CN103535525A - 一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，涉及动物饲料技术领域。以精氨酸浓菌液湿粉、豆粕、麦麸皮、米糠为发酵原料，以酵母菌、枯草芽孢杆菌为有益微生物菌群，将活化的酵母菌、枯草芽孢杆菌斜面菌种分别经过单菌落分离、一级固体种子培养和二级液体种子扩繁培养后，将两种菌的种子液按比例混合，接种到经旋转蒸球灭菌的发酵原料中，得到发酵料，在发酵床上进行通风有氧发酵，发酵达到终点，继续对发酵床上发酵料进行通风、烘干、粉碎、过筛，得到生物饲料添加剂。本发明采用精氨酸浓菌液湿粉作为发酵原料之一，产品中粗蛋白、氨基酸和短链肽含量高，营养丰富，促进养殖动物生长效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及动物饲料技术领域。
背景技术
酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，是真菌微生物，在分类学上是真菌门、粘菌亚门、隐球酵母科，细胞形态为球形或卵球形，直径5–10μm。繁殖方式为无性芽殖。生态分布广泛。能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖等生成乙醇、甘油、酯类和糖醇等物质，可以增加发酵料的风味。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis), 是细菌微生物，在分类学上是芽孢杆菌属的一种，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大，椭圆到柱状，0.6～0.9×1.0～1.5微米，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙，污白色或微黄色，在液体培养时，常形成皱醭。
枯草芽孢杆菌具有繁殖速度快、耐高温、耐酸碱、耐挤压、稳定性能好、应用范围广等特点，在现代分子遗传学的科研探索中常作为模式菌株，在现实的生产实践中广泛应用于食品工业、饲料工业、水产养殖、环境保护和保健医药等诸多方面；在发酵料参与发酵过程中，主要分解蛋白作用成氨基酸和肽类物质。
近年来，随着人们生活质量的不断提高，人们对副食品的要求越来越高，要吃的好，还要吃的健康，这对饲料行业提出更高的要求：1、要解决优质蛋白源紧缺问题；2、要解决饲料中过量使用抗生素问题；人们出于防病治病、增强免疫功能、促进生长、提高饲料利用率、净化环境目的，许多科研人员、企业家纷纷用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌对豆粕进行发酵，生产微生物发酵小肽。目前在全国范围，先后成立20多家发酵豆粕生产微生物小肽的生物技术企业，年产量达到数十万吨以上。
国外和国内发酵豆粕，基本上都是采用芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌三类菌群发酵，但产品中粗蛋白、氨基酸和短链肽含量不高，对养殖动物生长有一定的促长效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，该方法将精氨酸浓菌液湿粉作为发酵原料之一，产品中粗蛋白、氨基酸和短链肽含量高，营养丰富，对养殖动物促进生长效果明显。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，以精氨酸浓菌液湿粉、豆粕、麦麸皮、米糠为发酵原料，采用酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液对所述发酵原料进行有氧固体发酵，具体包括以下步骤：
（1）精氨酸浓菌液湿粉的制备：将制取精氨酸得到的精氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到的截留液为精氨酸发酵浓缩液，向精氨酸发酵浓缩液中加入絮凝剂，并用硫酸调节pH值，反应后，压滤，得到精氨酸浓菌液湿粉；
（2）酵母菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液的制备：将活化的酵母菌、枯草芽孢杆菌斜面菌种分别进行单菌落分离，得到酵母菌、枯草芽孢杆菌的单菌落种子；再分别进行一级固体种子培养和二级液体种子扩繁培养，得到酵母菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液；
（3）发酵原料的制备：按重量比，将发酵原料精氨酸浓菌液湿粉100～120份、豆粕10～20份、麦麸皮10～20份、米糠10～20份混合，经旋转蒸球灭菌；所述发酵原料的质量含水量为精氨酸浓菌液湿粉含水量30%、豆粕含水量10%、麦麸皮含水量10%、米糠含水量10%；
（4）有氧固体发酵：将酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液混合，接种到步骤（3）所制备的发酵原料中，得到发酵料，在发酵床上进行通风有氧发酵，发酵达到终点，继续对发酵床上发酵料进行通风、烘干、粉碎、过筛，得到生物饲料添加剂；所述发酵原料与酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液的重量比为发酵原料100～120份、酵母菌种子液20～30份、枯草芽孢杆菌种子液20～30份。
优选的，步骤（1）中将制取精氨酸得到的精氨酸发酵液经过孔径为30万分子量的陶瓷膜过滤，得到的截留液为精氨酸发酵浓缩液，向精氨酸发酵浓缩液中加入絮凝剂聚丙烯酸钠，加入量为300～500mg/kg,用质量分数35%的硫酸调节pH值到5.5～6.5后，在温度为40℃～50℃下反应，反应时间为60～80min，而后，用3MPa的压力，压入到压滤机中，压滤时间为40～60分钟，得到质量含水量为25～35%的精氨酸浓菌液湿粉。
进一步优选的，向精氨酸发酵浓缩液中加入絮凝剂聚丙烯酸钠，加入量为400mg/kg，用质量分数35%的硫酸调节pH值到6.0后，在温度为45℃下反应，反应时间为70min，而后，用3MPa的压力，压入到压滤机中，压滤时间为50分钟，得到质量含水量为30%的精氨酸浓菌液湿粉。
优选的，步骤（2）中酵母菌种子液的制备，包括以下步骤：
1）单菌落分离：将活化的酵母菌斜面菌种在盛有葡萄糖酵母膏酵母培养基的培养皿上涂布，培养基组成以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、磷酸氢二钾0.1%、琼脂2.0%，余量为水；灭菌条件：0.08MPa、115℃、20min；培养条件：在恒温培养箱中培养，温度30℃、时间56h，得到酵母菌单菌落种子；
2）一级固体种子培养：酵母菌单菌落种子在盛有上述葡萄糖酵母膏酵母培养基的200ml茄形扁瓶中划线接种，所述培养基组成、灭菌条件和培养条件同上述步骤1）所述，得到酵母菌一级固体种子；
3）二级液体种子扩繁培养：将酵母菌一级固体种子按质量分数为10%～20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到酵母菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0～4.0%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：罐压0.08～0.10MPa、温度115～121℃、时间18～20min；二级液体种子培养条件：罐压0.01～0.05MPa、风量100:100～100:150vvm、转速180～220rpm、温度28℃～32℃、时间48～64h；酵母菌种子液中含酵母菌活菌数≥50亿cfu/ml。
进一步优选的，酵母菌种子液的制备步骤3）中，将酵母菌一级固体种子按质量分数为20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到酵母菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.10MPa、121℃、20min；二级液体种子培养条件：罐压0.03MPa、风量100:150vvm、转速200rpm、温度30℃、时间56h。
优选的，步骤（2）中枯草芽孢杆菌种子液的制备，包括以下步骤：
1）单菌落分离：将活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的培养皿上涂布，培养基组成以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、琼脂2.0%，余量为水；灭菌条件：0.08MPa、115℃、20min；培养条件：在恒温培养箱中培养，温度30℃、时间56h，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2）一级固体种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有上述葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的200ml茄形扁瓶中划线接种，所述培养基组成、灭菌条件和培养条件同上述步骤1）所述，得到枯草芽孢杆菌一级固体种子；
3）二级液体种子扩繁培养：将枯草芽孢杆菌一级固体种子按质量分数为10%～20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5～1.5%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水；二级种子罐灭菌条件，0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20min；二级液体种子培养条件，罐压0.01～0.05MPa、风量100:80～100:120vvm、转速100～200rpm、温度28℃～32℃、时间48～64h；枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数≥100亿cfu/ml。
进一步优选的，枯草芽孢杆菌种子液的制备步骤3）中，将枯草芽孢杆菌一级固体种子按质量分数为20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；二级种子罐灭菌条件， 0.10MPa、121℃、20min；二级液体种子培养条件，罐压0.03MPa、风量100:100vvm、转速150rpm、温度30℃、时间56h。
优选的，步骤（3）中发酵原料的重量比为：精氨酸浓菌液湿粉100份、豆粕10份、麦麸皮20份、米糠10份。
优选的，步骤（4）中发酵料的发酵起始质量含水量为40%～50%, 发酵起始温度为20℃～30℃，过程控制温度为30℃～60℃，发酵时间为100～120小时，pH值为4～5，发酵达到终点，继续对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到20～30%，然后传输到流化床上，在45℃～60℃条件下烘干，烘干到质量含水量≤10%后，在无菌洁净条件下进行粉碎、过100目筛，得到生物饲料添加剂。
进一步优选的，发酵料的发酵起始质量含水量40%, 发酵起始温度为20℃，过程控制温度为40℃～60℃，发酵时间为100小时，pH值为5，发酵达到终点，继续对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到20%，然后传输到流化床上，在60℃条件下烘干，烘干到质量含水量≤10%后，在无菌洁净条件下进行粉碎、过100目筛，得到生物饲料添加剂；发酵原料与酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液的重量比为：发酵原料100份、酵母菌种子液20份、枯草芽孢杆菌种子液20份。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
（1）本发明酵母菌、枯草芽孢杆菌本身含有一定的动物蛋白，并且能够充分的利用发酵原料中精氨酸浓菌液湿粉中的非蛋白氮，将其降解为可吸收利用的氨基酸和短链肽，从而使其蛋白利用率大大提高，非蛋白氮被发酵过程吸收利用。本生物饲料添加剂中含粗蛋白可以达到60%以上，氨基酸短链肽生成率可达20%以上（短链肽分子量为2000个道尔顿以下），含有各种氨基酸的平均值为：赖氨酸2.18%、蛋氨酸1.16%、苏氨酸1.26%、色氨酸1.36%。
（2）本发明具有发酵原料来源广泛、价格低廉易得，生产工艺简单、生产周期短，发酵产物多、产品质量好、应用效果好等特点。本产品在海珍品、畜禽养殖中的饲料中添加，可以防病治病，提高成活率，提高免疫力，提高生长速度，提高品质；由于本发明饲料是活性饲料，含有一定数量的酵母菌和枯草芽孢杆菌，可以改善养殖环境，净化水质，是一种绿色的高效、无毒、无害的优质的氨基酸类高蛋白饲料添加剂，具有广阔的市场前景。
（3）本发明在微生物发酵过程中，氨基酸和多种微生物的协同作战，通过产生的各种生物活性物质如酵母菌和芽孢菌及其代谢产物，短链氨基酸，小肽，消化吸收酶类等，将原料中的大分子蛋白逐步分解为简单物质，再经过复杂的物理化学和生物化学的反应，形成具有独特的发酵料风味。
（4）本发明产品是发酵类产品，内含多种氨基酸，小肽，各种酶类，可以大大提高蛋白饲料利用率，并且有活菌在繁殖和产生各种代谢产物，所以，可以处理养殖动物的肠胃，调整菌群平衡，杀灭有害菌，减少抗生素的使用量。
具体实施方式
本发明各实施例采用的酵母菌为：中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），CICC编号为1355；枯草芽孢杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏的枯草芽孢杆菌枯草亚种（Bacillus subtilis subsp.subtilis），CICC编号为20822；絮凝剂聚丙烯酸钠纯度为95%。
实施例1
（1）精氨酸浓菌液湿粉的制备：将制取精氨酸（同现有技术）得到的精氨酸发酵液经过孔径为30万分子量的陶瓷膜过滤，得到的截留液为精氨酸发酵浓缩液，将16吨精氨酸发酵浓缩液打入到20吨容器中，静置，加入絮凝剂聚丙烯酸钠，加入量为400mg/kg，用质量分数35%的硫酸调节pH值到6.0后，在温度为45℃下反应，反应时间为70min，而后，用3MPa的压力，压入到压滤机中，压滤时间为50分钟，得到质量含水量为30%的精氨酸浓菌液湿粉。
（2）a、酵母菌种子液的制备：
1）单菌落分离：将酵母菌接种到斜面培养基（5°Bé麦芽汁1.0L，琼脂15.0g，自然pH）中，28-30℃，培养三天，得到活化的酵母菌斜面菌种。将活化的酵母菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖酵母培养基的培养皿上涂布，培养基组成为：葡萄糖3.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、磷酸氢二钾0.1%，琼脂2.0%、余量为水；灭菌条件：0.08MPa、115℃、20min；培养条件：在恒温培养箱中培养，温度30℃、时间56h，到酵母菌单菌落种子；
2）一级固体种子培养：酵母菌单菌落种子在盛有上述葡萄糖酵母膏酵母培养基的200ml茄形扁瓶中划线接种，培养基组成、灭菌条件和培养条件均同上述步骤（2）a、1）所述，得到酵母菌一级固体种子；
3）二级液体种子扩繁培养：采取深层发酵法生产酵母菌种子液，将培养好的茄形扁瓶中的酵母菌一级固体种子，用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法将酵母菌一级固体种子按质量分数为20%的接种量接种到500立升二级种子罐培养基中（二级种子罐装液量不超过70%），经培养，得到酵母菌种子液；二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.10MPa、121℃、20min；二级液体种子培养条件：罐压0.03MPa、风量100:150vvm、转速200rpm、温度30℃、时间56h。
酵母菌显微镜检查：酵母细胞形态大小约为 2-5×5-30μm，酵母多数为单细胞微生物，常呈卵圆形或者圆柱形。
酵母菌培养皿检查：平板培养基上的酵母菌落呈白色粒状凸起，有酒香味。
采用平板计数法测定酵母菌种子液中含酵母菌活菌数为52.8亿cfu/ml。
培养成熟时，酵母菌种子液有一种酒香味，显微镜下检查菌体健壮，无杂菌污染等异常现象，可与枯草芽孢杆菌种子液混合使用。
（2）b、枯草芽孢杆菌种子液的制备：
1）单菌落分离：将枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基（蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，Ph7.0）中，30℃，培养1-2天，得到活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种。将活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有新配置的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿上涂布，培养基组成为：葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%，琼脂2.0%、余量为水；灭菌条件：0.08MPa、115℃、20min；培养条件：在恒温培养箱中培养，温度30℃、时间56h，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2）一级固体种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有上述葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的200ml茄形扁瓶中划线接种，培养基组成、灭菌条件和培养条件均同步骤（2）b、1）所述，得到枯草芽孢杆菌一级固体种子；
3）二级液体种子扩繁培养：采取深层发酵法生产酵母菌种子液，将培养好的茄形扁瓶中的枯草芽孢杆菌一级固体种子，用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法将枯草芽孢杆菌一级固体种子按质量分数为20%的接种量接种到500立升二级种子罐培养基中（二级种子罐装液量不超过70%），经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.10MPa、121℃、20min；二级液体种子培养条件：罐压0.03MPa、风量100:100vvm、转速150rpm、温度30℃、时间56h。
采用平板计数法测定枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数为108亿cfu/ml。
显微镜下检查枯草芽孢杆菌种子液，菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，并有30%芽孢出现，可与酵母菌种子液混合使用。
（3）发酵原料的制备：按重量比，将发酵原料精氨酸浓菌液湿粉100份、豆粕10份、麦麸皮20份、米糠10份混合，经旋转蒸球灭菌；其中，发酵原料的质量含水量为精氨酸浓菌液湿粉30%、豆粕10%、麦麸皮10%、米糠10%。
（4）有氧固体发酵：将酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液混合，接种到步骤（3）所制备的发酵原料中（发酵原料与酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液的重量比为发酵原料100份、酵母菌种子液20份、枯草芽孢杆菌种子液20份），得到发酵料，在发酵床上进行通风有氧发酵，发酵料的发酵起始质量含水量40%，发酵起始温度为20℃，过程控制温度为40℃～60℃，发酵时间为100小时，pH值为5，发酵达到终点。继续对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到20%，然后传输到流化床上，在60℃条件下烘干，烘干到质量含水量10%后，在无菌洁净条件下进行粉碎、过100目筛，得到生物饲料添加剂。
实施例2
（1）精氨酸浓菌液湿粉的制备：将制取精氨酸（同现有技术）得到的精氨酸发酵液经过孔径为30万分子量的陶瓷膜过滤，得到的截留液为精氨酸发酵浓缩液，将16吨精氨酸发酵液打入到20吨容器中，静置，加入絮凝剂聚丙烯酸钠，加入量为300mg/kg，用质量分数35%的硫酸调节pH值到5.5后，在温度为40℃下反应，反应时间为60min，而后，用3MPa的压力将反应后的精氨酸发酵液压入到压滤机中，压滤时间为40分钟，得到质量含水量为35%的精氨酸浓菌液湿粉。
（2）a、酵母菌种子液的制备：
与实施例1的区别在于步骤（2）a、3）中二级液体种子扩繁培养：用压差接种法将酵母菌一级固体种子按质量分数为10%的接种量接种到1吨二级种子罐培养基中，经培养，得到酵母菌种子液；二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0%、玉米浆干粉2.0%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.08MPa、115℃、19min；二级液体种子培养条件：罐压0.05MPa、风量100:120vvm、转速220rpm、温度32℃、时间64h。
采用平板计数法测定酵母菌种子液中含酵母菌活菌数为52.2亿cfu/ml。
（2）b、枯草芽孢杆菌种子液的制备：
与实施例1的区别在于步骤（2）b、3）中二级液体种子扩繁培养：用压差接种法将枯草芽孢杆菌一级固体种子按质量分数为10%的接种量接种到1吨二级种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5%、玉米浆干粉2.0%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.08MPa、115℃、18min；二级液体种子培养条件：罐压0.05MPa、风量100:120vvm、转速200rpm、温度32℃、时间64h。
采用平板计数法测定枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数为102亿cfu/ml。
（3）发酵原料的制备：发酵原料的制备：按重量比，将发酵原料精氨酸浓浆菌液湿粉110份、豆粕20份、麦麸皮10份、米糠15份混合，经旋转蒸球灭菌；其中，发酵原料的质量含水量为精氨酸浓浆菌液湿粉30%、豆粕10%、麦麸皮10%、米糠10%。
（4）有氧固体发酵：将酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液混合，接种到步骤（3）所制备的发酵原料中（发酵原料与酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液的重量比为发酵原料120份、酵母菌种子液25份、枯草芽孢杆菌种子液30份），得到发酵料，在发酵床上进行通风有氧发酵，发酵料的发酵起始质量含水量45%, 发酵起始温度为25℃，过程控制温度为30℃～50℃，发酵时间为120小时，pH值为4，发酵达到终点。继续对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到25%，然后传输到流化床上，在45℃条件下烘干，烘干到质量含水量8%后，在无菌洁净条件下进行粉碎、过100目筛，得到生物饲料添加剂。
实施例3
（1）精氨酸浓菌液湿粉的制备：将制取精氨酸（同现有技术）得到的精氨酸发酵液经过孔径为30万分子量的陶瓷膜过滤，得到的截留液为精氨酸发酵浓缩液，将16吨精氨酸发酵液打入到20吨容器中，静置，加入絮凝剂聚丙烯酸钠，加入量为500mg/kg，用质量分数35%的硫酸调节pH值到6.5后，在温度为50℃下反应，反应时间为80min，而后，用3MPa的压力将反应后的精氨酸发酵液压入到压滤机中，压滤时间为60分钟，得到质量含水量为25%的精氨酸浓菌液湿粉。
（2）a、酵母菌种子液的制备：
与实施例1的区别在于步骤（2）a、3）中二级液体种子扩繁培养：用火焰接种法将酵母菌一级固体种子按质量分数为15%的接种量接种到2吨二级种子罐培养基中，经培养，得到酵母菌种子液；二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖4.0%、玉米浆干粉4.0%，硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.2%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.09MPa、118℃、18min；二级液体种子培养条件：罐压0.01MPa、风量100:100vvm、转速180rpm、温度28℃、时间48h。
采用平板计数法测定酵母菌种子液中含酵母菌活菌数为51.6亿cfu/ml。
（2）b、枯草芽孢杆菌种子液的制备：
与实施例1的区别在于步骤（2）b、3）中二级液体种子扩繁培养：用火焰接种法将枯草芽孢杆菌一级固体种子按质量分数为15%的接种量接种到500立升二级种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.5%、玉米浆干粉4.0%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.2%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.09MPa、118℃、19min；二级液体种子培养条件：罐压0.01MPa、风量100:80vvm、转速100rpm、温度28℃、时间48h。
采用平板计数法测定枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数为106亿cfu/ml。
（3）发酵原料的制备：按重量比，将精氨酸浓浆菌液湿粉120份、豆粕15份、麦麸皮15份、米糠20份混合，经旋转蒸球灭菌；其中，发酵原料的质量含水量为精氨酸浓浆菌液湿粉30%、豆粕10%、麦麸皮10%、米糠10%。
（4）有氧固体发酵：将酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液混合，接种到步骤（3）所制备的发酵原料中（发酵原料与酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液的重量比为发酵原料110份、酵母菌种子液30份、枯草芽孢杆菌种子液25份），得到发酵料，在发酵床上进行通风有氧发酵，发酵料的发酵起始质量含水量50%, 发酵起始温度为30℃，过程控制温度为35℃～55℃，发酵时间为110小时，pH值为4.5，发酵达到终点。继续对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到30%，然后传输到流化床上，在52℃条件下烘干，烘干到质量含水量6%后，在无菌洁净条件下进行粉碎、过100目筛，得到生物饲料添加剂。
通过本发明方法制得的生物饲料添加剂经测定粗蛋白含量可达60%以上，氨基酸短链肽生成率达20%以上（短链肽分子量为2000个道尔顿以下），含有各种氨基酸的平均值（或保证值）为：赖氨酸2.18%、蛋氨酸1.16%、苏氨酸1.26%、色氨酸1.36%。
应用时，将本发明所得的产品生物饲料添加剂，在海蓝褐色壳蛋鸡日粮中添加0.2wt%进行饲养试验，结果见表1：
表1 产品生物饲料添加剂对海蓝褐色壳蛋鸡鸡群生产性能的影响
由表1可以看出：在287只海蓝褐色壳蛋鸡，经35天试验期，试验组（日粮中添加0.2wt%本生物饲料添加剂）比对照组（日粮中不添加本生物饲料添加剂），产蛋率提高2.02%，日单产提高1.44g/只，死淘率降低1.79%，料蛋比降低6.0%，总产蛋量提高15.4kg，并且蛋壳硬度加强，亮，光泽好，颜色均匀一致，鸡粪成型，臭味、氨气味减轻，养殖环境明显改善。
将本发明所得的产品生物饲料添加剂，在幼参养殖中进行应用试验，试验组1每天每个水体5g本生物饲料添加剂，试验组2每天每个水体３g本生物饲料添加剂，对照组每天每个水体5毫升海水，试验结果见表2：
表2 产品生物饲料添加剂对海参增重的影响
*参池水温16℃；
*水体：长×宽×高＝1m×1m×1m＝1m3(立方米水体)
在水温16℃时，经过15天的喂养，从表2可以看出，试验组1平均增重率22.9%，试验组2平均增重率20.6%，对照组平均增重率17.7%，试验结果表明，试验组的平均增重率明显高于对照组平均增重率，本生物饲料添加剂产品在海参养殖中效果明显。
Claims (10)
1.一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于，以精氨酸浓菌液湿粉、豆粕、麦麸皮、米糠为发酵原料，采用酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液对所述发酵原料进行有氧固体发酵，具体包括以下步骤：
（1）精氨酸浓菌液湿粉的制备：将制取精氨酸得到的精氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，得到的截留液为精氨酸发酵浓缩液，向精氨酸发酵浓缩液中加入絮凝剂，并用硫酸调节pH值，反应后，压滤，得到精氨酸浓菌液湿粉；
（2）酵母菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液的制备：将活化的酵母菌、枯草芽孢杆菌斜面菌种分别进行单菌落分离，得到酵母菌、枯草芽孢杆菌的单菌落种子；再分别进行一级固体种子培养和二级液体种子扩繁培养，得到酵母菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液；
（3）发酵原料的制备：按重量比，将发酵原料精氨酸浓菌液湿粉100～120份、豆粕10～20份、麦麸皮10～20份、米糠10～20份混合，经旋转蒸球灭菌；所述发酵原料的质量含水量为精氨酸浓菌液湿粉含水量30%、豆粕含水量10%、麦麸皮含水量10%、米糠含水量10%；
（4）有氧固体发酵：将酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液混合，接种到步骤（3）所制备的发酵原料中，得到发酵料，在发酵床上进行通风有氧发酵，发酵达到终点，继续对发酵床上发酵料进行通风、烘干、粉碎、过筛，得到生物饲料添加剂；所述发酵原料与酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液的重量比为发酵原料100～120份、酵母菌种子液20～30份、枯草芽孢杆菌种子液20～30份。
2.根据权利要求１所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述步骤（1）中将制取精氨酸得到的精氨酸发酵液经过孔径为30万分子量的陶瓷膜过滤，得到的截留液为精氨酸发酵浓缩液，向精氨酸发酵浓缩液中加入絮凝剂聚丙烯酸钠，加入量为300～500mg/kg，用质量分数35%的硫酸调节pH值到5.5～6.5后，在温度为40℃～50℃下反应，反应时间为60～80min，而后，用3MPa的压力，压入到压滤机中，压滤时间为40～60分钟，得到质量含水量为25～35%的精氨酸浓菌液湿粉。
3.根据权利要求2所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于向精氨酸发酵浓缩液中加入絮凝剂聚丙烯酸钠，加入量为400mg/kg，用质量分数35%的硫酸调节pH值到6.0后，在温度为45℃下反应，反应时间为70min，而后，用3MPa的压力，压入到压滤机中，压滤时间为50分钟，得到质量含水量为30%的精氨酸浓菌液湿粉。
4.根据权利要求１所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述步骤（2）中酵母菌种子液的制备，包括以下步骤：
1）单菌落分离：将活化的酵母菌斜面菌种在盛有葡萄糖酵母膏酵母培养基的培养皿上涂布，培养基组成以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、蛋白胨1.0%、酵母膏1.0%、磷酸氢二钾0.1%、琼脂2.0%，余量为水；灭菌条件：0.08MPa、115℃、20min；培养条件：在恒温培养箱中培养，温度30℃、时间56h，得到酵母菌单菌落种子；
2）一级固体种子培养：酵母菌单菌落种子在盛有上述葡萄糖酵母膏酵母培养基的200ml茄形扁瓶中划线接种，所述培养基组成、灭菌条件和培养条件同上述步骤1）所述，得到酵母菌一级固体种子；
3）二级液体种子扩繁培养：将酵母菌一级固体种子按质量分数为10%～20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到酵母菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0～4.0%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：罐压0.08～0.10MPa、温度115～121℃、时间18～20min；二级液体种子培养条件：罐压0.01～0.05MPa、风量100:100～100:150vvm、转速180～220rpm、温度28℃～32℃、时间48～64h；酵母菌种子液中含酵母菌活菌数≥50亿cfu/ml。
5.根据权利要求4所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述酵母菌种子液的制备步骤3）中，将酵母菌一级固体种子按质量分数为20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到酵母菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；二级种子罐灭菌条件：0.10MPa、121℃、20min；二级液体种子培养条件：罐压0.03MPa、风量100:150vvm、转速200rpm、温度30℃、时间56h。
6.根据权利要求１所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述步骤（2）中枯草芽孢杆菌种子液的制备，包括以下步骤：
1）单菌落分离：将活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的培养皿上涂布，培养基组成以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%、磷酸氢二钾0.1%、琼脂2.0%，余量为水；灭菌条件：0.08MPa、115℃、20min；培养条件：在恒温培养箱中培养，温度30℃、时间56h，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2）一级固体种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有上述葡萄糖牛肉膏蛋白胨枯草芽孢杆菌培养基的200ml茄形扁瓶中划线接种，所述培养基组成、灭菌条件和培养条件同上述步骤1）所述，得到枯草芽孢杆菌一级固体种子；
3）二级液体种子扩繁培养：将枯草芽孢杆菌一级固体种子按质量分数为10%～20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5～1.5%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水；二级种子罐灭菌条件，0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20min；二级液体种子培养条件，罐压0.01～0.05MPa、风量100:80～100:120vvm、转速100～200rpm、温度28℃～32℃、时间48～64h；枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数≥100亿cfu/ml。
7.根据权利要求6所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌种子液的制备步骤3）中，将枯草芽孢杆菌一级固体种子按质量分数为20%的接种量接种到二级种子罐培养基中，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；所述二级种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；二级种子罐灭菌条件， 0.10MPa、121℃、20min；二级液体种子培养条件，罐压0.03MPa、风量100:100vvm、转速150rpm、温度30℃、时间56h。
8.根据权利要求１所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述步骤（3）中发酵原料的重量比为：精氨酸浓菌液湿粉100份、豆粕10份、麦麸皮20份、米糠10份。
9.根据权利要求１所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述步骤（4）中发酵料的发酵起始质量含水量为40%～50%，发酵起始温度为20℃～30℃，过程控制温度为30℃～60℃，发酵时间为100～120小时，pH值为4～5，发酵达到终点，继续对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到20～30%，然后传输到流化床上，在45℃～60℃条件下烘干，烘干到质量含水量≤10%后，在无菌洁净条件下进行粉碎、过100目筛，得到生物饲料添加剂。
10.根据权利要求9所述的一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法，其特征在于所述发酵料的发酵起始质量含水量40%, 发酵起始温度为20℃，过程控制温度为40℃～60℃，发酵时间为100小时，pH值为5，发酵达到终点，继续对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到20%，然后传输到流化床上，在60℃条件下烘干，烘干到质量含水量≤10%后，在无菌洁净条件下进行粉碎、过100目筛，得到生物饲料添加剂；发酵原料与酵母菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液的重量比为：发酵原料100份、酵母菌种子液20份、枯草芽孢杆菌种子液20份。
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