CN103173398B

CN103173398B - 一株短小杆菌以及由其发酵制备海藻糖的方法

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Publication number: CN103173398B
Application number: CN201310115696.8A
Authority: CN
Inventors: 王蕾; 黄瑞; 顾冠彬
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2033-04-03
Also published as: CN103173398A

Abstract

本发明公开了一种短小杆菌及其应用，该短小杆菌Curtobacterium sp. SY311菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.7181。由上述短小杆菌发酵制备海藻糖的方法，具体为：(1)菌种活化；(2)制备种子液；(3)发酵；(4)去蛋白；(5)收集海藻糖组分；(6)后处理，将上述海藻糖组分经过脱色、过滤、低压浓缩、结晶、干燥后得到产物海藻糖。本发明使用的菌株经过紫外线诱变突变，海藻糖酶活性低，有利于海藻糖在发酵液中累计增加，从而提高最终海藻糖产物的收率；本发明公开的制备工艺简单，为一步法直接合成海藻糖，所用原料来源广泛，成本低，产物杂质少，易提纯，适合于工业化生产。

Description

一株短小杆菌以及由其发酵制备海藻糖的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术，尤其涉及一种具有低海藻糖酶活性的短小杆菌以及其在发酵制备海藻糖中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

海藻糖是由两个葡萄糖基通过a-a-1?1键连接而成的非还原性二糖，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁?2H₂O，最早从生活在沙漠中的一种甲虫蛹里分离得到，后发现广泛存在于植物、藻类、细菌、霉菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中。它不仅是生物体贮存的一种能量，而且对生物活性物质具有重要的抗逆保鲜作用，生物体处于干燥、冷冻、高渗透压、强辐射等不良环境下都能通过体内调节增加海藻糖的含量来抵御外界不良伤害，此外，通过外加式的海藻糖同样能对生物体和生物大分子起着良好的非特异性保护作用。

海藻糖具有稳定蛋白质和细胞膜的功能，可广泛应用于医药、食品、化妆品工业等领域，可用作药物和疫苗、抗体、酶等生物制品的保护剂和稳定剂，长期保持它们的生物活性；也可用于器官移植和组织细胞（如造血干细胞等）的保存。此外，海藻糖在食品保鲜、保质方面也有极其重要的用途。

利用微生物来生产海藻糖是目前研究最多的海藻糖制备方法，包括微生物抽提法、酶转化法等。

微生物抽提法是以乳酸菌、酵母、霉菌及其他一些含海藻糖的菌体为提取源；首先通过干燥、改变渗透压等方法处理菌体；然后经过乙醇等有机溶剂抽提、精制，从而得到较高纯度的海藻糖晶体。中国专利申请CN101481719公开了一种利用啤酒废酵母同时制备酵母多糖、海藻糖及酵母抽提物的方法，该方法包括啤酒废酵母脱苦去杂质，啤酒废酵母的自溶以及酶解与灭活，酵母多糖的分离和干燥，海藻糖的膜分离、浓缩、结晶及干燥，酵母抽提物的浓缩及干燥等步骤；但是采用微生物提取法制备海藻糖的产量不高，生产成本高，不利于工业化应用。

酶转化法制取海藻糖的途径有多种，按其作用底物分，主要为淀粉、麦芽糖以及葡萄糖。

以淀粉为主要原料，通过微生物产生的酶，转化淀粉生产海藻糖的生产工艺包括①培养微生物，②提取微生物产生的与海藻糖合成有关的海藻糖基合成酶和海藻糖释放酶，③利用微生物酶转化淀粉生成海藻糖，④酶转化体系中，海藻糖的提取纯化。该法的优点是以淀粉为原料，生产成本较低，缺点是生产工艺复杂，产物海藻糖与转化体系中的其他糖类，如麦芽糖、麦芽三糖分离困难，很难获得高纯度的海藻糖；以麦芽糖为原料，通过微生物发酵或微生物酶转化一步合成海藻糖，优点是工艺简单，缺点是成本高，此外与酶转化淀粉法相似，也存在不易获得高纯度的海藻糖产品的问题；以葡萄糖为底物，利用专一性很强的海藻糖-6-磷酸合成酶与海藻糖-6-磷酸酯酶共同催化葡萄糖可以高效的生成海藻糖，但是在整个反应过程中需要消耗高能物质UDP葡萄糖、GDP葡萄糖以及ADP葡萄糖，很难实现工业化大规模生产。同时酶转化法还存在需要进行酶的制备和酶的转化反应等多个步骤，从而导致整制备工艺复杂的缺点。

复杂的生产工艺与昂贵的价格已成为海藻糖广泛应用的最大障碍，因此研究开发海藻糖新的生产方法具有重要的现实意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种短小杆菌；本发明的另一个目的是提供上述短小杆菌发酵制备海藻糖的方法，从而以较低的成本、简单的操作提高海藻糖的收率，增加海藻糖的纯度。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一株短小杆菌Curtobacterium sp. SY311菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2013年1月21日，保藏号为CGMCC No.7181。

上述菌株最初是由土壤中分离得到，经过初筛、复筛和紫外线诱变而获得的一株海藻糖高产菌株，具体包括以下步骤：

1）初筛

从备选菌株中，选出能分解海藻糖，即产生海藻糖酶的菌株。具体方法是将保存于斜面的各菌种，点种于以海藻糖作为唯一碳源的筛选平板上（培养基的组成（质量体积比）：2%海藻糖；0.5%(NH₄)₂SO₄；0.05%酵母膏；0.1%KH₂PO₄；0.06%Na₂HPO₄·12H₂O；0.05%MgSO₄·7H₂O；2%琼脂，pH为7.0-7.2），30℃下培养3d，选取在该平板上生长良好的菌种，转接于斜面，30℃下培养48h，4℃保存作为复筛菌种；

2）复筛

将初筛所得菌种各1环，接种于装有发酵基础培养基30ml的300ml三角瓶中，30℃下，震荡培养3d，3000rpm离心15min，取上清液10μl点样于10′10cm硅胶GF254板，进行薄层层析（TLC）检测。于展层剂（丙酮∶正丁醇∶水=8∶1∶1）中二次展层，20%硫酸甲醇溶液显色，110℃，反应10min显出斑点，比较样品和标准品各斑点，在同等实验条件下，根据斑点的位置、大小和颜色的深浅，筛选出海藻糖高产株；

3）紫外线诱变

将培养18-24h的复筛后的菌株培养液，3000rpm离心10min，弃上清，菌体以0.1M KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液（KPB，pH7.0）洗涤三遍后，悬浮于相同缓冲液中，使细菌浓度为1-5×10⁸CFU/ml。取10-15ml，置平皿中，于紫外线下，分别照射45s和75s。以无菌水进行梯度稀释后，涂布于葡萄糖作为唯一碳源的平板（培养基的组成（质量体积比）：2%葡萄糖、0.5%(NH₄)₂SO₄、0.05%酵母膏、0.1%KH₂PO₄、0.06%Na₂HPO₄·12H₂O、0.05% MgSO₄·7H₂O、2%琼脂，pH为7.0-7.2，30℃下培养2d。挑取平板上的单菌落分别点种海藻糖平板和葡萄糖平板，30℃下培养2d。挑选在海藻糖平板上不生长，而在葡萄糖平板上生长良好的突变株，转接斜面，30℃下培养2d，4℃保存。将突变菌株和野生菌株进行摇瓶发酵试验，从中筛选得到海藻糖高产菌株。

应用上述短小杆菌CGMCC No.7181发酵制备海藻糖的方法，包括以下步骤：

(1) 菌种活化，将菌种保藏号为CGMCC No.7181的短小杆菌Curtobacterium sp. SY311菌株由斜面转接入培养基中，30℃下，培养1～2天；

(2) 制备种子液，取上述活化菌种接种于种子培养基中，30℃下，以200rpm震荡培养20～24h，以培养好的菌悬液作为种子液；按质量体积比，所述种子培养基的组成：2%麦芽糖，0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，0.1%KH₂PO₄，0.06%Na₂HPO₄·12H₂O，0.05% MgSO₄·7H₂O，其余为水；

(3) 发酵，将上述种子液按照2～4%的接种量接入到装有培养基的发酵罐中发酵，每4～6h从罐中取样，在95～100℃下烘干至恒重检测海藻糖和残留葡萄糖含量，培养56～64h后终止发酵，得到发酵液；按质量体积比，所述培养基的组成：3～4%葡萄糖，0.6～0.9%玉米浆，0.4～0.6%KH₂PO₄，其余为水；

(4) 去蛋白，将上述发酵液以2800～3200rpm离心8～12min，收集上清液，再经沸水浴8～11min，过滤去除蛋白质得到清液；

(5) 收集海藻糖组分，将上述清液流入阳离子交换柱，去离子水洗脱，收集海藻糖组分，再流入阴离子交换柱，去离子水洗脱，收集海藻糖组分；

(6) 后处理，将上述海藻糖组分经过脱色、过滤、低压浓缩、结晶、干燥后得到产物海藻糖。

上述技术方案中，按质量体积比，所述步骤（1）中培养基的组成为1%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.5%麦芽汁，0.5%酪胨，0.2%牛肉膏，0.2%甘油，0.005%失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（Tween80），0.1%MgSO₄·7H₂O，1.5%琼脂，其余为水。

上述技术方案中，所述步骤（3）中发酵温度28～32℃，通气量0.6～0.8∶1（V/V），搅拌速度180～200rpm，发酵pH为5.5～6.0。

上述技术方案中，所述步骤（5）中的阳离子交换柱为732阳离子交换柱，阴离子交换柱为717阴离子交换柱。

本发明中，脱色、过滤、低压浓缩、结晶、干燥属于现有技术，本领域技术人员可以根据产物需要合理选择；本发明优选：以活性炭或122树脂对海藻糖组分脱色后，经过滤膜过滤（孔径为0.45μm）得到含有海藻糖的滤液；采用旋转薄膜蒸发仪，将滤液50℃减压浓缩至无水分蒸出，边搅拌边加入冷冻无水乙醇，于4℃静置过夜后，过滤收集海藻糖晶体；将海藻糖晶体于真空干燥箱中，45℃真空干燥5h即得到海藻糖产品。

本发明中，葡萄糖和海藻糖的测定方法：将步骤（3）中的发酵液以3000rpm离心15min，以3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)先测出上清液中葡萄糖的量，然后以6M HCl酸解样品30min，NaOH中和后DNS法测定总糖量，然后按下列公式计算出上清液中海藻糖的量：

海藻糖=（总糖-还原糖）×342/360；其中342为海藻糖分子量；360为2分子葡萄糖总分子量。

发酵法是一种在一定的基质上培养菌株微生物，再通过微生物发酵来生产海藻糖，最后从发酵液中提取精制而得到海藻糖晶体的方法，其中菌株的选择以及发酵液的成分对海藻糖的转化、提取、精制结果起着决定作用。本发明利用的菌种短小杆菌Curtobacterium sp. SY311，保藏号CGMCC No.7181，最初是由土壤中分离得到，经过初筛、复筛和紫外线诱变而获得的一株海藻糖高产菌株，与野生型相比，海藻糖酶活性降低，有利于海藻糖的积累。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1．本发明使用的菌株经过紫外线诱变突变，海藻糖酶活性低，即该菌株分解酵母液中海藻糖的能力弱，有利于海藻糖在发酵液中累计增加，从而提高最终海藻糖产物的收率。

2．本发明利用葡萄糖为原料，通过发酵制备海藻糖，发酵液组分简单，产物存在于发酵液中，杂质少，易于提纯，制备得到的海藻糖产物与海藻糖标准品一致。

3. 本发明公开的制备工艺简单，为一步法直接合成海藻糖，所用原料来源广泛，成本低，适合于工业化生产。

附图说明

图1为实施例三中海藻糖、葡萄糖含量与发酵时间的关系图；

图2为实施例四中海藻糖、葡萄糖含量与发酵时间的关系图；

图3为本发明制备的海藻糖的红外光谱图；

图4为标准海藻糖样品的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一诱变处理筛选短小杆菌突变株及性能测试

菌株最初是由土壤中分离得到，经过初筛、复筛和紫外线诱变而获得的一株海藻糖高产菌株，为Curtobacterium sp. SY311，保藏号CGMCC No.7181，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期是2013年1月21日，具体包括以下步骤：

1）初筛

从备选菌株中，选出能分解海藻糖，即产生海藻糖酶的菌株。具体方法是将保存于斜面的各菌种，点种于以海藻糖作为唯一碳源的筛选平板上（培养基的组成（质量体积比）：2%海藻糖；0.5%(NH₄)₂SO₄；0.05%酵母膏；0.1%KH₂PO₄；0.06%Na₂HPO₄·12H₂O；0.05%MgSO₄·7H₂O；2%琼脂，pH7.0-7.2），30℃，培养3d，选取在该平板上生长良好的菌种，转接于斜面，30℃，培养48h，4℃保存作为复筛菌种；

2）复筛

将初筛所得菌种各1环，接种于装有发酵基础培养基30ml的300ml三角瓶中，30℃，震荡培养3d，3000rpm，离心15min，取上清液10μl点样于10′10cm硅胶GF254板，进行薄层层析（TLC）检测。于展层剂（丙酮∶正丁醇∶水=8∶1∶1）中二次展层，20%硫酸甲醇溶液显色，110℃，反应10min显出斑点，比较样品和标准品各斑点，在同等实验条件下，根据斑点的位置、大小和颜色的深浅，筛选出海藻糖高产株；

3）紫外线诱变

将培养18-24h的复筛后的菌株培养液，3000rpm，离心10min，弃上清，菌体以0.1M KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液（KPB，pH7.0）洗涤三遍后，悬浮于相同缓冲液中，使细菌浓度为1-5×10⁸CFU/ml。取10-15ml，置平皿中，于紫外线下，分别照射45s和75s。以无菌水进行梯度稀释后，涂布于葡萄糖作为唯一碳源的平板（培养基的组成（质量体积比）：2%葡萄糖、0.5%(NH₄)₂SO₄、0.05%酵母膏、0.1%KH₂PO₄、0.06%Na₂HPO₄·12H₂O、0.05% MgSO₄·7H₂O、2%琼脂，pH：7.0-7.2，30℃，培养2d。挑取平板上的单菌落分别点种海藻糖平板和葡萄糖平板，30℃，培养2d。挑选在海藻糖平板上不生长，而在葡萄糖平板上生长良好的突变株，转接斜面，30℃，培养2d，4℃保存。将突变菌株和野生菌株进行摇瓶发酵试验，从中筛选得到海藻糖高产菌株。

本发明筛选得到的海藻糖高产菌株，菌体短杆状，G⁺，无动力；在普通琼脂培养基上，形成黄色圆形菌落，表面光滑、边缘整齐；触酶试验（+），MR试验（-），硝酸盐还原试验（-），吲哚试验（+），淀粉水解（+）；最适生长温度25-30℃；生长pH 6.0-10.0。

实施例二摇瓶发酵制备海藻糖

本发明筛选得到的海藻糖高产菌株经过优化发酵工艺可制备得到高产量的海藻糖，具体包括如下步骤：

将保藏号CGMCC No.7181的短小杆菌Curtobacterium sp. SY311转接斜面，30℃，培养48h后取1环，接种于装有30ml种子培养基的300ml三角瓶中，30℃，200rpm，震荡培养20h，作为种子液；然后，将种子液按2-4%的种量接入装有50ml发酵液的500ml三角瓶中。

按质量体积比，所述斜面培养基的组成：1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%麦芽汁、0.5%酪胨、0.2%牛肉膏、0.2%甘油、0.005%Tween80、0.1%MgSO₄·7H₂O、1.5%琼脂，其余为水；pH为7.0-7.2。

按质量体积比，所述种子培养基的组成：2%麦芽糖、0.5%蛋白胨、0.1%酵母膏、0.1%KH₂PO₄、0.06%Na₂HPO₄·12H₂O、0.05%MgSO₄·7H₂O，pH为7.0-7.2。

发酵培养基的组成为：葡萄糖3%、4%（W/V）；玉米浆0.6%、0.9%（W/V）；KH₂PO₄ 0.4%、0.5%、0.6%（W/V）；发酵起始pH为5.5、6.0、6.5；发酵温度为28℃、30℃、32℃；接种量可为2%，3%、4 %（V/V）。具体发酵条件及发酵液中海藻糖产量见表1：

表1 各组发酵条件

从表1可以看出，本发明提供的制备方法能够简单高效的由短小杆菌CGMCC No.7181经发酵法制备出海藻糖，其中获得最佳结果的制备例为第10组。

实施例三

将实施例一制备的短小杆菌CGMCC No.7181转接斜面，30℃，培养48h后取1环，接种于装有30ml种子培养基的300ml三角瓶中，30℃，200rpm，震荡培养24h，作为种子液；然后，将种子液按3%的种量接入装有1.2升发酵液的2升台式发酵罐中发酵72h。

将发酵上清液1370ml（含海藻糖13.8g），沸水浴10min，过滤，去除凝固的蛋白质。清夜流入732阳离子交换柱（H⁺型，25×265mm），去离子水洗脱，收集海藻糖组分，流入717阴离子交换柱（OH^-型，39×370mm），去离子水洗脱，收集海藻糖组分，然后，边搅拌边加入2%活性炭脱色，滤膜（孔径为0.45μm）微滤得清液。50℃下减压将糖液浓缩至20ml，边搅拌边加入4体积冷冻无水乙醇，于4℃静置过夜后，过滤收集晶体，50℃真空干燥5h后，称重为9.5g，总提取收率为68.8%。

按质量体积比，所述斜面培养基的组成：1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%麦芽汁、0.5%酪胨、0.2%牛肉膏、0.2%甘油、0.005%Tween80、0.1%MgSO4·7H2O、1.5%琼脂，其余为水；pH为7.0-7.2。

发酵培养基的组成为：葡萄糖3%（W/V）；玉米浆0.6%（W/V）；KH₂PO₄ 0.5%（W/V）；发酵起始pH为6.0；发酵温度为30℃。

附图1为上述发酵罐中，海藻糖、葡萄糖含量与发酵时间的关系图，从中可以看出在发酵进行到16h时，发酵液中开始积累海藻糖，其产量随着时间的增加而增加，发酵至46h时，海藻糖产量已达10mg/ml以上，60h达到最高产量12.2mg/ml。

实施例四

将实施例一制备的的短小杆菌CGMCC No.7181转接斜面，30℃，培养48h后取1环，接种于装有30ml种子培养基的300ml三角瓶中，30℃，200rpm，震荡培养22h，作为种子液；然后，将种子液按4%的种量接入装有1.2升发酵液的2升台式发酵罐中发酵72h。

将发酵上清液970ml（含海藻糖9.8g），沸水浴10min，过滤，去除凝固的蛋白质。清夜流入732阳离子交换柱（H⁺型，25×265mm），去离子水洗脱，收集海藻糖组分，流入717阴离子交换柱（OH^-型，39×370mm），去离子水洗脱，收集海藻糖组分，然后流入122树脂脱色柱（H⁺型，15×230mm），去离子水洗脱，收集无色海藻糖组分，滤膜（孔径为0.45μm）微滤得清液。50℃减压浓缩至约15ml，边搅拌边加入4体积冷冻无水乙醇，于4℃静置过夜后，过滤收集晶体，50℃真空干燥5h后，称重为6.1g，总提取收率为62.2%。

附图2为上述发酵罐中，海藻糖、葡萄糖含量与发酵时间的关系图，从中可以看出，发酵至57h时，发酵液中海藻糖的产量达到10mg/ml以上，65h时，达到最高产量12.1mg/ml。

实施例五

本发明制备的海藻糖的检测：

（1）取上述实施例三制备得到的海藻糖，进行红外光谱测试。附图3为本发明制备的海藻糖的红外光谱图，附图4为海藻糖标准品红外光谱图，通过分析两者各主要峰的位置和形态基本一致，可以证明本发明制备得到的产品为高纯度海藻糖。

（2）美拉德反应：于5ml 2%的葡萄糖、麦芽糖及实施例四制备的海藻糖样品水溶液中，分别加入50mg蛋白胨，溶解后，测定O.D₄₈₀，沸水浴加热反应3h后，测定O.D₄₈₀。结果如表2所示，海藻糖样品几乎无美拉德反应，符合其非还原性糖的特性。

表2 葡萄糖、麦芽糖标准品及海藻糖样品美拉德反应比较

。

Claims

1.一株短小杆菌Curtobacterium sp. SY311菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址是中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2013年1月21日，保藏号为CGMCC No.7181。

2.应用权利要求1所述短小杆菌CGMCC No.7181发酵制备海藻糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：按质量体积比，所述步骤（1）中培养基的组成为1%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.5%麦芽汁，0.5%酪胨，0.2%牛肉膏，0.2%甘油，0.005%失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（Tween80），0.1%MgSO₄·7H₂O，1.5%琼脂，其余为水。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中发酵温度28～32℃，通气量0.6～0.8∶1（V/V），搅拌速度180～200rpm，发酵pH为5.5～6.0。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中的阳离子交换柱为732阳离子交换柱，阴离子交换柱为717阴离子交换柱。