CN102617707B - 放线菌素d新同系物2-甲基-放线菌素d的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D的制备方法，经核磁与质谱综合解析，确定了该化合物的结构，其化学结构为：

为放线菌素D的新同系物。其制法是用累西菲链霉菌Streptomyces recifensis CGMCC No.5228作生产菌。该链霉菌在含有可溶性淀粉的液体培养基中发酵，获得菌丝体、发酵上清液和各种代谢产物。对发酵后的发酵上清液和菌丝体用氯仿或乙酸乙酯萃取，通过提取分离和纯化等方法，得到结构如上的新化合物，通过细胞测定表明该化合物具有抗肿瘤细胞活性。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，对开发利用我国的药用放线菌资源具有重要价值。

Description

放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物学、药物化学、有机化学领域，具体的说是设计一株链霉菌中提取分离得到的抗肿瘤细胞化合物2-甲基-放线菌素D的制备方法和应用，该化合物为放线菌素D的同系物。

背景技术

平盖灵芝含有丰富的麦角甾醇、灵芝酸、灵芝多糖、氨基酸、多肽、腺苷、三萜类及多种微量元素，其中有机锗含量高达12380ppm，有机硒含量也很高。虽然，平盖灵芝化学成分目前已经研究得较为深入，但对平盖灵芝内生放线菌研究甚少。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70％是各种放线菌所产生。放线菌起初从土壤中分离获得，随着研究的深入，人们开始从植物中分离放线菌，通过研究发现放线菌广泛分布在各种已研究过的植物体中，并且能产生一些重要的化合物，有些具有新的化学结构。而从真菌中分离放线菌的报道较少，从平盖灵芝内生放线菌中分离化合物更是鲜有报道。

发明内容

为了从真菌中分离放线菌，本发明提供了一种放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D的制备方法。

本发明的具体技术方案如下：该放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D，其特征在于该化合物的化学结构式如下：

本发明还提供了链霉菌累西菲链霉菌Streptomyces recifensis CGMCC No.5228发酵及萃取分离方法，其培养、提取分离步骤如下：

1.菌株发酵

种子培养基：

酵母浸膏4.0±1g，麦芽浸膏5.0±1g，葡萄糖4.0±1g，MgSO₄0.1±0.05g，蒸馏水0.8～1.5L，pH=7.2；

发酵培养基：

溶性淀粉5.0±1g，葡萄糖10.0±2g，蛋白胨5.0±1g，酵母浸膏5.0±1g，NaCl4.0±2g，K₂HPO₄0.5±0.01g，MgSO₄0.5±0.1g，CaCO₃2.0±0.5g，蒸馏水08～1.5L，pH=7.2；

具体流程：

发酵菌株为累西菲链霉菌Streptomyces recifensis CGMCC No.5228，该菌在培养基成分为的种子培养基中振荡培养60～80h。然后接种于发酵罐中，发酵罐发酵10.0L，转速1000rpm在28±2℃下培养100±5h。

发酵菌株累西菲链霉菌Streptomyces recifensis保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)，保藏编号CGMCC NO.5228。

2.有效成分的萃取、分离

(1)萃取：将发酵离心，菌丝体与发酵液分离，发酵液用旋转蒸发仪浓缩10-20倍，醇沉，然后回收乙醇，清夜用氯仿或乙酸乙酯萃取2-3次，合并萃取液后浓缩。

(2)分离：将上述得到的浸膏应用硅胶柱层析，以氯仿：甲醇梯度洗脱，薄层色谱检测，收集含有2-甲基-放线菌素D的流份，合并浓缩后再经凝胶LH-20层析，以氯仿：甲醇=5：4洗脱，薄层色谱检测，得到2-甲基-放线菌素D纯品。

上述步骤(2)中乙醇用95％浓度，硅胶柱层析中，先以氯仿：甲醇=100～30：0～70梯度洗脱，然后以氯仿：甲醇=10～0：90～100梯度洗脱。

上述提取分离得到放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D在制备治疗抗肿瘤药物的应用。

3.化合物的结构表征

化合物2-甲基-放线菌素D为红色不定性结晶，熔点251.7～252.9℃，分子式C₆₃H₈₈N₁₂O₁₆，APCI-MS)：1269.5[M+H]⁺。通过碳谱对比可知，化合物含有与放线菌素D母体结构相同，但由于放线菌素D分子量为1254，从分子量角度考虑，化合物应是放线菌素D的同系物(基团方面多出一个-CH₂-或-CH₃)，通过DEPT谱图和CNMR谱图可知，在54.9ppm处有甲基吸收峰，因此说明本新化合物在放线菌素D的基础上连接一甲基，通过相关谱的确认，此甲基连在partC部分Phenoxazine上2号C位置上的-NH₂-基团上，具体结构见以下化学式。

表1.化合物的¹³CNMR数据

δ：化学位移值

有益效果：

通过细胞测定表明化合物2-甲基-放线菌素D具有抗肺癌和胃癌肿瘤细胞活性：

(1)用Alamar Blue法测定该化合物对人肺癌细胞NCI-H460抑制活性IC50为12.9ng/mL。

(2)用Alamar Blue法测定该化合物对人胃癌细胞SGC7901抑制活性IC50为11.6ng/mL。

表2.化合物对肿瘤细胞的抑制作用

附图说明

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明。

附图1为该放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D化合物的化学结构式；

附图2为化合物核磁共振谱碳谱；

附图3为化合物核磁共振谱氢谱；

附图4为化合物核磁共振DPET谱；

附图5为化合物核磁共振H-H COSY谱；

附图6为化合物核磁共振C-H相关谱；

附图7为化合物APCI-MS谱；

具体实施方式

实施例1化合物2-甲基-放线菌素D的提取分离

选择累西菲链霉菌Streptomyces recifensis CGMCC No.5228为发酵菌株，在10L发酵罐中，按每升中含有溶性淀粉5.0g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0，酵母浸膏5.0g，NaCl4.0g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.5g，CaCO₃2.0g配比配制培养基10.0L。利用高压蒸汽灭菌法对培养及进行灭菌后，火焰接种西菲链霉菌Streptomycesrecifensis CGMCC No.5228种子液。在28℃，1000rpm转速控制下培养发酵100h，过滤，除去菌丝体，清夜用旋转蒸发仪浓缩10-20倍后，醇沉除去蛋白与多糖，过滤后清夜用氯仿萃取2-3遍，合并，浓缩，得到浸膏。与硅胶1：1拌匀，先以氯仿：甲醇=100～30：0：70梯度洗脱，然后以氯仿：甲醇=10～0：90～100梯度洗脱，收集洗脱液，经TLC合并相似组分，对各洗脱组分进行肿瘤细胞测定，确定活性最大组分。得到最大组分上LH20凝胶柱，用甲醇：氯仿=5：4的比例进行洗脱，得抗肿瘤活性最大化合物纯品，

实施例2体外抗肿瘤试验(Alamar Blue法)NCI-H460细胞株

采用Alamar Blue法检测体外抗肿瘤活性。NCI-H460细胞于含10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下继代培养。取对数生长期的细胞用0.25％胰酶从培养瓶上消化下来，制成细胞悬液，96孔板中每孔加100μL(约1万个细胞)，对照组加100μL不含细胞的培养基，放入细胞培养箱中过夜，细胞贴壁。不同极性的组分用DMSO溶解后用培养基稀释到所需浓度(DMSO的浓度小于0.1％)，加100μL到实验组中，对照组补加100μL培养基。培养48h后，弃去培养液，用PBS洗涤两次。Alamar Blue贮存液用培养基以1：10比例稀释后，每孔加200μL，AlamarBlue为10％，4h后将培养板放于570nm的激发波长和590nm的发射波长下，加入不含细胞的培养基的孔作空白值，加细胞液不加药的孔作对照值，以细胞培养孔的值减去空白值为实际值。按照下式计算细胞存活率：细胞存活率=(对照-样品)/对照×100％。样品浓度分别为5，10,20,40,80ng/mL，抑制率分别为27.73％，52.34％，61.42％，70.28％和73.36％。利用spss软件计算化合物对人肺癌细胞NCI-H460抑制活性IC50为12.9ng/mL。

实施例3体外抗肿瘤试验(Alamar Blue法)SGC7901细胞株

具体方法如实施例2，样品浓度分别为5，10,20,40,80,100ng/mL，抑制率分别为27.72％，30.77％，79.97％，85.70％和86.37％。利用spss软件计算化合物对人胃癌细胞SGC7901抑制活性IC₅₀为11.6ng/mL。

Claims (5)

1.放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D的制备方法，其特征在于所述制备方法的具体步骤如下：

(1)菌株发酵：发酵菌株为累西菲链霉菌Streptomyces recifensis CGMCCNo.5228，该菌在培养基成分为酵母浸膏4.0±1g，麦芽浸膏5.0±1g，葡萄糖4.0±1g，MgSO₄0.1±0.05g，蒸馏水0.8～1.5L的种子培养基中振荡培养60h～80h；然后接种于发酵罐中，发酵培养基为溶性淀粉5.0g±1，葡萄糖10.0±2g，蛋白胨5.0±1g，酵母浸膏5.0±1g，NaCl4.0±2g，K₂HPO₄0.5±0.1g，MgSO₄0.5±0.1g，CaCO₃2.0±0.5g，蒸馏水0.8～1.5L，pH＝7.2；28±2℃振荡培养100±5h；(2)发酵100±5h后，获得含发酵产物的发酵液，发酵液经浓缩后用氯仿或乙酸乙酯萃取，萃取物通过硅胶柱氯仿：甲醇＝100：0～0：100梯度的层析、凝胶氯仿：甲醇＝5：4的层析以及液相色谱甲醇：水：乙腈＝26：46：28的纯化，得到成品。

2.根据权利要求1所述的放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D，其特征在于该化合物的化学结构式如下：

。

3.根据权利要求1所述的放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D的制备方法，其特征在于步骤(2)中用硅胶柱层析，先以氯仿：甲醇＝100～30：0～70梯度洗脱，然后以氯仿：甲醇＝10～0：90～100梯度洗脱。

4.根据权利要求1所述的放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中用乙酸乙酯或氯仿萃取3次，合并3次浓缩液。

5.根据权利要求1所述的放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D的制备方法，其特征在于放线菌素D新同系物2-甲基-放线菌素D是在抗胃癌以及肺癌药物中进行应用。

Images