直径1~2cm不等,悬浮于培养液中。
本发明还涉及所述的海洋来源真菌在微生物发酵制备喹啉生物碱的二聚物盐中的应用,所述喹啉生物碱的二聚物盐结构如式(I)所示:
上述喹啉生物碱的二聚物盐采用MTT法进行人肺癌细胞H460体外抑制实验,半抑制率浓度(IC50)为19.38±0.15μg/ml,提示该化合物可能是潜在的抗肿瘤药物。
具体的,所述应用方法如下:将所述Penicillium sp.701在适用于海洋来源真菌的发酵培养基进行发酵培养,于培养后的菌体中获得所述喹啉生物碱的二聚物盐。所述适用于海洋来源真菌的发酵培养基可选择本领域常规适用于海洋来源真菌的培养基,例如人工海水GYT培养基,于菌体中获得所述喹啉生物碱的二聚物盐的方法可按照本领域常规方法进行,比如按照CN201010109785.8中的方法进行分离。
优选的,为进一步提高菌株发酵产率,所述发酵培养基每100mL组成如下:葡萄糖0.5~2.0g,NaNO3 0.1~0.5g,酵母膏0.05~0.5g,人工海水50~60mL,蒸馏水补足至100mL,pH6.0~7.0。
所述人工海水每100ml组成为:NaCl 2.448g,Na2SO4 0.3917g,KCl0.0664g,KBr 0.0096g,SrCl2 0.0024g,MgCl·6H2O 0.4981g,CaCl2·H2O0.1102g,NaHCO3 0.0192g,H3BO3 0.0026g,NaF 0.0004g,蒸馏水100ml。
液体发酵技术属于现代生物技术之一。深层发酵技术直接生产菌体,同时获得富含代谢产物的发酵液。菌体深层发酵技术研究的关键是培养基,不同代谢产物产量的提高需要不同的培养基进行培养,因此,培养基的选择与配制是深层发酵技术的关键,培养基配方的合理性,直接影响到发酵产率和生产成本。本发明通过反复试验和筛选,获得了适用本发明菌株的最佳培养基配方,可大大提高菌株发酵产率。
更为优选的,所述发酵培养基每100mL组成如下:葡萄糖1.0g,NaNO30.22g,酵母膏0.1g,人工海水60mL,蒸馏水补足至100mL,pH6.5。
本发明的有益效果主要体现在:提供了一株能够产生具有抗肿瘤活性的喹啉生物碱二聚物盐的海洋来源真菌,并对其发酵条件进行了优化,为新药研发提供了基础。
(四)附图说明
图1为ENP701菌体照片(放大100倍);
图2为不同碳源对特定微量活性代谢产物的影响;
图3为不同氮源对特定微量活性代谢产物的影响;
图4为不同PH对特定微量活性代谢产物的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:培养基的最佳碳源的确定
(1)海洋真菌enp.701(CCTCC No:M2010088)菌种以人工海水GYT固体培养基(按如下组成配制:1g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.1g酵母膏,2g琼脂,60mL人工海水和40mL蒸馏水)于4℃下保存。
(2)确定培养基的最佳碳源(配方1)
种子培养基每100mL按如下组成配制:1g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.1g酵母膏,60mL人工海水和40mL蒸馏水,pH7.5。
在种子培养基的基础上,以不同的碳源代替葡萄糖,确定最佳碳源。
分别以蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖代替葡萄糖,观察不同碳源对生物碱类物质发酵的影响。
通过实验结果(见图2)发现,最佳碳源为葡萄糖。
因此,配方1各成分用量为(以100mL为例):
1g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.1g酵母膏,60mL人工海水,40%mL蒸馏水,pH7.5。
实施例2:培养基的最佳氮源的确定
(1)海洋真菌enp.701(CCTCC No:M2010088)菌种以人工海水GYT固体培养基(按如下组成配制:1g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.1g酵母膏,2g琼脂,60mL人工海水和40mL蒸馏水)于4℃下保存。
(2)确定培养基的最佳氮源(配方2)
在种子培养基的基础上,以不同的氮源代替蛋白胨,确定最佳氮源。
分别以0.11gNH4Cl,0.13g(NH4)2SO4,0.17gNaNO3代替0.2g蛋白胨(每100mL培养基添加量),观察不同氮源对生物碱类物质发酵的影响。
通过实验结果(见图3)发现,最佳氮源为NaNO3。
因此,配方2各成分用量为(以100mL为例):
1g葡萄糖,0.17gNaNO3,0.1g酵母膏,60mL人工海水,40mL蒸馏水,pH7.5。
实施例3:培养基的最佳pH的确定
(1)海洋真菌enp.701(CCTCC No:M2010088)菌种以人工海水GYT
固体培养基(按如下组成配制:1g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.1g酵母膏,2g琼脂,60mL人工海水和40mL蒸馏水)于4℃下保存。
(2)确定培养基的最佳pH(配方3)
在种子培养基的基础上,调节培养基的pH为6.05、6.56、6.84、7.05、7.26、7.42、7.50、7.65、7.78、7.96,观察不同pH对生物碱类物质发酵的影响。
通过实验结果(见图4)发现,最佳pH为6.5。
因此,配方3各成分用量为(以100mL为例):
1g葡萄糖,0.17gNaNO3,0.1g酵母膏,60mL人工海水,40mL蒸馏水,pH6.5。
实施例4:
(1)海洋真菌enp.701(CCTCC No:M2010088)菌种以人工海水GYT固体培养基(按如下组成配制:1g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.1g酵母膏,2g琼脂,60mL人工海水和40mL蒸馏水)于4℃下保存。
(2)正交实验优选最佳培养基(配方4)
参照配方1,配方2和配方3的过程中碳源,氮源和pH对生物碱类物质产量的影响走势,设计L9(34)正交表设计试验,4个影响因素分别为:碳源(因素A)、氮源(因素B)、pH(因素C)、时间(因素D),它们的水平如下:
表1:正交因素水平表
表2:正交试验表及结果
从实验结果(见表2)可知,较优组合为A2B2C1D3,即在最佳摇瓶培养基中,采用的碳源是1.0%葡萄糖(即每100mL培养基中含有1g葡萄糖),氮源是0.22%NaNO3(即每100mL培养基中含有0.22g NaNO3),pH是6.5,培养时间为18d。
因此,确定最佳培养基配方(配方4)各成分的含量为(以100mL为例):
1.0g葡萄糖,0.22gNaNO3,0.1g酵母膏,60mL人工海水,40mL蒸馏水,pH6.5,培养18d。
实施例5:喹啉生物碱的二聚物盐的制备
菌体制得过程:发酵培养基每100mL组成如下:葡萄糖1.0g,NaNO30.22g,酵母膏0.1g,人工海水60mL,蒸馏水40mL,pH6.5;
将海洋来源真菌Penicillium sp.CCTCC No:M2010088接种于20L人工海水GYT培养基中,在28℃,200rpm条件下摇床培养18d得到菌液,其中分离得到湿菌体22.3g。
将所得菌体22.3g,用3L甲醇室温冷浸,冷浸三次,每次在室温冷浸一周,合并冷浸提取液,回收溶剂后得到浸膏11.4g,用200~300目柱层析硅胶(80g)进行柱层析分离,以氯仿/甲醇(体积比10∶1)梯度洗脱至甲醇冲柱,梯度洗脱所用的洗脱液依次为:氯仿/甲醇体积比为10∶1、氯仿/甲醇体积比为8∶1、氯仿/甲醇体积比为6∶1、氯仿/甲醇体积比为4∶1、氯仿/甲醇体积比为2∶1、甲醇;洗脱液的流速为1ml/min,每种浓度洗脱液的洗脱时间为30min,浓缩洗脱液后以氯仿/甲醇(体积比5∶1)作薄层色谱展开剂,以紫外灯检测,GF254板以碘化铋钾生物碱显色剂显色后,根据Rf值分组。将展开剂氯仿/甲醇体积比为5∶1,Rf=0.50的组份合并,蒸干溶剂,用甲醇进行重结晶,得到喹啉生物碱的二聚物盐21.8mg(白色针状晶体,:3440.96,2964.49,1684.89,1606.58,1526.53,1456.00,1420.99,1384.33,1265.75,1225.87,1177.16,1119.96,816.70,768.99,640.94,531.56,468.75cm-1;:245nm;HR-ESI-MS:m/z 563.2657[M+Na-Mg(OH)Cl·H2O,理论值:563.2634]+;293.1275[M+Na-Mg(OH)Cl·H2O-C16H18N2O2,理论值:293.1266]+)。
以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一株海洋来源真菌——青霉属(Penicillium sp. )ENP701,保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国,武汉,武汉大学,430072,保藏编号:CCTCC No:M2010088,保藏日期:2010年4月19日。
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