CN107502555B - 一种地顶孢霉的发酵培养基及其发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种地顶孢霉的发酵培养基及其发酵工艺。包括以下成分及其含量：蔗糖5‑20g/L，葡萄糖20‑55g/L，蛋白胨10‑20g/L，酵母粉10‑20g/L，玉米淀粉20‑40g/L，硫酸镁0.1‑1g/L，磷酸二氢钾0.1‑1g/L，磷酸氢二钾0.1‑2g/L，硫酸铵0.001‑0.1g/L，保护剂5‑10g/L，混合剂10‑20g/L；保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β‑葡聚糖按重量比1‑3:1‑2:3‑5组成；混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比2‑3:1‑4:2‑3组成。本发明发酵培养基不仅能够促进地顶孢霉的大量繁殖，而且显著提高了虫草素的含量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种地顶孢霉的发酵培养基及其发酵工艺。
背景技术
地顶孢霉(Acremonium terricola)是一种虫草真菌，它多是寄生于虫草之中，能够合成多种药理活性物质，其菌丝体及培养物含有多类药理活性成分，经测试，这些药理活性成分具有体外抗肿瘤活性以及增强动物体内免疫活性的功能，因此可用于饲料添加剂及药品和保健食品的制备。
目前分离鉴定的虫草真菌，大多在实验室条件下生长缓慢，培养周期长，而且其菌丝体中营养物质和功能活性物质的含量也较低。与其他虫草真菌相比，地顶孢霉则不要求严格的高营养条件，而且生长快、虫体外培养和发酵周期均较短，因而成为众多科研工作者的热门研究对象。
中国专利(CN1091150C)公开了地顶芽孢霉CGMCC0346及分离培养方法和发酵工艺方法，其所用液体发酵培养基成分为白砂糖，蚕蛹粉和酵母粉和水，而发酵得到的地顶孢霉培养物中虫草素等功能成分含量较少。
中国专利(CN103756916B)公开了一种地顶孢霉诱变株及其应用。该发明通过紫外诱变筛选获得地顶孢霉MKL18，其菌丝提取物具有体外抗肿瘤活性以及增强动物体内免疫活性的功能，可用于药品和保健食品的制备；地顶孢霉MKL18经过液固二相发酵，其发酵产物经过干燥、粉碎后可直接作为饲料添加剂；但是地顶孢霉经过液固二相发酵后，分泌的产物与固体培养基难以分离，不利于发酵产物的获得。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种地顶孢霉的发酵培养基及其发酵工艺。
本发明通过以下技术方案实现：
一种地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量组成：蔗糖5-20g/L，葡萄糖20-55g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母粉10-20g/L，玉米淀粉20-40g/L，硫酸镁0.1-1g/L，磷酸二氢钾0.1-1g/L，磷酸氢二钾0.1-2g/L，硫酸铵0.001-0.1g/L，保护剂5-10g/L，混合剂10-20g/L；
所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比1-3:1-2:3-5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比2-3:1-4:2-3组成。
优选地，所述发酵培养基由以下成分及其含量组成：蔗糖12g/L，葡萄糖35g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，玉米淀粉25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸铵0.05g/L，保护剂8g/L，混合剂12g/L。
优选地，所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比2:1:5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比3:1:2组成。
一种地顶孢霉的发酵工艺，包括下述步骤：
S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25-28℃培养4-5天，制得斜面试管菌种；
S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，25-35℃，200-250rpm，培养20-50h，得种子培养液；
S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量20-25％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH控制为5-7，培养温度控制在25-27℃，搅拌转速控制在110-130r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵20-30h。
优选地，步骤S1中所用斜面培养基为马铃薯150-200g/L，葡萄糖15-25g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH6-7。
优选地，步骤S2中所用种子培养基为：蔗糖30-50g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-10g/L，玉米淀粉10-25g/L，硫酸镁0.1-1g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，pH5-7。
优选地，步骤S2发酵培养10-15h后向发酵罐中加入1.5-3g/L腺苷。
研究证明，发酵培养基中不同的C/N比能显著影响菌体的生长。本发明科学地调配发酵培养基中各营养物质的含量。并且本发明技术人员发现，添加由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按特定配比组成份混合剂于发酵培养基，不仅能够促进地顶孢霉的生长，而且能够显著提高虫草素等代谢物的含量，提高了地顶孢霉培养物的使用价值。
本发明发酵培养基中含有由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖组成的保护剂。脱水果糖是经a-1,4-葡聚糖裂解酶对糖原及淀粉降解得到，具有抗氧化活性、抗菌功能；酵母β-葡聚糖是从酵母中提取得到的β-葡聚糖，具有抗氧化功能，并对细胞生长具有促进作用；本发明将聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖共同加入发酵培养基中不仅能够防止发酵培养基营养成分在高温灭菌环境中营养成分的丢失，而且能够有效保护地顶孢霉发酵液中各种有益的代谢物。
与现有技术相比，本发明具有以下技术优势：
(1)本发明发酵培养基不仅能够促进地顶孢霉的快速大量繁殖，而且显著提高了菌体中虫草素的含量；
(2)本发明发酵工艺采用液体发酵技术，对各项发酵参数进行了优化，并在发酵过程中添加腺苷，显著提高了地顶孢霉培养物中活性成分的含量；
(3)本发明发酵工艺操作简单，可适用于地顶孢霉培养物的大量获得。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
本发明所用玉米淀粉购于临沂恒源实业有限公司；蚯蚓粉购于陕西迪隆生态环保技术有限公司；发芽糙米购于广州市里阳食品有限公司；耕土源于华南农业大学试验田，其它药品均购于国药集团化学试剂有限公司。
实施例1一种地顶孢霉的发酵培养基
所述地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量组成：蔗糖5g/L，葡萄糖55g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，玉米淀粉40g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸铵0.1g/L，保护剂5g/L，混合剂10g/L；
所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比1:1:3组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比2:1:2组成。
实施例2一种地顶孢霉的发酵培养基
所述地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量组成：蔗糖20g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉20g/L，玉米淀粉40g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，硫酸铵0.001g/L，保护剂10g/L，混合剂20g/L；
所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比3:2:5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比3:4:3组成。
实施例3一种地顶孢霉的发酵培养基
所述地顶孢霉的发酵培养基，由以下成分及其含量组成：蔗糖12g/L，葡萄糖35g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，玉米淀粉25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸铵0.05g/L，保护剂8g/L，混合剂12g/L。
优选地，所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比2:1:5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比3:1:2组成。
实施例4一种地顶孢霉的发酵工艺
所述地顶孢霉的发酵工艺，包括下述步骤：
S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于25℃培养4天，制得斜面试管菌种；所用斜面培养基为马铃薯150g/L，葡萄糖15g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH6；
S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，25℃，200rpm，培养20h，得种子培养液；所用种子培养基为：蔗糖30g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，玉米淀粉10g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH值为5；
S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量20％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH控制为5，培养温度控制在25℃，搅拌转速控制在110r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养10h后向发酵罐中加入1.5g/L腺苷，然后继续发酵至20h。
实施例5一种地顶孢霉的发酵工艺
所述地顶孢霉的发酵工艺，包括下述步骤：
S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于28℃培养5天，制得斜面试管菌种；所用斜面培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖25g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH值为7；
S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，35℃，250rpm，培养50h，得种子培养液；所用种子培养基为：蔗糖50g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，玉米淀粉25g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH值为7；
S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量25％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH值控制为7，培养温度控制在27℃，搅拌转速控制在130r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养15h后向发酵罐中加入3g/L腺苷，然后继续发酵至30h。
实施例6一种地顶孢霉的发酵工艺
所述地顶孢霉的发酵工艺，包括下述步骤：
S1.将地顶孢霉接种到斜面培养基中，于27℃培养5天，制得斜面试管菌种；所用斜面培养基为马铃薯175g/L，葡萄糖20g/L，水1000mL，琼脂粉20g/L，pH值为6.5；
S2.将步骤S1制得的斜面试管菌种进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，30℃，220rpm，培养30h，得种子培养液；所用种子培养基为：蔗糖45g/L，蛋白胨8g/L，酵母粉8g/L，玉米淀粉15g/L，硫酸镁0.7g/L，磷酸二氢钾3.5g/L，pH值为6.5；
S3.将步骤S2制备得到的种子培养液按接种量23％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵过程中pH控制为6.5，培养温度控制在26℃，搅拌转速控制在120r/min，溶氧浓度控制在30％以上，发酵培养12h后向发酵罐中加入2g/L腺苷，然后继续发酵至25h。
对比例1一种地顶孢霉的发酵培养基
与实施例3的区别在于，所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比1:1:1组成，其它均与实施例3相似。
对比例2一种地顶孢霉的发酵培养基
与实施例3的区别在于，所述保护剂中用谷氨酸替换了脱水果糖，其它均与实施例3相似。
试验例1发酵菌体干重的测定
(1)试验对象：用实施例1-3及对比例1-2地顶孢霉的发酵培养基分别按实施例6地顶孢霉的发酵工艺发酵得到的发酵液。
(2)试验方法：将上述各组发酵液过200目筛网，用蒸馏水冲洗菌体至洗出液无色，收集菌丝于60℃烘箱中烘干至恒重。
(3)试验结果：如下表1所述。
表1不同组发酵后菌丝体产量
| 组别 | 菌体干重(g/L) |
| 实施例1 | 13.23±0.24**<sup>##</sup> |
| 实施例2 | 15.68±0.68**<sup>##</sup> |
| 实施例3 | 18.98±0.56**<sup>##</sup> |
| 对比例1 | 10.24±0.38 |
| 对比例2 | 13.17±0.42 |
注：**表示与对比例1相比，P<0.01；##表示与对比例2相比，P<0.01。
由表1可知，实施例3组中发酵液中菌体干重高于实施例1和实施例2组，说明实施例3为最佳实施例。与对比例1相比，实施例3组中菌体干重极为显著的提高(P<0.01)，说明本发明混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土比重的变化能显著影响发酵液菌体繁殖，从而影响最终发酵液中菌体的干重。
试验例2虫草素含量的测定
(1)试验对象：试验例1中烘干得到的用实施例1-3及对比例1-2地顶孢霉的发酵培养基分别按实施例6地顶孢霉的发酵工艺发酵得到的烘干菌体。
(2)试验方法：取已烘干菌体并以1∶10料液比添加50％乙醇，于50℃超声波中超声提取60min后，离心，将上清液用50％的乙醇溶液定容至10mL，取1mL用0.45μm滤膜过滤，滤液用安捷伦1200液相色谱测定，色谱柱为Prodigy ODS－C18反相色谱柱，4.6×250mmi.d.，5μm，进样量20μL，流动相为甲醇和0.02mol/L的磷酸二氢钾，体积比为15∶85，流速1.0mL/min，检测波长为260nm，测定温度为40℃。
(3)试验结果：如下表2所示。
表2不同组发酵后菌丝体中虫草素含量
| 组别 | 虫草素含量(mg/kg) |
| 实施例1 | 288.64±22.36**<sup>##</sup> |
| 实施例2 | 265.82±25.42**<sup>##</sup> |
| 实施例3 | 326.86±32.74**<sup>##</sup> |
| 对比例1 | 228.24±18.38 |
| 对比例2 | 204.88±35.86 |
注：**表示与对比例1相比，P<0.01；##表示与对比例2相比，P<0.01。
由表2可知，实施例3组中发酵液中菌体中虫草素含量高于实施例1和实施例2组，说明实施例3为最佳实施例。与对比例1、对比例2相比，实施例3组中菌体中虫草素含量均极为显著的提高(P<0.01)。
由以上可知，本发明发酵培养基不仅能够促进地顶孢霉的快速大量繁殖，而且显著提高了菌体中虫草素的含量。
Claims (3)
1.一种地顶孢霉的发酵培养基，其特征在于，包括以下成分及其含量：蔗糖5-20g/L，葡萄糖20-55g/L，蛋白胨10-20g/L，酵母粉10-20g/L，玉米淀粉20-40g/L，硫酸镁0.1-1g/L，磷酸二氢钾0.1-1g/L，磷酸氢二钾0.1-2g/L，硫酸铵0.001-0.1g/L，保护剂5-10g/L，混合剂10-20g/L；
所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比1-3:1-2:3-5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比2-3:1-4:2-3组成。
2.根据权利要求1所述地顶孢霉的发酵培养基，其特征在于，由以下成分及其含量组成：蔗糖12g/L，葡萄糖35g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，玉米淀粉25g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，硫酸铵0.05g/L，保护剂8g/L，混合剂12g/L。
3.根据权利要求1所述地顶芽孢霉的发酵培养基，其特征在于，所述保护剂由聚乙烯吡咯烷酮、脱水果糖和酵母β-葡聚糖按重量比2:1:5组成；所述混合剂由蚯蚓粉、发芽糙米浆和耕土按重量比3:1:2组成。
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