CN114015579B - 一种高产β-葡聚糖的出芽短梗霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及饲料添加剂技术领域，特别涉及一种高产β‑葡聚糖的出芽短梗霉及其在固体发酵生产β‑葡聚糖饲料添加剂中的应用。所述菌株具体为出芽短梗霉(Aureobasidiumpulluans)A333，菌种保藏编号为CGMCC NO.23063。采用该菌株生产的饲料添加剂以来源广泛、价格低廉的农业副产物为原料，加入合适的碳源，以固体发酵方式进行生产，得到的产物含有大量β‑葡聚糖，适用于家禽、水产动物等饲料的添加，应用范围广泛。

Description

一种高产β-葡聚糖的出芽短梗霉及其应用
技术领域：
本发明涉及饲料添加剂技术领域，特别涉及一种高产β-葡聚糖的出芽短梗霉及其在固体发酵生产β-葡聚糖饲料添加剂中的应用。
背景技术：
随着畜牧行业的高速发展，抗生素等饲料添加剂的大量使用危害到人体健康。为此，根据中华人民共和国农业农村部公告第194号，农业农村部决定停止生产、进口、经营、使用部分药物饲料添加剂，自2020年7月1日起，饲料生产企业要停止使用含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。饲料行业的全面禁抗，将会推动畜禽养殖无抗化的发展，但是，对畜牧企业的优质化养殖、畜牧安全健康生产等带来巨大挑战。
近年来，生物发酵饲料产品呈稳定增长趋势，发酵蛋白饲料、发酵能量饲料等产品快速增多。农业农村部发布的2045号文件规定允许用于饲料的微生物添加剂的菌种有34种，包括酵母菌、霉菌、乳酸菌、芽孢杆菌等。出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)又名暗金黄担子菌、黑酵母菌，是FDA认证的普遍认为安全可食用的微生物，存在于多种生活环境，是一种生活史极为复杂的类酵母型真菌。在不同的生长阶段和培养条件下，出芽短梗霉细胞可以呈现出酵母状、芽孢子、肿胀孢子、菌丝状等形态，在其细胞壁周边会产生多糖物质，不同的形态会产生不同的产物，主要产物有普鲁兰多糖、聚苹果酸、葡聚糖等。
葡聚糖是一种以葡萄糖为组成单元的同型多糖，葡萄糖单元间以糖苷键连接，根据其糖苷键类型可分为α-葡聚糖和β-葡聚糖，其中β-葡聚糖的生理活性最高。β-葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁、谷物、子实体中，谷物类植物来源的β-葡聚糖主要以β-1,3和β-1,4糖苷键连接，其他微生物来源的主要以β-1,3和β-1,6糖苷键连接。已有研究表明，β-1,3，β-1,6葡聚糖在家禽中可以作为免疫调节剂对肉鸡缓解疾病或病毒感染带来的机体损伤，对家畜和水产动物也具有提高免疫力和生产性能的作用。β-葡聚糖作为免疫增强剂越来越受到关注，是一种新型的环保型绿色饲料添加剂。
中国发明专利申请202011086751.1提供了一株β-葡聚糖产量提高的出芽短梗霉及其应用，其特点是通过诱变得到一株出芽短梗霉，其突变株的胞内UDPG 含量及β-葡聚糖含量均较出发菌株提高，β-葡聚糖产量达到4.31～4.53g/L；
中国发明专利申请201710139784.X提供了一种筛选得到的出芽短梗霉在作为微生物肥料农业生产中的应用，其特点是筛选出的出芽短梗霉及其发酵物质作为微生物肥料，能够有效的抑制和防止蔬菜灰霉菌的病害发生，并且可以增加土壤肥力和促进植物生长。
目前关于采用出芽短梗霉固体发酵获得含有β-葡聚糖饲料添加剂的研究还未有报道，并且现有技术中出芽短梗霉生产的β-葡聚糖存在产量较低的问题。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明提供一株高产β-葡聚糖的出芽短梗霉及其进行固体发酵生产饲料添加剂的方法，该方法以来源广泛、价格低廉的农业副产物为原料，加入合适的碳源，以固体发酵方式进行生产，得到的产物含有大量β- 葡聚糖，适用于家禽、水产动物等饲料的添加，应用范围广泛。
本发明提供的技术方案之一，是一株出芽短梗霉，具体为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)A333，该菌株已于2021年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO.23063，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)A333由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ACCC 30356经诱变得到。出芽短梗霉A333经诱变后不再产黑色素，并且可以以蔗糖、糖蜜、葡萄糖、麦芽糖等为碳源，发酵生产β-葡聚糖，发酵液产量达到10-14g/L，为目前现有技术中的最高水平。
本发明提供的技术方案之二，是出芽短梗霉A333在生产β-葡聚糖中的应用；
进一步地，出芽短梗霉发酵生产β-葡聚糖的方法如下：
将种子液按3-5％的接种量接入以农业副产物和蔗糖为原料的培养基中进行液体发酵，发酵温度25-28℃，转速180-200r/min，发酵时间120-144h，β-葡聚糖产量达到10-14g/L；
进一步地，液体发酵采用的发酵培养基为：农业副产物0.3-1.0％(w/v)，蔗糖3-10％(w/v)，其余为水，pH6-7；
进一步地，所述农业副产物为稻糠、麦麸、豆粕、甜菜粕、秸秆、麦芽加工副产物、啤酒糟加工副产物中的至少一种。
本发明提供的技术方案之三，是采用出芽短梗霉A333固态发酵生产高含β- 葡聚糖的饲料添加剂的方法，具体如下：
固态发酵培养基的制备：以稻糠、麦麸、豆粕、甜菜粕、秸秆、麦芽加工副产物或啤酒糟加工副产物中的至少一种为原料，粉碎后过20目筛，100℃以上高温蒸料30min及以上，添加经过灭菌的同等质量含有5-10％蔗糖的水溶液或含有5-10％蔗糖的糖蜜水溶液，混合均匀后冷却即可；
固态发酵方法：将种子培养液按照5-10％(v/m)的接种量接种于固体发酵培养基中，轻轻翻拌均匀，在26-30℃条件下发酵5-6天，每日翻曲，保持疏松状态，湿度维持在50-60％，发酵结束后即可得到含有β-葡聚糖的饲料添加剂。
本发明还提供上述固态发酵生产的饲料添加剂在家禽、水产动物等饲料中的应用。
有益效果：
本发明是以高产β-葡聚糖的出芽短梗霉为菌种，以稻糠、麦麸、豆粕、甜菜粕、秸秆、麦芽加工副产物、啤酒糟加工副产物或者其复合物为原料，辅以糖蜜或蔗糖作为碳源，在一定温度、溶氧及湿度条件下经固体发酵生产含有β-葡聚糖的饲料添加剂的方法。与现有技术相比本发明有以下优点：
出芽短梗霉是一种随着发酵时间会产生黑色素的菌株(如图3)，黑色素会影响成品的外观以及多糖的提取，本发明以一株不产色素(在平板或者发酵培养中，不论培养多长时间均不产黑色素，固体培养基上菌落为米白色，液体培养中也为米白色，如图1、2)且β-葡聚糖产量较高的出芽短梗霉为发酵菌株，菌株安全且稳定；本发明以廉价易得、来源广泛的农业加工副产物为发酵原料，采用生物发酵的方法，增加了对农业副产物的回收利用；本发明采用的原料成分来源明确，通过发酵即可获得含有β-葡聚糖的固体发酵产物作为饲料添加剂；本发明采用的固体发酵培养基配方简单，质量可控，成本低廉，发酵产糖产率高，可用于工业大规模生产；本发明采用绿色生产工艺，操作过程简单且无废水、废物排放，实现绿色生产富含β-葡聚糖饲料添加剂的产品。
附图说明：
图1为出芽短梗霉ACCC30356(左图)和诱变后的出芽短梗霉A333的菌落图片(右图)；
图2为实施例1发酵完成后液体培养液及β-葡聚糖图片；
图3为出芽短梗霉ACCC30356采用实施例1的方法发酵完成后液体培养液；
图4为实施例4麦麸发酵前(左图)和麦麸发酵后(右图)的图片。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明实施例所使用的发酵菌种为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)A333，菌种保藏编号为CGMCC NO.23063。
以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
实施例1：出芽短梗霉A333液体发酵高产β-葡聚糖的方法
(1)出芽短梗霉种子液制备：配制100mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基 (YPD培养基：酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，其余为水)，在无菌条件下接入一环出芽短梗霉单菌落，置于28℃180r/min，培养24h即可；
(2)出芽短梗霉发酵培养基(w/v)：稻糠(1.0％)，蔗糖(5％)，其余为水，调节pH至6-7，高温灭菌即可；
(3)发酵：按照3％(v/v)的接种量将出芽短梗霉种子液接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，于180r/min的转速下摇床培养144h；
(4)β-葡聚糖的收集：发酵结束后，将发酵液于10000r/min离心20min，收集上清加入4倍体积的无水乙醇，得到的沉淀即为β-葡聚糖；
(5)β-葡聚糖产量的检测：按照苯酚硫酸法测得β-葡聚糖的发酵液产量为11.38g/L。
实施例2：出芽短梗霉A333液体发酵高产β-葡聚糖的方法
(1)出芽短梗霉种子液制备：配制100mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在无菌条件下接入一环出芽短梗霉单菌落，置于28℃180r/min，培养24 h即可；
(2)出芽短梗霉发酵培养基(w/v)：麦麸粉(1.0％)，蔗糖(5％)，其余为水，调节pH至6-7，高温灭菌即可；
(3)发酵：按照3％(v/v)的接种量将出芽短梗霉种子液接种于发酵培养基中，发酵温度28℃，于180r/min的转速下摇床培养144h；
(4)β-葡聚糖的收集：发酵结束后，将发酵液于10000r/min离心20min，收集上清加入4倍体积的无水乙醇，得到的沉淀即为β-葡聚糖；
(5)β-葡聚糖产量的检测：按照苯酚硫酸法测得β-葡聚糖的产量为12.85g/L。
通过以上述实施例可以看出，此株出芽短梗霉能够以农业副产物为原料发酵高产β-葡聚糖，因此可将其应用于饲料添加剂固体发酵中。
实施例3：出芽短梗霉A333固体发酵生产含β-葡聚糖的饲料添加剂的方法
(1)出芽短梗霉种子液制备：配制100mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在无菌条件下接入一环出芽短梗霉单菌落，置于28℃180r/min，培养24h 即可；
(2)固体发酵培养基制备：稻糠粉碎后过20目筛，称取50g左右，110℃高温蒸料30min，加入高温灭菌的含有10％蔗糖的水溶液50g，搅拌均匀后，冷却至室温即可；
(3)发酵：接入10％(v/m)的出芽短梗霉种子液于固体发酵培养基中，轻轻搅拌均匀，发酵过程中补加含有10％蔗糖的水溶液保持其湿度50-60％，发酵温度28℃，发酵时间5天，每日翻拌，保持疏松状态；
(4)发酵结束后，即可得到含有β-葡聚糖的饲料添加剂；
(5)多糖含量检测：取烘干至恒重后的固体发酵物5g，加入10ml水震荡混匀后过滤，取滤液加入4倍体积的无水乙醇沉淀β-葡聚糖，4℃放置过夜，然后10000r/min离心收集沉淀，复溶后采用苯酚硫酸法测定β-葡聚糖的含量为41.12±3.90mg/g；
(6)同时经过检测分析，产物里的谷维素含量为0.8mg/g左右，粗蛋白含量为30.3mg/g。
实施例4：出芽短梗霉A333固体发酵生产含β-葡聚糖的饲料添加剂的方法
(1)出芽短梗霉种子液制备：配制100mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在无菌条件下接入一环出芽短梗霉单菌落，置于28℃，180r/min，培养24h即可；
(2)固体发酵培养基配制：麦麸粉碎后过20目筛，称取50g左右，110℃高温蒸料30min，加入高温灭菌的含有10％蔗糖的水溶液50g，搅拌均匀后，冷却至室温即可；
(3)发酵：接入10％(v/m)的出芽短梗霉种子液于固体发酵培养基中，轻轻搅拌均匀，发酵过程中补加含有10％蔗糖的水溶液保持其湿度50-60％，发酵温度28℃，发酵时间5天，每日翻拌，保持疏松状态；
(4)发酵结束后，即可得到含有β-葡聚糖的饲料添加剂；
(5)多糖含量检测：取烘干至恒重后的固体发酵物5g，加入10ml水震荡混匀后过滤，取滤液加入4倍体积的无水乙醇沉淀β-葡聚糖，4℃放置过夜，然后10000r/min离心收集沉淀，复溶后采用苯酚硫酸法测定β-葡聚糖的含量为23.47±3.53mg/g；
同时经过检测分析，产物的粗蛋白含量为49.6mg/g。
图4为实施例4麦麸发酵前(左图)和麦麸发酵后(右图)的图片，并未见黑色素产生。
实施例5：出芽短梗霉A333固体发酵生产含β-葡聚糖的饲料添加剂的方法
(1)出芽短梗霉种子液制备：配制100mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在无菌条件下接入一环出芽短梗霉单菌落，置于28℃，200r/min，培养 24h即可；
(2)固体发酵培养基制备：秸秆粉碎后过20目筛，称取50g左右，110℃高温蒸料30min，加入高温灭菌的含有10％蔗糖的水溶液50g，搅拌均匀后，冷却至室温即可；
(3)发酵：接入10％(v/m)的出芽短梗霉种子液于固体发酵培养基中，轻轻搅拌均匀，发酵过程中补加含有10％蔗糖的水溶液保持其湿度50-60％，发酵温度28℃，发酵时间5天，每日翻拌，保持疏松状态；
(4)发酵结束后，即可得到含有β-葡聚糖的饲料添加剂；
(5)多糖含量检测：取烘干至恒重后的固体发酵物5g，加入10ml水震荡混匀后过滤，取滤液加入4倍体积的无水乙醇沉淀β-葡聚糖，4℃放置过夜，然后10000r/min离心收集沉淀，复溶后采用苯酚硫酸法测定β-葡聚糖的含量为25.41±2.08mg/g；
(6)同时经过检测分析，产物的粗蛋白含量为31.8mg/g。
实施例6：固体发酵生产含β-葡聚糖的饲料添加剂的方法
(1)出芽短梗霉种子液制备：配制100mL酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基，在无菌条件下接入一环出芽短梗霉单菌落，置于28℃，180r/min，培养 24h即可；
(2)固体发酵培养基制备：豆粕粉碎后过20目筛，称取50g左右，110℃高温蒸料30min，加入高温灭菌的含有10％蔗糖的糖蜜水溶液50g，搅拌均匀后，冷却至室温即可；
(3)发酵：接入10％(v/m)的出芽短梗霉种子液于固体发酵培养基中，轻轻搅拌均匀，发酵过程中补加含有10％蔗糖的糖蜜水溶液保持其湿度 50-60％，发酵温度28℃，发酵时间5天，每日翻拌，保持疏松状态；
(4)发酵结束后，即可得到含有β-葡聚糖的饲料添加剂；
(5)多糖含量检测：取烘干至恒重后的固体发酵物5g，加入10ml水震荡混匀后过滤，取滤液加入4倍体积的无水乙醇沉淀β-葡聚糖，4℃放置过夜，然后10000r/min离心收集沉淀，复溶后采用苯酚硫酸法测定β-葡聚糖的含量为33.78±2.82mg/g；
(6)同时经过检测分析，产物的粗蛋白含量为504.3mg/g。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (7)

1.一株出芽短梗霉，其特征在于，具体为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)A333，菌种保藏编号为CGMCC NO.23063。
2.权利要求1所述出芽短梗霉A333在生产β-葡聚糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵生产β-葡聚糖的方法如下：
将出芽短梗霉A333种子液按3-5％的接种量接入以农业副产物和蔗糖为原料的培养基中进行液体发酵，发酵温度25-28℃，转速180-200r/min，发酵时间120-144h；
液体发酵采用的发酵培养基为：农业副产物0.3-1.0％，蔗糖3-10％，其余为水，pH6-7。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述农业副产物为稻糠、麦麸、豆粕、甜菜粕、秸秆、麦芽加工副产物、啤酒糟加工副产物中的至少一种。
5.权利要求1所述出芽短梗霉A333在生产饲料添加剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，固态发酵生产含β-葡聚糖的饲料添加剂的方法如下：
将出芽短梗霉A333种子培养液按照5-10％的接种量接种于固体发酵培养基中，翻拌均匀，在26-30℃条件下发酵5-6天，每日翻曲，保持疏松状态，湿度维持在50-60％，发酵结束后即可得到含有β-葡聚糖的饲料添加剂。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，固态发酵培养基的制备方法如下：以稻糠、麦麸、豆粕、甜菜粕、秸秆、麦芽加工副产物或啤酒糟加工副产物中的至少一种为原料，粉碎后过20目筛，110℃以上高温蒸料30min及以上，添加经过灭菌的同等质量5-10％蔗糖水溶液或含有5-10％蔗糖的糖蜜水溶液，混合均匀后冷却。
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