CN103665108A

CN103665108A - Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554菌株及其产物放线菌素D制备方法和应用

Info

Publication number: CN103665108A
Application number: CN201310519932.2A
Authority: CN
Inventors: 朱伟明; 王聪; 王乂; 刘培培
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2013-10-26
Filing date: 2013-10-26
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明涉及Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554菌株及其产物放线菌素D制备方法和应用。菌株保藏编号为CGMCC7907。Streptomycesparvulus OUCMDZ-2554高产单一化合物放线菌素D，产量为0.25mg/mL。此菌株首次在国内分到，产量高，培养基仅用一种营养成分，成本低，制备简单，易于操作，发酵周期短，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，从根本上解决药源问题，也可以为该类化合物的结构修饰及构效关系研究提供前体。

Description

Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554菌株及其产物放线菌素D制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及用链霉菌Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554(来源于黄河三角洲)及其制备放线菌素D的方法和应用(菌株保藏编号：CGMCC 7907，保藏日期：2013年7月10日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。

背景技术：

癌症一直以来严重威胁着人类的健康与生命，对开发高效、低毒的抗肿瘤药物的要求变得日益迫切。微生物尤其是链霉菌的次生代谢产物一直是新药发现的重要源泉，随着对陆栖微生物的大量开发，这几年来，人们逐渐开始转向特殊生境微生物次生代谢产物。

黄河三角洲来源既不同于陆地又有异于海洋的独特的生存环境的微生物，该盐碱地土壤盐度高，透气性差，养分少，对土壤微生物产生一定程度的抑制作用，导致微生物缺乏赖以生存的物质基础和环境条件。由于极端微生物的生存环境特殊，定然会成为开发药物先导化合物的重要资源。为继续开展这一特殊环境来源的微生物活性产物的研究(曲鹏，刘培培，付鹏，等.黄河三角洲耐盐真菌Penicillium chrysogenum HK14-01的次生代谢产物.微生物学报，2012，52(9)：1103-1112；陈正乾，刘培培，王乂，等.黄河三角洲土曲霉Aspergillus terreus OUCMDZ-1925中具抗菌活性的聚酮类天然产物.微生物学报，2013，32(2)：277-285；Fu P，Yang CL，Wang Y，Liu PP，Qu HJ，et al.α-Pyrones and diketopiperazine derivatives from the marine-derived actinomycete Nocardiopsis dassonvillei HR10-5.J Nat Prod，2011，74(10)：1751-1756)，从黄河三角洲泥样中筛选出一株链霉菌OUCMDZ-2554，找到了高产单一化合物放线菌素D(付海超，赵文英，钟惠民，等.海绵来源放线菌sh6004发酵产物中的活性生物碱.中国海洋药物，2008，27(4)：14-20)。

放线菌素D中含有一个苯氧环结构，通过它连接两个等位的环状肽链。此肽链可与DNA分子的脱氧鸟嘌呤发挥特异性相互作用，使放线菌素D嵌入DNA双螺旋的小沟中，与DNA形成复合体，阻碍RNA多聚酶的功能，抑制RNA的合成，特别是mRNA的合成。放线菌素D已经成为较为理想的抗肿瘤药物，用于肾母细胞瘤、绒毛膜上皮癌、恶性淋巴瘤和何杰金病等，也常与其他药物联合用于肿瘤的治疗和研究。

目前通过发酵法得到放线菌素D的有S.parvulus、S.plicatus和S.griseoruber(Waksman S，Selman A，Gregory F，et al.Actinomycin II.Classification of organisms producing different forms of actinomycin.AntibiotChemother，1954，4：1050-1056；Lam KS，Mamber SW，Forenza S，Stodieck LS，et al.The effects of space flight on the production of actinomycin D by Streptomyces plicatus.J.Ind.Microbiol.Biotechnol，2002，29(6)：299-302；Praveen V，Tripathi C K M，Bihari V.Studies on the production of actinomycin-D by Streptomyces griseoruber-a novel source.Lett Appl Microbiol，2009，49(4)：450-455)等。Streptomyces parvulus OUCMDZ-2554高产单一化合物放线菌素D，此化合物合成步骤长，产率不高，原料价格较贵、毒性大，安全性差，所用的溶剂腐蚀性不符合绿色化学的要求(Tanaka T，Nakajima K，Okawa K.Studies on2-aziridinecarboxylic acid.1V.Totalsynthesis ofactinomycin D via ring-openging reaction ofaziridine.Bull Chem SocJpn，1980，53(5)：1352-1355)。然而微生物具有生长速度快、生长条件温和、代谢过程简单等优点，发酵培养基仅用一种营养成分，成本低，制备简单，易于操作，产量高(0.25mg/ml)，发酵周期短，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，从根本上解决药源问题，也可以为该类化合物的合成及构效关系研究提供前体。

发明内容：

本发明旨在提供S.parvulus OUCMDZ-2554及其产物放线菌素D制备方法及其应用，所述放线菌素D结构(图1)。

本发明所涉及的放线菌素D的生产菌是S.parvulus OUCMDZ-2554，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(编号：CGMCC 7907，保藏日期：2013年7月10日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。

本发明保护一种发酵的寡培养基：酵母浸膏20g、陈海水1L、pH7.5。

本发明保护一种制备放线菌素D的方法：发酵S.parvulus OUCMDZ-2554，经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以甲醇洗脱，得到放线菌素D纯品。所述发酵的条件具体可为种子液摇床3天，5％的接种量，28℃，转速为180转/分钟，摇床11天。

本发明提供的放线菌S.parvulus OUCMDZ-2554主产单一产物，产量高，分离工艺简便，易于操作，该菌株稳定，培养基仅用一种营养成分，成本低，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产。

附图说明：

图1为放线菌素D的化学结构式。

图2为OUCMDZ-2554菌株的系统发育树状关系图。

图3为放线菌素D标准品(浓度：0.5mg/mL)的HPLC。

图4为放线菌素D的HPLC标准曲线。

图5为放线菌素D粗提液(浓度：0.4mg/mL)的HPLC分析图。

图6为放线菌素D纯品(浓度：0.3mg/mL)的HPLC。

图7为放线菌素D的产量。

图8为放线菌素D的质谱图。

图9为放线菌素D的紫外光谱图。

具体实施方式：

【实施例1】OUCMDZ-2554菌株的分离和鉴定

1、菌株分离

采用平板稀释法分离放线菌。将海泥(来源于黄河三角洲)从冰箱拿出放置一段时间，解冻，取海泥样品1g，用无菌海水逐级稀释到10^-2，各取0.3mL均匀涂布于分离平板上(酵母浸膏0.2％、2％琼脂、pH7.5)，每个稀释度涂3个平板，28℃倒置培养，挑取山的菌落划线纯化，纯化的菌株接入斜面培养基[斜面培养基组成(％)：可溶性淀粉2％、KNO₃0.1％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄·7H₂O0.05％、NaCl0.05％、FeSO₄0.001％、pH7.5，琼脂2％]，置于4℃冰箱保存。

2、OUCMDZ-2554菌株的鉴定

该放线菌菌株OUCMDZ-2554是从采自山东东营黄河三角洲的海泥中分离得到，经多相分类学研究鉴定为Streptomyces parvulus；并由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(编号：CGMCC7907，保藏日期：2013年7月10日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。

对OUCMDZ-2554菌株采用16S rDNA引物序列7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)、1540r(5′-AGGAGGTGATC CAGCCGCA-3′)扩增其16S rDNA序列。以所提的总DNA为模板进行PCR扩增，纯化测序后，菌株的16S rDNA序列的长度为1434bp(下图所示)。使用软件MEGA4分析放线菌OUCMDZ-2554的16S rDNA序列以及其它放线菌的16S rDNA序列，并构建系统发育树(图2)。

该Streptomyces parvutlusOUCMDZ-2554菌株具有如下分子生物学特征：其16S rRNA基因序列信息为：CCGCTTACACATGCAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCTTCACGGGCATCTGTGAAGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCCAGAGATGGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAAGTC。

将基因序列与NCBI对比同源性，发现测试结果与Streptomyces parvulus的序列有98％的吻合度。该StreptomycesparvulusOUCMDZ-2554菌株具有如下形态学特征：气生菌丝较短，有刺状，菌丝黄白色或淡黄色，基内菌丝呈黄色，产黄色色素；取插片观察其显微形态表明气生菌丝断裂为孢子，孢子呈圆柱形、光滑。与Streptomyces parvulus的特征十分一致，因此结合形态、生理生化特性鉴定菌株为Streptomyces parvulus。

【实施例2】放线菌素D的制备和应用

1、放线菌素D纯品的制备和标准曲线的制定

取斜面培养3天的S.parvulus OUCMDZ-2554适量，接种到1瓶装有150mL培养液(酵母浸膏0.2％，pH7.5)的500mL三角瓶中，装载于28℃、180转/分钟摇床上，摇床培养7天。发酵液用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏48mg。所得浸膏经LH-20凝胶柱色谱分离(甲醇洗脱)，得到高纯度放线菌素D35mg。

纯度检测：放线菌素D的结构经NMR、MS和比旋光度鉴定；其纯度用薄层色谱TLC(2种展开剂：15：1二氯甲烷-甲醇、5：1石油醚-丙酮，3种显色方法：254nm紫外、香草醛-浓硫酸、Dragendroff试剂，均呈单一斑点)和高效液相色谱HPLC测定：通过面积归一法，采用5个不同的波长(201、240、280、442、460nm)测定，记录色谱图的时间宽度为放线菌素D出峰时间的2倍以上。结果表明：在所选定的5个波长下，放线菌素D的纯度均大于98％(图3)，符合标准品的纯度要求。

标准曲线绘制：以上述纯度大于98％的放线菌素D为标准品，通过面积归一法，采用反相HPLC法(流动相：75％的甲醇水溶液、流速1mL·min^-1、样品浓度10mg/mL，依次稀释为1、0.8、0.5、0.1、0.08、0.05、0.01、0.008、0.005、0.001mg/mL，进样量10μL、检测波长443.6nm)测定标准曲线(图4)。放线菌素D的标准曲线为：y＝(2E-06x)+0.0976，r²＝0.9996，式中x为峰面积、y为放线菌素D含量；表明曲线的线性关系良好，可用于放线菌素D含量的测定。

2、发酵生产

将S.parvulus OUCMDZ-2554的孢子接入到种子培养基[种子培养基组成(％)：可溶性淀粉1％、酵母浸膏0.4％、蛋白胨0.2％、CaCO₃0.1％、KBr0.01％、Fe₂(SO₄)₃·4H₂O0.004％]，得到种子液，发酵时间为3天。从种子培养基中以5％的比例接种到发酵培养基[种子培养基组成(％)：酵母浸膏0.2％，pH7.5]中，初始pH7.5、装液量150/500mL，温度为28℃，转速为180转/分钟，发酵1L，摇床培养，发酵时间分别为1，3，5，7，9，11，13，15天。获得发酵液，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取六次，合并乙酸乙酯萃取液后浓缩，粗提液的HPLC图谱见图5，通过HPLC分析，发酵11天，产量最高，产量见图6。

2、分离精制

将上述所有的浸膏经凝胶Sephadex LH-20层析，用甲醇洗脱，薄层色谱检测，得到放线菌素D纯品(图7)。

3、放线菌素D的鉴定

该化合物为橙红色结晶性粉末，易溶于甲醇、丙酮或异丙醇，在水中几乎不溶，熔点：246-247℃，[α] ²⁵D-310°(c0.30，MeOH)。由ES1-MS于m/z1256.4给出[M+H]⁺，该化合物的质谱图见图8，UV在201、240和445nm处有特征吸收(图9)，表明分子中存在吩噁嗪酮发色团。¹³C NMR在δ34--40有4个N-CH₃碳的吸收、在δ165-175有12个酰胺羰基碳的吸收；结合该化合物有12个氮原子，表明其为放线菌素类化合物。其波谱数据(表1)、比旋光值与文献报道的放线菌素D一致。该化合物的NMR数据见表1。

表1 放线菌素D的NMR数据(CDCl₃,¹H：600MHz，¹³C：150MHz)*

*Chromophore：δ_H7.36(d，J＝7.8Hz，1H，H-7)，7.63(d，J＝7.8Hz，1H，H-8)，2.55(s，3H，H-12)，2.68(s，3H，H-13)；δ_c101.7(C，C-1)，147.8(C，C-2)，179.2(C，C-3)，113.6(C，C-4)，145.2(C，C-4a)，140.6(C，C-5a)，127.7(C，C-6)，130.4(CH，C-7)，125.9(CH，C-8)，132.7(C，C-9)，129.2(C，C-9a)，146.0(C，C-10a)，169.0(C，C-11)，7.9(CH₃，C-12)，15.2(CH₃，C-13)，166.6(C，C-14).

4、应用

发酵培养基仅用一种寡培养基，发酵稳定，成本低，制备简单，易于操作，产量高，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，对于工业化生产以及化合物的结构修饰提供了药源。

Claims

1.式I化合物为放线菌素D：

2.S.parvulus OUCMDZ-2554，菌种保藏编号：CGMCC7907，保藏日期：2013年7月10日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

3.权利要求2所述产生菌S.parvulus OUCMDZ-2554的培养基，是通过如下方法制备得到的培养基：酵母浸膏20g、陈海水l L、pH7.5。

4.权利要求1所述式I化合物的制备方法，其中将所述发酵物经凝胶Sephadex LH-20层析，以甲醇洗脱，薄层色谱检测，得到放线菌素D纯品(HPLC检测，纯度大于98％)。

5.权利要求2所述S.parvulus OUCMDZ-2554生产放线菌素D发酵的条件：种子液摇床3天，5％的接种量，28℃，转速为180r/min，摇床11天。

6.权利要求2所述S.parvulus OUCMDZ-2554生产放线菌素D的应用。