CN103276028A - 一种发酵法制取埃博霉素b的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种发酵法制取埃博霉素B的方法：采用亚硝酸-紫外线复合处理纤维堆囊菌(Polyangium cellulosun)ATCC15384获得高产菌株——纤维堆囊菌ABM113，用海藻酸钠和产酶菌株制得固定化菌种；经乙酸乙酯解吸、甲醇复溶后，获得粗品，粗品经Sephadex LH-20柱层析、C18反相色谱柱进一步纯化，得到白色结晶状埃博霉素B，含量≥99.0％。本发明的优点在于：纤维堆囊菌ABM113遗传性能稳定、所制取的埃博霉素B产量高，工艺相对简单，适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及埃博霉素B高产菌株的诱变选育及利用该菌株发酵制备埃博霉素B的方法，涉及微生物领域。
背景技术
埃博霉素B，英文名epothilone B，纤维堆囊菌Sorangium cellulosum 90的次级代谢产物，分子式为C27H41NO6S，是一种大环内酯类的化合物。与之相似的次级代谢物还有epothilone A、epothione C、epothilone D、epothilone G、epothiloneH等。Epothilone B的相对分子量为506.25，熔点为93℃-94℃。
埃博霉素B有显著的选择性抗乳腺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞的活性，是一种微管超稳定的新型抗肿瘤活性物质。它可以通过稳定已经聚化的微管从而遏制细胞的有丝分裂。在20世纪90年代广泛应用于临床的是紫杉醇。但是临床试验表明，它对不同的实体瘤细胞有明显的抗肿瘤活性，且副作用多而受限制。如引发嗜中性白细胞减少症，外周神经病和脱毛症等；并且紫杉醇的低水溶性使得它必需由乳化方式给定，它本身可能影响心脏功能，导致过敏反应；此外，是P-糖蛋白的底物。P-糖蛋白可将许多细胞毒物质从细胞泵出，是肿瘤细胞产生多药物质抗性的原因。然而，紫杉醇的复杂的结构阻碍了通过化学修饰改善可溶性和降低毒性副作用的努力，所以引起了人们对相近作用模式但却具有好的特性化合物的研究。埃博霉素其离体抑制的效果比药物紫杉醇强2000-5000倍，作用的有效浓度为10～20ng/mL。在埃博霉素的类似物中，带甲基的埃博霉素B要比A基本上大2倍。比起紫杉醇来，埃博霉素B是一种更不易受P-糖蛋白作用的物质。因而埃博霉素B的抗肿瘤性能要比紫杉醇强的多，且其抗肿瘤谱要广的多。另外，紫杉醇可以从太平洋的紫杉的树皮中提取，但这种树生长极慢，所以来 源困难。但是对于埃博霉素B来说，可以通过纤维堆囊菌发酵，无限制的获得，可以解决抗癌药物的不足，且价格便宜。所以，此抗癌药物可能成为紫杉醇更新换代的新产品，所以开发比它更优越的埃博霉素来说是非常必要的。
然而，有关纤维堆囊菌的发酵条件及活性物质合成条件的研究报道很少，这一方面反映了纤维堆囊菌研究的困难；另一方面也是全球研究粘细菌生物活性物质合成的实验室太少的缘故。研究粘细菌，尤其是纤维堆囊菌的生长和次级代谢的条件对于开发粘细菌资源具有重要的意义。
纤维素堆囊菌的培养生产埃博霉素，为了进行埃博霉素的大规模生产，生物发酵是理想的途径。粘细菌纤维素堆囊菌的两种发酵产物埃博霉素A和B，已有专利报道了大规模发酵生产埃博霉素A和B。GerthK研究组利用纤维素堆囊菌Soce90进行350L(装液230L)发酵生产埃博霉素A和B，以XAD-16树脂作为吸附剂，分别得到埃博霉素A和B为11和22mg/L。但是在工业化生产中加入树脂带来管子堵住、设备磨损、灭菌不彻底很多不便，已有专利报道在发酵液中以环糊精代替树脂作为吸附剂来解决这一系列问题。又如李越中等以VY/2培养基作为纤维堆囊菌Soce90菌株的培养基，接种于ME培养液中，发酵培养4天左右，经分离提纯便得到埃博霉素B。
埃博霉素的发酵合成近年来研究的比较少，除外国的Gerthk以外，我国山东大学的微生物技术国家重点实验室也在研究。其中，吴斌辉等以纤维堆囊菌Soce9733-1作为研究对象，液体摇瓶发酵用Ck6培养基。结果表明纤维堆囊菌对可溶性淀粉、木聚糖、纤维素等复杂碳源的利用能力较强，简单碳源中只利用葡萄糖；KNO3、蛋白胨是较好的氮源，大多数氮源都能支持生长，表明该菌营养要求简单，能高效的利用自然界里丰富的纤维素资源。堆囊菌的盐耐受能力较低，盐浓度高于1％的培养基中菌体几乎不能生长，Mg2+是生长必需的元素， Ca2+对生长没有明显的作用，但是子实体的形态发生所必需的。培养基的起始pH为7.0时细胞生长较好，大于8.0或小于5.0不生长。李越中等以Soce90作为研究对象，以VY/2培养基作为纤维堆囊菌Soce90菌株的培养基，接种于ME培养液中，发酵培养4天左右，结果表明菌体的生长状态对产物的合成有影响，指数期接种物、低氮高碳培养条件、某些盐离子、氨基酸和乙酸盐对epothilones的合成有益，以此获得较为稳定epothilons产量的条件因素。
德国的GBF中心小组中GerthK研究组利用纤维素堆囊菌Soce90进行350L(装液230L)发酵生产埃博霉素A和B，以XAD-16树脂作为吸附剂，分别得到埃博霉素A和B为11和22mg/L。山东大学李越中等以VY/2培养基作为纤维堆囊菌Soce90菌株的培养基，接种于ME培养液中，发酵培养4天左右，收获的树脂水洗后滤除水份，加50mL甲醇室温下浸泡提取过夜，溶剂甲醇在40℃真空旋转蒸发器中除去，抽提物重新溶于0.5mL甲醇中(即产物浓缩100倍)，离心。HPLC(惠普)连续梯度洗脱分析epothilones含量。溶剂A为0.2％的乙酸，溶剂B为乙腈，在此条件下，epothiloneA的洗脱峰出现在4min，B出现在5min，最后比较理想的结果分别得到埃博霉素A和B为26.4mg/L，22.7mg/L。2002年发布的专利号为WO02/46196中提到了通过对树脂的收集，经过异丙醇洗提，之后和水混合，将溶剂蒸干，剩余的水相中的物质通过乙酸乙酯萃取，
旋转蒸发后过滤，通过反相的HPLC，最后是597.1kg的树脂中获得150g的埃博霉素B。
发明内容
本发明的目的是采用现代生物技术手段，提供一种改良纤维素堆囊菌后发酵制备埃博霉素B的新方法，该方法具有发酵单位高、收率高、产品含量高等优点。本发明的目的是通过如下技术方案实现的，具体步骤顺序如下：
1、高产菌株筛选
采用亚硝酸-紫外线复合处理纤维堆囊菌(Polyangium cellulosun)ATCC15384。亚硝酸分别处理5、10、15、20、25、30、35、40min，紫外灯15cm照射1min后在30℃培养箱中避光培养16h，进行红霉素抗性筛选和遗传稳定性考察。
2、摇瓶发酵
取10、15、20mL灭菌的2％、3％、4％海藻酸钠和培养了3天的纤维堆囊菌ABM113(CGMCC No.6418)2、4、6、8mL进行充分混合，制得直径3mm大的球状颗粒。接入种子培养基中培养得到固定化载体，以备发酵用。
冻存菌种经50ml种子培养基培养5天后转入200ml种子培养基(接种量接种量2.5％、5％、10％、15％、20％)，48、72、96、120h后转种发酵培养基。发酵培养基中加入发酵培养液体积1％～3％的NK型弱极性大孔吸附树脂、HLD-16中性大孔树脂、XAD-16树脂，灭菌后利用纤维堆囊菌ABM113发酵制取埃博霉素B，同时对发酵条件进行优化：将发酵培养基分别调pH到6.5，7.0，7.5，8.0，使用1‰(V/V)Antifoam204(Sigma)、Antifoam B(Sigma)和1030F三种不同的消泡剂，采用培养基一次性添加和将培培养基的成份分两次添加、三次添加，在发酵培养液中添加混合元素，FeCl3、ZnCl2、MnCl2.4H2O、CuCl2·2H2O分别加入1mg/L或者不添加，考察埃博霉素B的产率。
3、提取纯化
发酵结束后，待树脂完全沉淀，弃去发酵液。用适量水清洗树脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍树脂体积的乙酸乙酯，30℃振荡(150r/min)解吸过夜，重复解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇适量复溶，获得粗品。粗品经Sephadex LH-20柱层析，10×100cm。流动相：甲醇。上样量为柱体 积的1％～5％，提取物使用甲醇溶解后，离心取上清液，约100ml上样。流动相流速为6～10ml/min，展开距离约7.5cm/h。经HPLC分析，收集6.5min后的洗脱液。经Sephadex LH-20分离后的馏分，通过C18反相色谱柱进一步纯化。填料：C18，15μm，，80×100mm。流动相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。检测波长：UV230。经HPLC分析，收集75min后的洗脱液，旋转蒸发至干，得到白色结晶状埃博霉素B。
本发明的创造性在于采用亚硝酸-紫外线复合诱变获得埃博霉素B高产菌株——纤维堆囊菌(Polyangium cellulosum)，该菌株已于2012年8月7日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.6418。采用间隔添加培养基发酵，在发酵培养基中添加混合微量元素培养，选用海藻酸钠作为固定化材料进行包埋，发酵能力大大提高。本发明具有操作简便、易于大规模生产，产品收率高、纯度高(干基含量≥99.0％)等特点。
附图说明
图1为埃博霉素B的结构式，R1＝H，R＝Me。
具体实施方式
实施例1一种发酵法制取埃博霉素B的方法，按以下步骤依次进行：
(1)菌悬液的制备：将甘油冷冻保存的纤维堆囊菌(Polyangium cellulosun)ATCC15384菌种于4℃条件下解冻，在种子培养基中30℃、150r/min条件下活化24h，将活化的菌种按10％的接种量接入种子培养基中，于30℃、150r/min条件下进行培养16h，作为种子培养液，按10％的量接种于新的ATCC培养基中，培养14h。然后在培养瓶中加入玻璃珠继续培养2h，将菌团打散，培养液2000r/min离心10min，去上清，菌体采用生理盐水洗两次，然后重悬于生理盐水中，用血球计数板进行计数，备用。
种子培养基成分：鲜酵母5.0g/L，CaCl2·2H2O 1.0g/L，VB12 0.5mg/L，琼脂15g/L，定容至1L，用3mol/L的KOH调pH至7.2，121℃灭菌20min。
(2)亚硝酸-紫外诱变：按照上述方法制备107个/mL的菌悬液，取2mL菌悬液，2000g离心，加入1mL0.2mol/L亚硝酸钠溶液和1mL1mol/L pH4.5醋酸缓冲液，分别处理5、10、15、20、25、30、35、40min，加入18mL0.7mol/L的pH8.6的Na2HPO4缓冲液终止反应，将诱变菌液稀释1、10和102倍，取100μL涂布平板，平板距离38mW/cm2紫外灯15cm进行照射1min，在30℃培养箱中避光培养16h，观察菌落数，计算致死率。
(3)红霉素抗性筛选：诱变菌液稀释成不同浓度梯度，涂布于含有14mg/L红霉素抗性筛选培养基，有156株存活，将这些菌株编号为纤维堆囊菌ABM001～ABM156，测定突变株的埃博霉素B含量，将产量最高的5株突变株进行遗传稳定性考察，5个突变菌株连续传10代，突变株ABM113遗传稳定性好，其余高产菌株在连续传4代以上时埃博霉素B产量下降。
(4)细胞固定化：取10mL灭菌的2％海藻酸钠和培养了3天的纤维堆囊菌ABM113 2mL进行充分混合，用吸管吸取混合液慢慢的滴加到3％的CaCl2(20℃)，静置2个小时，之后用灭菌水清洗，这样制得的是直径3mm大的球状颗粒。接入种子培养基中，培养3天后，弃去培养液，无菌水反复冲洗三次，得到固定化载体，以备发酵用。
(5)吸附剂预处理：树脂使用前，需根据使用要求，进行程度不同的预处理，是将树脂内孔残存的惰性溶剂浸除。树脂预处理方法：第一步，加入高于树脂层10cm的乙醇浸渍4小时，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止。最后用水反复洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味后即可；第二步，加入高于树脂层10cm的3％-5％盐酸溶液浸泡2-4小时，用盐酸进行淋洗后，用净水洗至接近中性；第三步，用3％-5％的氢氧化钠溶液浸泡4小时后用同浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱，最后用净水清洗至pH 值为中性，备用。
(6)发酵：固定化菌种经50ml种子培养基培养5天后转入200ml种子培养基(接种量5％)，72h后转种发酵培养基。发酵培养基中加入发酵培养液体积1％的NK型弱极性大孔吸附树脂(树脂用蒸馏水浸泡一天)，121℃灭菌20min。利用纤维堆囊菌ABM113在如下条件下发酵制取埃博霉素B：500ml三角瓶，装瓶量200ml，发酵培养基pH6.5(用3mol/L的KOH调节)，使用1‰(V/V)Antifoam B(Sigma)作为消泡剂，发酵培养基分两次添加，起始添加一半发酵培养基，四天后添加另一半发酵培养基，在发酵培养液中添加混合元素FeCl3、ZnCl2、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O各1mg/L，32℃，120r/min发酵培养9天后收获。
发酵培养基成分：脱脂奶粉10g/L，酵母粉5g/L，马铃薯淀粉25g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Fe-EDTA8mg/L。
(7)粗提物制备：发酵结束后，待树脂完全沉淀，弃去发酵液。用适量水清洗树脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍树脂体积的乙酸乙酯，30℃振荡(150r/min)解吸过夜，重复解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇适量复溶，获得粗品。
(8)葡聚糖凝胶LH-20柱层析：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，10×100cm。流动相：甲醇。上样量为柱体积的3％，提取物使用甲醇溶解后，离心取上清液，约100ml上样。流动相流速为8ml/min，展开距离约7.5cm/h。经HPLC分析，收集6.5min后的洗脱液。
(9)C18反相色谱：经Sephadex LH-20分离后的馏分，通过C18反相色谱柱进一步纯化。填料：C18，15μm，
，80×100mm。流动相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。检测波长：UV230。经HPLC分析，收集75min后的洗 脱液，旋转蒸发至干。含埃博霉素B的粗提物经两步分离纯化得到纯度为99.4％的埃博霉素B。
实施例2一种发酵法制取埃博霉素B的方法，按以下步骤依次进行：
(1)、(2)、(3)同实施例1。
(4)细胞固定化：取15mL灭菌的3％海藻酸钠和培养了3天的纤维堆囊菌ABM113 4mL进行充分混合，用吸管吸取混合液慢慢的滴加到3％的CaCl2(20℃)，静置2个小时，之后用灭菌水清洗，这样制得的是直径3mm大的球状颗粒。接入种子培养基中，培养3天后，弃去培养液，无菌水反复冲洗三次，得到固定化载体，以备发酵用。
(5)吸附剂预处理：树脂使用前，需根据使用要求，进行程度不同的预处理，是将树脂内孔残存的惰性溶剂浸除。树脂预处理方法：第一步，加入高于树脂层10cm的乙醇浸渍4小时，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止。最后用水反复洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味后即可；第二步，加入高于树脂层10cm的3％-5％盐酸溶液浸泡2-4小时，用盐酸进行淋洗后，用净水洗至接近中性；第三步，用3％-5％的氢氧化钠溶液浸泡4小时后用同浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱，最后用净水清洗至pH值为中性，备用。
(6)发酵：固定化菌种经50ml种子培养基培养5天后转入200ml种子培养基(接种量10％)，96h后转种发酵培养基。发酵培养基中加入发酵培养液体积2％的HLD-16中性大孔树脂(树脂用蒸馏水浸泡一天)，121℃灭菌20min。利用纤维堆囊菌ABM113在如下条件下发酵制取埃博霉素B：500ml三角瓶，装瓶量200ml，发酵培养基pH7.0(用3mol/L的KOH调节)，使用1‰(V/V)Antifoam 204(Sigma)作为消泡剂，一次性添加发酵培养基，在发酵培养液中 添加混合元素FeCl3、ZnCl2、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O各1mg/L，32℃，120r/min发酵培养9天后收获。
发酵培养基成分：脱脂奶粉10g/L，酵母粉5g/L，马铃薯淀粉25g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Fe-EDTA8mg/L。
(7)粗提物制备：发酵结束后，待树脂完全沉淀，弃去发酵液。用适量水清洗树脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍树脂体积的乙酸乙酯，30℃振荡(150r/min)解吸过夜，重复解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇适量复溶，获得粗品。
(8)葡聚糖凝胶LH-20柱层析：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，10×100cm。流动相：甲醇。上样量为柱体积的2％，提取物使用甲醇溶解后，离心取上清液，约100ml上样。流动相流速为10ml/min，展开距离约7.5cm/h。经HPLC分析，收集6.5min后的洗脱液。
(9)C18反相色谱：经Sephadex LH-20分离后的馏分，通过C18反相色谱柱进一步纯化。填料：C18，15μm，，80×100mm。流动相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。检测波长：UV230。经HPLC分析，收集75min后的洗脱液，旋转蒸发至干。含埃博霉素B的粗提物经两步分离纯化得到纯度为99.2％的埃博霉素B。
实施例3一种发酵法制取埃博霉素B的方法，按以下步骤依次进行：
(1)、(2)、(3)同实施例1。
(4)细胞固定化：取20mL灭菌的4％海藻酸钠和培养了3天的纤维堆囊菌ABM113 6mL进行充分混合，用吸管吸取混合液慢慢的滴加到3％的CaCl2(20℃)，静置2个小时，之后用灭菌水清洗，这样制得的是直径3mm大的球状颗粒。接入种子培养基中，培养3天后，弃去培养液，无菌水反复冲洗三次， 得到固定化载体，以备发酵用。
(5)吸附剂预处理：树脂使用前，需根据使用要求，进行程度不同的预处理，是将树脂内孔残存的惰性溶剂浸除。树脂预处理方法：第一步，加入高于树脂层10cm的乙醇浸渍4小时，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止。最后用水反复洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味后即可；第二步，加入高于树脂层10cm的3％-5％盐酸溶液浸泡2-4小时，用盐酸进行淋洗后，用净水洗至接近中性；第三步，用3％-5％的氢氧化钠溶液浸泡4小时后用同浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱，最后用净水清洗至pH值为中性，备用。
(6)发酵：固定化菌种经50ml种子培养基培养5天后转入200ml种子培养基(接种量15％)，120h后转种发酵培养基。发酵培养基中加入发酵培养液体积3％的XAD-16树脂(树脂用蒸馏水浸泡一天)，121℃灭菌20min。利用纤维堆囊菌ABM113在如下条件下发酵制取埃博霉素B：500m1三角瓶，装瓶量200ml，发酵培养基pH7.5(用3mol/L的KOH调节)，使用1‰(V/V)1030F作为消泡剂，发酵培养基分三次添加，起始添加一半发酵培养基，三天后添加1/4发酵培养基，六天后添加1/4发酵培养基，发酵培养液中不添加混合元素，32℃，120r/min发酵培养9天后收获。
发酵培养基成分：脱脂奶粉10g/L，酵母粉5g/L，马铃薯淀粉25g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Fe-EDTA8mg/L。
(7)粗提物制备：发酵结束后，待树脂完全沉淀，弃去发酵液。用适量水清洗树脂2次，60℃烘干至恒重，加入10倍树脂体积的乙酸乙酯，30℃振荡(150r/min)解吸过夜，重复解吸后合并2次解吸液，45℃蒸去乙酸乙酯，加入甲醇适量复溶，获得粗品。
(8)葡聚糖凝胶LH-20柱层析：葡聚糖凝胶Sephadex LH-20，10×100cm。流动相：甲醇。上样量为柱体积的4％，提取物使用甲醇溶解后，离心取上清液，约100ml上样。流动相流速为6ml/min，展开距离约7.5cm/h。经HPLC分析，收集6.5min后的洗脱液。
(9)C18反相色谱：经Sephadex LH-20分离后的馏分，通过C18反相色谱柱进一步纯化。填料：C18，15μm，
，80×100mm。流动相：甲醇∶水＝2∶1。流速：18ml/min。检测波长：UV230。经HPLC分析，收集75min后的洗脱液，旋转蒸发至干。含埃博霉素B的粗提物经两步分离纯化得到纯度为99.0％的埃博霉素B。
Claims (9)
1.一种发酵法制取埃博霉素B的方法，主要包括以下步骤：
1)高产菌株筛选：采用亚硝酸-紫外线复合处理纤维堆囊菌(Polyangiumcellulosun)ATCC15384。经亚硝酸处理后紫外灯15cm照射1min后在25～30℃培养箱中避光培养15～20h，进行红霉素抗性筛选和遗传稳定性考察，得到纤维堆囊菌ABM113(CGMCC No.6418)。
2)摇瓶发酵：用海藻酸钠和纤维堆囊菌ABM113制得固定化菌种，经逐级放大培养后转种发酵培养基。发酵培养基中加入吸附树脂，灭菌。在一定pH值、接种量、消泡剂、培养基添加方式、添加混合元素的条件下发酵。
3)提取纯化：发酵结束后，乙酸乙酯解吸，解吸液蒸去乙酸乙酯，加入甲醇适量复溶，获得粗品。粗品经Sephadex LH-20柱层析，收集6.5min后的洗脱液。经Sephadex LH-20分离后的馏分，通过C18反相色谱柱进一步纯化，收集60～80min后的洗脱液，旋转蒸发至干，得到白色结晶状埃博霉素B。
2.根据权利要求1所述的亚硝酸-紫外线复合诱变方法，其特征在于：亚硝酸处理时间为5～40min。
3.根据权利要求1所述的固定化载体的制备方法，其特征在于：取10～20mL灭菌的2％～4％海藻酸钠和培养了2～5天的纤维堆囊菌ABM113 2～8mL进行充分混合，用吸管吸取混合液慢慢的滴加到3％的CaCl2(20℃)，静置2个小时，之后用灭菌水清洗，制得直径3mm大的球状颗粒。接入种子培养基中，培养2～5天后，弃去培养液，无菌水反复冲洗三次，得到固定化载体。
4.根据权利要求1所述的发酵培养基成分，其特征在于：脱脂奶粉8～12g/L，酵母粉4～8g/L，马铃薯淀粉20～25g/L，CaCl2·2H2O 0.4～0.6g/L，MgSO4·7H2O0.4～0.6g/L，Fe-EDTA5～10mg/L。
5.根据权利要求1所述的发酵培养基中加入的吸附树脂，其特征在于：NK型弱极性大孔吸附树脂、HLD-16中性大孔树脂、XAD-16树脂。
6.根据权利要求1所述的加入的消泡剂，其特征在于：0.6～1.2‰(V/V)Antifoam204(Sigma)、Antifoam B(Sigma)和1030F。
7.根据权利要求1所述的发酵培养基添加方式，其特征在于：一次性添加、分两次添加(起始添加一半发酵培养基，四天后添加另一半发酵培养基)和三次添加(起始添加一半发酵培养基，三天后添加1/4发酵培养基，六天后添加1/4发酵培养基)。
8.根据权利要求1所述的发酵培养液中添加混合元素的方法，其特征在于：不添加和添加混合元素FeCl3、ZnCl2、MnCl2·4H2O、CuCl2·2H2O各0.5～1.2mg/L。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：粗品经Sephadex LH-20柱层析、C18反相色谱柱两步纯化法获得埃博霉素B纯品。
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| CN103015675A (zh) * | 2011-09-23 | 2013-04-03 | 吴江市七都方圆铝型材加工厂 | 一种铝合金地板 |
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