CN109182135A - 一种地顶孢霉摇瓶培养基及其应用 - Google Patents

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刘宗新
蒋顺进
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Abstract

本发明涉及一种地顶孢霉的摇瓶培养基及其制备方法，本发明的摇瓶培养基包括以下成分：硝酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、蔗糖和吐温，pH5‑7。本发明的摇瓶培养基能够促进地顶孢霉快速大量繁殖，且能够显著提高地顶孢霉中虫草素的含量。

Description

一种地顶孢霉摇瓶培养基及其应用
技术领域
本发明涉及真菌培养和发酵领域，具体涉及一种地顶孢霉摇瓶培养基及其应用。
背景技术
地顶孢霉(Acremonium terricola)培养物是由古尼虫草中分离的地顶孢霉经人工发酵得到的产品，拥有虫草素、虫草酸、氨基酸、多糖等多种活性成分，其中虫草酸能够抑制各组病菌的成长，可以预防与治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞等多种疾病。但是野生虫草资源稀缺，难以满足需求，提供人工深层发酵地顶孢霉的方法，改变了以往要从野生子实体中提取有效生物活性成分的局面。
专利CN1259570A中公开了中国新纪录种地顶孢霉CGMCC0346及分离培养方法和发酵工艺方法，其在察氏培养基上25℃培养10天，形成菌落。察氏培养基成分为：硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂和水，发酵得到的地顶孢霉培养物中虫草素等功能成分含量较少。
专利CN103734482A公开了一种饲料添加剂“地顶孢霉培养物”的生产方法。该生产方法通过对地顶孢霉菌种生长特性的研究，将地顶孢霉培养物的生产工艺进行了改进，改进后的生产工艺将地顶孢霉培养物的生产周期由原先的11-15天缩短至5天，大幅度降低了地顶孢霉的生产成本。
本发明中提供的地顶孢霉摇瓶培养基成分简单容易获取，质量可控，且显著提高地顶孢霉中虫草酸的含量，降低生产成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种地顶孢霉的摇瓶培养基，以及利用该培养基制备地顶孢霉培养物的方法。本发明的摇瓶培养基与传统的摇瓶培养基相比，缩短了培养时间，显著提高了地顶孢霉中虫草酸的含量。
本发明提供一种地顶孢霉的摇瓶培养基，包括以下成分及其含量：硝酸钠1-5g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、磷酸氢二钾0.1-1g/L、氯化钾0.1-1g/L、硫酸镁0.1-1g/L、硫酸亚铁0.01-0.1g/L、蔗糖10-100g/L和吐温0.1-1g/L。
在本发明一个的实施方案中，所述摇瓶培养基包括以下成分及其含量：硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾0.7g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和吐温0.5g/L。
在本发明一个的实施方案中，所述摇瓶培养基包括以下成分及其含量：硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和吐温0.8g/L。
在本发明一个的实施方案中，所述摇瓶培养基包括以下成分及其含量：硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和吐温0.3g/L。
在本发明的一个实施方案中，摇瓶培养基灭菌后的培养基pH可以为5、6、6.5或7。
本发明还提供了一种利用以上所述的摇瓶培养基培养地顶孢霉的方法，包括以下步骤：将地顶孢霉接种到斜面培养基中，培养4-9天，制得斜面试管菌种；将斜面试管菌种接种到摇瓶培养基中进行培养，然后移至种子罐中进行种子培养，得种子培养液；最后将种子培养液接种到发酵罐中发酵，得到地顶孢霉发酵液。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述地顶孢霉在摇瓶培养时，培养温度为25-30℃，搅拌速度为100-150rpm，培养时间为48小时。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述斜面培养基包含马铃薯150-200g/L、葡萄糖15-25g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L，pH6-7。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述的发酵培养基包含蔗糖5-20g/L、葡萄糖20-55g/L、蛋白胨10-20g/L、酵母粉10-20g/L、玉米淀粉20-40g/L、硫酸镁0.1-1g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、磷酸氢二钾0.1-2g/L和硫酸铵0.001-0.1g/L，pH5-7。
本发明提供的制备地顶孢霉摇瓶培养基具有培养时间短、有效成分含量高等优点。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1：地顶孢霉摇瓶培养基的制备方法
按照表1中各组分的含量配置摇瓶培养基，配置完成后121℃高压灭菌、冷却备用。灭菌后的摇瓶培养基无杂菌培养，灭菌后调节pH为6。
表1摇瓶培养基成分
备注：/表示不添加
实施例2：地顶孢霉培养物的制备
1、种子培养
筛选优良的地顶孢霉接种到斜面培养基中，25℃培养4天，斜面培养基成分为：马铃薯150g/L、葡萄糖15g/L、水1000ml和琼脂粉20g/L，pH6，制得斜面试管菌种；再将制得的斜面试管菌种分为四组，分别接种到实施例1在配置好的摇瓶培养基中进行摇瓶培养，然后移至种子罐中进行种子培养，种子培养基成分为：蔗糖30g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、玉米淀粉10g/L、硫酸镁0.1g/L和磷酸二氢钾1g/L，pH5。培养温度为30℃，转速为250rpm，培养20小时，得种子培养液。
2、发酵
将制备得到的种子培养液按接种量20-25％接种到装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵培养基的成分为：蔗糖5g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、玉米淀粉20g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L和硫酸铵0.001g/L，pH5。发酵过程中pH控制为6左右，培养温度控制在25-27℃，培养48小时，培养终止，得到含有虫草素的地顶孢霉培养物发酵液。
将各组发酵液取相同体积的样品后过200目筛网，用蒸馏水冲洗菌体至洗出液无色，收集菌丝于60℃烘箱中烘干至恒重，各组发酵后菌丝体产量见表2。
将烘干的菌体并以1:10料液比添加50％乙醇，于48℃超声波中超声提取1小时后离心，将上清液用50％的乙醇溶液定容至10mL，取1mL用0.45μm滤膜过滤后，滤液用安捷伦液相色谱测定，流动相为甲醇和0.02mol/L的磷酸二氢钾，虫草素检测结果见表3，由表中可见，试验组的的摇瓶培养基均能够促进地顶孢霉的快速大量繁殖，而且显著提高了菌体中虫草素的含量。
表2各组发酵后菌丝体产量
组别 菌体干重g/L
1 17.3
2 22.5
3 21.8
4 22.0
表3各组虫草素含量
组别 虫草素含量mg/kg
1 300.4
2 336.1
3 325.6
4 319.8
3、吸附、混合
将地顶孢霉液体深层发酵液经膨化玉米粉、麸皮、碳酸钙粉吸附，并搅拌混合均匀。
4、烘干、粉碎
将地顶孢霉培养物的吸附混合成分湿样，经控温控湿烘干房烘干至水分小于10％，后粉碎过筛、包装得产品。

Claims (7)

1.一种地顶孢霉的摇瓶培养基，其特征在于，包括以下成分及其含量：硝酸钠1-5g/L、磷酸二氢钾0.1-1g/L、磷酸氢二钾0.1-1g/L、氯化钾0.1-1g/L、硫酸镁0.1-1g/L、硫酸亚铁0.01-0.1g/L、蔗糖10-100g/L和吐温0.1-1g/L。
2.根据权利要求1所述的摇瓶培养基，其特征在于，包括以下成分及其含量：硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾0.7g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和吐温0.5g/L。
3.根据权利要求1所述的摇瓶培养基，其特征在于，包括以下成分及其含量：硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和吐温0.8g/L。
4.根据权利要求1所述的摇瓶培养基，其特征在于，包括以下成分及其含量：硝酸钠2g/L、磷酸二氢钾0.3g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、蔗糖30g/L和吐温0.3g/L。
5.根据权利要求1所述的摇瓶培养基，其特征在于，灭菌后的培养基pH为5-7。
6.一种利用权利要求1所述的摇瓶培养基培养地顶孢霉的方法，其特征在于，包括以下步骤：将地顶孢霉接种到斜面培养基中，培养4-9天，制得斜面试管菌种；将斜面试管菌种接种到摇瓶培养基中进行培养，然后移至种子罐中进行种子培养，得种子培养液；最后将种子培养液接种到发酵罐中发酵，得到地顶孢霉发酵液。
7.根据权利要求6的培养方法，其特征在于，地顶孢霉在摇瓶培养时，培养温度为25-30℃，搅拌速度为100-150rpm，培养时间为48小时。
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