CN103305563B - 一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法 - Google Patents

一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法 Download PDF

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一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，是以三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)D35作为发酵菌株，制备发酵液；发酵液经萃取、浓缩得到的粗提物再经硅胶柱进行三次柱层析、薄层点板得活性组分，活性组分经制备型高效液相色谱柱纯化制备出纯化物，经鉴定为alisamycin（阿里沙霉素），其对多种植物病原菌具有较强的抑菌活性作用，尤其是烟草黑胫病菌。

Description

一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法
技术领域
本发明涉及一种抗生素阿里沙霉素（alisamycin）的制备方法，尤指一种从三泽链霉菌株(Streptomyces misawanensis)D35中分离纯化阿里沙霉素（alisamycin）的方法。
背景技术
目前对植物病害的防治主要采用化学农药。化学农药防治虽然发挥了重要作用并取得了明显的成效，但化学农药的广泛、大量和长期使用已经给人、畜健康等带来了不良影响，特别是化学农药对人畜的毒副作用和残留问题至今未得到有效解决。致此，用微生物的代谢产物来防治植物病害迅速得以发展。
放线菌是一类极其丰富的微生物资源，也是产生抗生素活性物质最多的一类微生物，迄今已知的抗生素中，有2/3是由放线菌产生的。不少抗生素已用于防治农作物上的有害生物，如井冈霉素、春雷霉素等用于防治植物真菌性病害。而放线菌中的链霉菌属能产生多种抗生素物质，该些抗生素物质对植物病害的生物防治具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点，对用于植物病害防治有广阔的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，是以三泽链霉菌(Streptomycesmisawanensis)D35为发酵菌株，从中分离纯化阿里沙霉素（alisamycin）的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，该方法包括如下步骤：
A、以三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)D35作为发酵菌株，制备发酵液；
B、除去发酵液中的菌丝体，再采用乙酸乙酯进行萃取，得粗提液，将该粗提液在70℃真空浓缩得粗提取物；
C、将上述浓缩的粗提物上硅胶柱进行三次柱层析，第一次柱层析用乙酸乙酯作洗脱剂，第二次柱层析用乙酸乙酯和丙酮的混合洗脱液进行梯度洗脱，第三次柱层析用石油醚和丙酮的混合洗脱液进行梯度洗脱，并经薄层点板合并活性组分；
D、将上述活性组分采用制备型高效液相色谱进行纯化，得单体化合物，色谱条件如下：制备型色谱柱:XTerraPrep MS C18Column10um,7.8×300mm，采用体积比乙腈：水：乙酸=45：55：0.5为流动相，柱温为35℃，流速为7mL/min，保留时间为30min，检测波长为279nm，进料量100μL；
E、采用核磁共振氢谱及核磁共振碳谱技术对上述单体化合物进行结构鉴定，该单体化合物为阿里沙霉素。
上述提及的三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)D35（保藏号为CGMCCNO.3250），在申请号为201010001144.0的中国专利申请中已有详细描述。
上述步骤A中的发酵液是挑取在高氏一号斜面培养基上新鲜培养的三泽链霉菌株D35的孢子接种到种子培养液中，28-30℃，转速为180-250r/min预培养24-32h后，按5-10%的接种量转接到发酵培养基中，27-31℃，转速为180-250r/min震荡培养72-84h制得。
上述提及的高氏一号斜面培养基为现有常用培养基，上述种子培养液和发酵培养基配方为：可溶性淀粉20g、KNO31g、K2HPO41g、NaCl1g、CaCO34g及蒸馏水1000mL，pH7.2。
上述步骤B中粗提液是于室温下，将乙酸乙酯与发酵液按2:1的体积比混合，静置分层，收集萃取相得到。
上述步骤C中第二次柱层析进行梯度洗脱时的乙酸乙酯和丙酮的体积比为8：1、6：1和2：1。
上述步骤C中第三次柱层析进行梯度洗脱时的石油醚和丙酮的体积比为4：1、3：1和2：1。
与现有技术相比，本发明的优点：选择性强、操作简单、提取效率高、提取速度快、产品质量好等优点。
具体实施方式
三泽链霉菌株D35发酵液的制备：
挑取在高氏一号斜面培养基上新鲜培养的三泽链霉菌株D35的孢子接种到种子培养液中，28℃，转速为200r/min预培养30h后，按8%的接种量转接到发酵培养基中，27℃，转速为200r/min震荡培养72h。
发酵液的预处理，萃取和活性物质的粗提：
将发酵液100L采用真空抽滤除去菌丝体，将乙酸乙酯与发酵液以2:1的体积比装入梨形分液漏斗中，装量至分液漏斗的三分之一，盖好塞子并剧烈振摇颠倒2到3min，使有机相和水相充分接触后，静置分层。拧开上面的塞子，旋开下端的活塞放出下层液，然后从分液漏斗的上口倒出上层液。分别取上相和下相采用纸碟法进行生物测定，根据抑菌圈的大小来确定生物活性成份的所在，用旋转蒸发仪将萃取液减压浓缩备用，得40.8克棕红色粗提取物。
活性物质的分离：
将浓缩的乙酸乙酯粗提物40.8克与柱层析用硅胶(200-300目)拌匀，自然风干，将活性粗提物吸附在硅胶上。湿法装柱后用洗脱剂冲洗色谱柱，进行三次柱层析。第一次经柱层析（柱Φ×L为10cm×100cm；硅胶200-300目；乙酸乙酯梯度洗脱；500ml/流分）分离得到175个流分。经薄层点板（TLC）合并为36个流分段，仅F5-12流分有活性。
经第一次柱层析分离后，所得活性流分F5-12经第二次柱层析（柱Φ×L为6cm×120cm；硅胶200～300目；洗脱剂乙酸乙酯:丙酮(8:1，6:1，2:1，V/V)；50ml/流分）后，分离得到245个流分，经薄层点板（TLC）合并为43个流分段，仅F141-190流分有活性。
F141-190流分经第三次柱层析（柱Φ×L为2cm×80cm；硅胶200～300目；洗脱剂为石油醚:丙酮(4:1，3:1，2:1，V/V；10mL/流分）分离得到1108个流分。经薄层点板（TLC）合并为15个流分段，仅F521-622流分有活性，活性流分共6.3g。
活性物质的纯化：
使用第三次柱层析分离出的F521-622流分作为样品。
采用乙腈：水：乙酸=45：55：0.5为流动相，制备柱型号:XTerraPrep MSC18Column10um,7.8×300mm，柱温:35℃，流速:7ml/min，保留时间30min，检测波长为279nm的制备液相条件进行样品制备，当保留时间为18-22min时，有较高的吸收峰，为活性峰，可以制备出纯化物。共制备出450mg单体化合物。
纯化物的结构鉴定：
将单体化合物通过核磁共振波谱仪得到化合物的1H NMR和13C NMR，根据得到的相关波谱数据，并与相关文献比较，确定化合物的结构。其中核磁共振以TMS为内标，以氘代丙酮为溶剂。根据该化合物的1H NMR和13C NMR鉴定为alisamycin（阿里沙霉素），分子量为520.221，分子式为C29H32N2O7。化学结构为：
纯化物的生物活性测定：
采用菌丝生长抑制法，将浓度为600μg/mL的纯化物丙酮溶液加到PDA平板，使其终浓度为120μg/mL、60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL，接种烟草黑胫病菌菌饼（7mm），设甲霜灵-锰锌为药剂对照，28℃恒温培养箱中倒置培养，待对照菌落长满全平板时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算各处理的菌丝生长抑制率，得出EC50、EC95和毒力回归方程等参数。
结果见下表1，alisamycin对烟草黑胫病菌的毒力回归方程Y=3.148+1.196X，其EC50和EC95分别为35.32mg/L和831.76mg/L，低于化学杀菌剂甲霜灵-锰锌。
表1纯化物的生物活性测定

Claims (4)

1.一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
A、以三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)D35作为发酵菌株，制备发酵液；
B、真空抽滤除去发酵液中的菌丝体，再采用乙酸乙酯进行萃取，得粗提液，将该粗提液在70℃真空浓缩制得粗提取物；
C、将上述浓缩的粗提物上硅胶柱进行三次柱层析，第一次柱层析用乙酸乙酯作洗脱剂，第二次柱层析用乙酸乙酯和丙酮的混合洗脱液进行梯度洗脱，梯度洗脱时乙酸乙酯和丙酮的体积比为8：1、6：1和2：1；第三次柱层析用石油醚和丙酮的混合洗脱液进行梯度洗脱，并经薄层点板合并活性组分，梯度洗脱时石油醚和丙酮的体积比为4：1、3：1和2：1；
D、将上述活性组分采用高效液相色谱进行纯化，得单体化合物，色谱条件如下：色谱柱:Prep MS C18Column10um,7.8×300mm，乙腈：水：乙酸的体积比为45：55：0.5作为流动相，柱温为35℃，流速为7mL/min，保留时间为30min，检测波长为279nm，进料量100μL；
E、采用核磁共振氢谱及核磁共振碳谱技术对上述单体化合物进行结构鉴定，该单体化合物为阿里沙霉素。
2.如权利要求1所述的一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，其特征在于，所述步骤A中的发酵液是挑取在高氏一号斜面培养基上新鲜培养的三泽链霉菌株D35的孢子接种到种子培养液中，28-30℃，转速为180-250r/min预培养24-32h后，按5-10％的接种量转接到发酵培养基中，27-31℃，转速为180-250r/min震荡培养72-84h制得。
3.如权利要求2所述的一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，其特征在于，所述种子培养液和发酵培养基配方为：可溶性淀粉20g、KNO31g、K2HPO41g、NaCl1g、CaCO34g及蒸馏水1000mL，pH7.2。
4.如权利要求1所述的一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，其特征在于，所述步骤B中粗提液是于室温下，将乙酸乙酯与发酵液按2:1的体积比混合，静置分层，收集萃取相得到。
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