发明内容
本发明的一个目的在于提供一种微生物发酵制备奶牛饲料的方法,采用简便易行的发酵工艺,以制备一种适用于饲喂奶牛的饲料。
本发明的另一目的在于提供一种按照所述的微生物发酵方法制备得到的奶牛饲料,其中含有较高含量的粗蛋白,适用于饲喂奶牛。
一方面,本发明提供了一种微生物发酵制备奶牛饲料的方法,其中主要是选用优质的酵母菌和黑曲霉菌种、采用简便易行的微生物发酵工艺,对接种培养基进行深度发酵后,将细胞外代谢产物、细胞内容物以及变性培养基混合而制作奶牛饲料。
根据本发明的具体实施方案,本发明提供的微生物发酵制备奶牛饲料的方法包括:
将酵母按每环40~80ml的比例接种到麦芽汁增菌培养基(或称一级增菌培养基)中,28~32℃振荡22~32小时进行一级增菌培养;将黑曲霉按孢子量1.4~1.6×106个/ml培养基的比例接种于察氏培养基中,28~34℃振荡22~32小时进行一级增菌培养;
将上述分别经一级增菌培养的酵母菌液和黑曲霉菌液分别按照3~6∶1~2的质量比(除特别说明外,本发明中所述比例和含量均为质量比例和含量)混合接种到二级种子培养基(或称二级增菌培养基)中,接种量为4%~8%(混合菌液的质量为培养基质量的4%~8%),28~34℃振荡22~32小时进行二级增菌培养;
将上述经二级增菌培养的混合菌液与饲料发酵底物和水按照1∶240~360∶120~180的重量比混匀,在30~45℃条件下发酵36~72小时,将发酵结束后的物料烘干,并将烘干后的物料粉碎,即得饲料成品。
根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述酵母为选自啤酒酵母、热带假丝酵母中的至少两种菌株,例如可以是酵母菌株CGMCCAs 2.281、CGMCC As 2.597、CGMCC As 2.2、CGMCC As 2.159、CGMCCAs 2.587、CGMCC As 2.617、CGMCCAs2.1882中的至少两种,优选为包括两种啤酒酵母或包括一种啤酒酵母和一种热带假丝酵母。根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述黑曲霉包括至少一种黑曲霉菌株,例如可以是选自CGMCC As3.3882、CGMCC As3.4304、CGMCC As3.6472,优选包括CGMCC As3.4304。
在本发明的一具体实施方案中,是将一种啤酒酵母、一种热带假丝酵母和一种黑曲霉分别进行一级增菌培养,然后按照2~4∶1~2∶1~2的比例将一级增菌培养的菌液混合后进行二级增菌培养。
在本发明的优选方法中,所述至少两种酵母菌株分别按每环40~80ml的比例接种到麦芽汁增菌培养基中28~32℃振荡22~32小时进行一级增菌培养;所述麦芽汁增菌培养基是按以下方法制成的:
麦芽汁加6~10倍体积的水,糖度调节至4~10波林(Balling),pH调至5.5~6.5,在100~125℃温度下灭菌15~30分钟。
根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述察氏培养基是按以下方法制成的:
每1000ml蒸馏水中加入蔗糖30g、硝酸钠3g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸铁0.014g、磷酸氢二钾1.0g,混合均匀,调节pH为6.0~6.5,在温度100~125℃下灭菌15~30分钟。
根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述二级种子培养基是按以下方法制成的:
麦芽根粉15~24重量份、麸皮20~32重量份、糖蜜20~32重量份、硫酸铵10~16重量份、酵母浸粉10~16重量份、葡萄糖0.3~1.5重量份、磷酸二氢钾1.2~3.5重量份混合,再加前述混合物(麦芽根粉、麸皮、糖蜜、硫酸铵、酵母浸粉、葡萄糖、磷酸二氢钾的混合物)重量5~10倍的水,将pH值调节至4~6,在温度100~125℃下灭菌15~30分钟。
根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述饲料发酵底物是按以下方法制成的:
豆粕1~3重量份、棉粕8~10重量份、酒精粕6~15重量份、玉米7.5~15重量份、玉米纤维饲料25~35重量份、玉米皮4~8重量份、麸皮25~30重量份、硫酸铵6~10重量份混合均匀,制成饲料发酵底物。
根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述经二级增菌培养的混合菌液与饲料发酵底物和水混合步骤中,所述的水的pH值为4.0~6.5,所述饲料发酵底物的粒度为3~8mm,混合完毕后将混合物堆成高为35~65cm的梯形堆,在30~45℃条件下发酵36~72小时,优选48~72小时。
根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述烘干步骤是利用烘干机进行,其中,控制烘干机的进口温度不高于140℃,中间温度不高于50℃,出口温度不高于80℃。
根据本发明的优选具体实施方案,本发明的方法中,所述烘干后的物料的粉碎粒度为至少75%通过80目筛、至少95%通过40目筛、100%通过20目筛。
在本发明的一优选的具体实施方案中,本发明的微生物发酵制备奶牛饲料的方法是按照以下方法进行的:
将试管斜面上的啤酒酵母、热带假丝酵母(或者第一种啤酒酵母、第二种啤酒酵母)分别按每环40~80ml的比例接种于装有麦芽汁培养基(由麦芽汁加6~10倍体积的蒸馏水,糖度调节至4~10波林,pH调至5.5~6.5,在100~125℃温度下灭菌15~30分钟制成)的三角瓶中,塞上瓶塞,并用封口膜包好,在28~32℃、100~150转/分钟条件下振荡22~32小时进行一级增菌培养;将整孢子数数约为1.4~1.6×107个/ml的黑曲霉菌液,取30ml接种于装有300ml察氏培养基(由蔗糖30g、硝酸钠3g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸铁0.014g、磷酸氢二钾1.0g混合均匀,加入1000ml蒸馏水,调节pH为6.0~6.5,在温度121℃下灭菌15分钟制成)的三角瓶中,塞上瓶塞,并用封口膜包好,在28~34℃、120~180转/分钟条件下振荡22~32小时进行一级增菌培养;
再将分别经过一级增菌培养的啤酒酵母菌液与热带假丝酵母菌液(或者第一种啤酒酵母菌液与第二种啤酒酵母菌液)、黑曲霉菌液分别按2%~4%、1%~2%、1%~2%的质量比混合接种于装有二级种子培养基(由麦芽根粉15~24重量份、麸皮20~32重量份、糖蜜20~32重量份、硫酸铵10~16重量份、酵母浸粉10~16重量份、葡萄糖0.3~1.5重量份、磷酸二氢钾1.2~3.5重量份重量比混合,再加前述混合物重量5~10倍的自来水,调节pH值4~6,在温度100~125℃下,灭菌15~30分钟后,温度再降下到10~50℃制成)中,将接种好的培养基瓶在28~34℃、100~180转/分钟条件下振荡22~32小时进行二级增菌培养;
将上述经过二级增菌培养的混合菌液与水(事先用无机酸或有机酸例如HCl、柠檬酸等条件pH至4.0~6.5)、饲料发酵底物(由豆粕1~3重量份、棉粕8~10重量份、酒精粕6~15重量份、玉米7.5~15重量份、玉米纤维饲料(玉米纤维饲料是玉米提取淀粉后的副产品,经过玉米的浸泡液喷浆得到的,而得到的一种饲料)25~35重量份、玉米皮(玉米粒外的种皮)4~8重量份、麸皮25~30重量份、硫酸铵6~10重量份均匀混合制成,粒度为3~8mm)以1∶120~180∶240~360的重量比均匀混合,混合完毕后将其堆成高为30~65cm的梯形堆,同时以地暖在30~45℃条件下发酵36~72小时,发酵结束后用烘干机烘干,为减少烘干温度对饲料中活性组分的破坏,所述烘干步骤中,优选控制烘干机的进口温度不高于140℃,中间温度不高于50℃,出口温度不高于80℃,之后将烘干后的物料粉碎,优选的粉碎粒度为至少75%通过80目筛、至少95%通过40目筛、100%通过20目筛,粉碎后分装即成品。
本发明还提供了按照上述方法制备得到的奶牛饲料。该饲料中,粗蛋白含量在16%以上。利用本发明的饲料饲喂奶牛,可以部分或全部取代奶牛的日粮,由于本发明的饲料产品中富含蛋白质、氨基酸、寡糖、小分子肽、醇类、纤维素酶、淀粉酶、糖化酶等生物活性物质,这些活性物质能增加奶牛的抗应激能力,特别能够抵御热应激给奶牛带来的负面影响。利用本发明的饲料饲喂奶牛,能促进和维护瘤胃内微生物区系平衡,稳定瘤胃pH值,缓解高精料引起的奶牛酸中毒,降低瘤胃中氨的浓度,促进其对氮的利用,改善其微生态环境。本发明的奶牛饲料还能刺激瘤胃中纤维分解菌和乳酸菌的繁殖,提高奶牛对粗饲料的利用率,提高饲料的适口性,增加干物质的采食量,提高机体的抗病能力,提高产奶性能。
综上所述,本发明选用酵母菌和黑曲霉,采用简单易行且经济的发酵方法,制备得到了本发明的奶牛饲料。本发明的制备饲料的方法中,采用的菌种配伍科学合理,在培养过程中无相互排斥产生;并且发酵底物配比及粒度合理,符合每种菌种的发酵所需的营养及条件,能够充分发挥每种菌种的发酵潜力。本发明的饲料产品中富含生物活性物质,能增加奶牛的抗应激能力,能缓解高精料引起的奶牛酸中毒,促进对氮的利用,还能提高奶牛对粗饲料的利用率,提高饲料的适口性,增加干物质的采食量,提高机体的抗病能力,提高产奶性能。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点,但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。
实施例所用菌种
本发明以下实施例中所用酵母菌株CGMCC As 2.281、CGMCC As2.597、CGMCC As 2.2、CGMCC As 2.159、CGMCC As 2.587、CGMCC As2.617、CGMCCAs2.1882以及曲霉菌株(3株饲用黑曲霉CGMCC As3.3882、CGMCC As3.4304、CGMCC As3.6472和一株饲用米曲霉CGMCCAs3.2068)均为从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)商购获得。其中菌株As 2.2、As 2.597、As2.1882、As 2.587为啤酒酵母,菌株As 2.281、As 2.159、As 2.617为热带假丝酵母,它们的生物学特性及达到最大生物量的时间、细胞数、蛋白等参数性能如下表1和表2以及图1所示(分别按照本发明所述的一级增菌培养条件在本发明所述的麦芽汁增菌培养基中培养测定)。
表1各菌株达到最大生物量的时间
菌种 |
As2.281 |
As 2.597 |
As 2.2 |
As 2.159 |
As 2.587 |
As 2.617 |
As2.1882 |
时间(h) |
20 |
24 |
20 |
16 |
22 |
24~26 |
16 |
表2各菌株在最大生物量时发酵液中的细胞数及粗蛋白含量
菌种 |
As2.617 |
As2.1882 |
As2.281 |
As 2.2 |
As2.597 |
As2.159 |
As2.587 |
细胞数(个/mL) |
1.32×109 |
4.08×109 |
3.50×109 |
3.85×109 |
4.01×109 |
3.99×109 |
4.50×109 |
蛋白含量(mg/dL) |
77.469 |
81.6816 |
79.9680 |
79.2540 |
79.8541 |
79.6110 |
82.467 |
黑曲霉:选择3株饲用黑曲霉As3.3882、As3.4304、As3.6472和一株饲用米曲霉As3.2068,分别按照本发明所述的一级增菌培养条件在本发明所述的麦芽汁增菌培养基中发酵培养,发酵之后的培养基的湿重和干重、产酶(淀粉酶、纤维素酶和糖化酶)情况性能请参见下表3~表8。
表3四株曲霉胞外酶纤维素酶酶活(U/mL)
表4四株曲霉胞外酶糖化酶酶活(U/mL)
时间(h) |
As3.3882 |
As3.4304 |
As3.6472 |
As3.2068 |
0 |
14.635 |
40.97 |
40.98 |
29.27 |
12 |
29.27 |
35.613 |
13.171 |
- |
24 |
48.295 |
- |
35.124 |
36.587 |
36 |
23.416 |
46.832 |
24.879 |
43.905 |
48 |
17.562 |
23.416 |
117.08 |
46.832 |
60 |
14.605 |
23.416 |
74.638 |
42.441 |
72 |
14.635 |
57.076 |
64.394 |
35.124 |
表5四株曲霉胞外酶淀粉酶酶活(U/mL)
时间(h) |
As3.3882 |
As3.4304 |
As3.6472 |
As3.2068 |
0 |
2.265 |
3.094 |
3.121 |
0.501 |
12 |
5.971 |
11.66 |
10.07 |
0.738 |
24 |
4.257 |
10.838 |
12.55 |
0.849 |
36 |
13.981 |
12.785 |
15.77 |
2.073 |
48 |
13.428 |
14.427 |
14.823 |
8.191 |
60 |
14.042 |
13.896 |
14.476 |
13.85 |
72 |
14.977 |
13.037 |
14.116 |
15.431 |
表6四株曲霉胞内酶中纤维素酶酶活(U/mL)
时间(h) |
As3.3882 |
As3.4304 |
As3.6472 |
As3.2068 |
0 |
0.031 |
0.021 |
0.002 |
0.004 |
12 |
0.034 |
0.019 |
0.011 |
0.012 |
24 |
0.035 |
0.015 |
0.015 |
0.014 |
36 |
0.017 |
0.021 |
0.027 |
0.018 |
48 |
0.017 |
0.107 |
0.028 |
0.018 |
60 |
0.036 |
0.246 |
0.042 |
0.028 |
72 |
0.011 |
0.253 |
0.058 |
0.053 |
表7四株曲霉胞内酶中糖化酶酶活(U/mL)
时间(h) |
As3.3882 |
As3.4304 |
As3.6472 |
As3.2068 |
0 |
64.394 |
60 |
87.81 |
58.54 |
12 |
63.387 |
70.248 |
55.631 |
43.905 |
24 |
65.857 |
51.22 |
49.759 |
52.685 |
36 |
79.029 |
46.832 |
80.492 |
68.784 |
48 |
54.194 |
38.051 |
51.22 |
43.905 |
60 |
52.686 |
47.81 |
46.832 |
38.051 |
72 |
48.296 |
29.27 |
58.54 |
30.151 |
表8四株胞内酶中淀粉酶酶活(U/mL)
时间(h) |
As3.3882 |
As3.4304 |
As3.6472 |
As3.2068 |
0 |
0.476 |
0.352 |
0.225 |
0.194 |
12 |
0.368 |
0.311 |
0.478 |
0.176 |
24 |
0.418 |
0.319 |
0.587 |
0.183 |
36 |
0.449 |
0.32 |
1.871 |
0.241 |
48 |
0.357 |
0.91 |
2.56 |
0.229 |
60 |
0.828 |
2.734 |
3.385 |
0.35 |
72 |
0.03 |
2.216 |
1.981 |
0.492 |
微生物发酵制备饲料
本发明的微生物发酵制备饲料的方法请参见图2所示流程。具体包括:
将试管斜面上的啤酒酵母、热带假丝酵母(或者两种啤酒酵母)分别按每环40~80ml的比例接种于装有300ml麦芽汁培养基(所述麦芽汁培养基由39.03g麦芽汁培养基加蒸馏水加热煮沸,糖度调至10波林,pH用盐酸调至5.5,定容至300ml,在115℃温度下灭菌20分钟制成)的三角瓶中,塞上瓶塞,并用封口膜包好,在30℃、120转/分钟条件下振荡24小时进行一级增菌培养;
将黑曲霉试管斜面加入生理盐水,用接种环刮下孢子,将刮下孢子混合物倒入含有玻璃珠的三角瓶中,充分振荡打散孢子,调整孢子数数约为1.4~1.6×107个/ml,取30ml接种于装有300ml察氏培养基(由蔗糖30g、硝酸钠3g、硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、硫酸铁0.014g、磷酸氢二钾1.0g混合均匀,加入1000ml蒸馏水,调节pH为6.2,在温度121℃下灭菌15分钟制成,量取300ml)的三角瓶中,塞上瓶塞,并用封口膜包好,在30℃、120转/分钟条件下振荡24小时进行一级增菌培养;
再将一级增菌培养的啤酒酵母菌液36ml、热带假丝酵母菌液18ml、黑曲霉菌液18ml(重量比约为2∶1∶1)混合后接种到装有1400ml二级种子培养基(由麦芽根粉40g、麸皮53g、糖蜜53g、硫酸铵27g、酵母浸粉27g、葡萄糖2.7g、磷酸二氢钾7g再加自来水定容到1400ml,混合均匀,调pH值为5,在温度115℃下灭菌20分钟,温度下降到40℃)的三角瓶中(三角瓶容量2000ml),将接种好的三角瓶在30℃、170转/分种振荡下培养24小时进行二级增菌培养;
将经过二次增菌培养的混合培养液1.8kg、新底物450kg(由豆粕4.5kg、棉粕45kg、酒精粕27kg、玉米42.75kg、玉米纤维饲料139.5kg、玉米皮22.5kg、麸皮130.5kg、硫酸铵38.25kg的重量比混匀制成,粒度约为6mm)和225kg水(事先用HCl调节pH至6.0)混合,混合完毕后将其堆成高约为50cm的梯形堆,同时以地暖在35℃条件下发酵48小时,发酵结束后采用烘干机烘干,烘干机的进口温度不超过130℃,中间温度不超过45℃,出口温度不超过70℃。烘干后粉碎,粉碎的粒度为75%通过80目筛、95%过40目筛、100%过20目筛,将粉碎后的物料分装即得本发明的饲料成品。
按照以上微生物发酵制备饲料的方法,选择不同的酵母和曲霉的组合,发酵制备本发明的饲料。并以未接种微生物的饲料作为空白对照。按照本发明的方法制备得到的饲料中的蛋白含量及氨基酸含量检测请参见下表9和表10。其中,所述B2代表As2.1882、YC代表As2.2、YP代表As2.281、YR代表As2.587、H代表As3.4304、M代表米曲霉As3.2068,空白对照是不加任何菌液时饲料发酵底物的粗蛋白值。
表9混合菌发酵终产物粗蛋白含量(%)
混合菌组合 |
B2+YP+H |
B2+YC+H |
B2+YR+H |
YC+YP+M |
YC+YR+H |
YP+YR+H |
空白 |
粗蛋白 |
16.74 |
16.62 |
16.84 |
15.31 |
16.76 |
16.68 |
14.59 |
表10氨基酸分析结果表
单位:mg/100mg