JP2020031580A - β−グルカン高産生菌株、β−グルカンの製造方法、及びβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アウレオバシジウム属に属する微生物を利用して、低コストで効率よく、高純度のβ−グルカンを得ることができる、β−グルカンの生産技術の提供。【解決手段】アウレオバシジウムプルランスに属する菌株を親株とする変異株であって、３１．５℃で培養したときのβ−グルカン産生能が高められている、該β−グルカン高産生菌株。この菌株を用いた、比較的に高温の培養条件下においてもβ−グルカン産生能が高く、工業的生産において、大型の通気攪拌槽等の設備による培養の際、至適温度への温調が必要ないか、あるいはその必要性の程度が軽減される、β−グルカンの製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、β−グルカンを工業的に生産するのに適したβ−グルカン高産生菌株、該菌株によるβ−グルカンの製造方法、及びβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法に関するものである。

β−グルカンは、キノコやビール酵母、あるいは黒酵母などによって生産される多糖で、抗腫瘍作用、アレルギー軽減、抗ウイルス作用、抗菌活性などが確認されており、これを含有するサプリメントなどが商品化されている。

一般にキノコ由来のβ−グルカンは、キノコ自体の安定的な大量生産が困難であり、コストの低減化が難しい。またビール酵母由来のβ−グルカンについても、細胞壁からの抽出、精製が複雑であり、高純度のβ−グルカンを得るのが難しく、結果的にコストが高くなってしまう。それに対して黒酵母（アウレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物）は、菌体外にβ−グルカンを生産するので、分離精製が容易であり、高純度のグルカンを低価格で提供することが可能である。

黒酵母からβ−グルカンを生産する方法に関し、下記特許文献１には、窒素枯渇培地で誘導したAureobasidium属菌株の厚膜胞子を、ビタミンＥを添加し粉砕した中糠０．１〜１．０重量％、グルコース０．５〜２．０重量％、ビタミンＣ０．２〜０．５重量％を含みｐＨ５．０〜６．０に調整した液体培地に、培養開始時の菌数が１０⁴ｃｅｌｌ／ｍＬになるよう植菌して２０℃で９６時間振とう培養したところ、そのように窒素枯渇培地で誘導した厚膜胞子が、通常の窒素源が豊富な培地で継代した分芽胞子を培養した場合に比べて、培養物中のβ−グルカン量が高い値となることが記載されている（特許文献１の段落００１９、００２１）。

また、下記特許文献２には、アウレオバシジウム属に属する微生物の培養に際して、培養液の攪拌翼としてトルクの大きな攪拌翼、例えばヘリカルリボン翼、マックスブレンド翼、フルゾーン翼、アンカー翼などを用いて、培地を攪拌しながら培養し、菌の生育とグルカンの生産が増大するに従い、攪拌回転数を増加させ、その攪拌回転数と通気量を調整することによって溶存酸素濃度を１５％以上に保持して培養を行うことが記載されている（特許文献２の段落００１５）。

特開２００４−３２９０７７号公報 特開２００４−４９０１３号公報

黒酵母を利用したβ−グルカンの大量生産の方法としては、通気撹拌培養方式などが知られているが、培養中に生産されるβ−グルカンにより培養液の粘度が非常に高まるので大型撹拌翼による高通気高撹拌が必要であり、その場合に、撹拌翼の運転やこれによって生じるジュール熱のため、２０〜２５℃付近が至適温度である菌の生育やβ−グルカン産生能に影響を与えて、β−グルカンの収率を思うように高められないという問題があった。あるいは、その至適温度への温調のためには、エネルギーコストがかかるという問題があった。

本発明の目的は、アウレオバシジウム（Aureobasidium）属に属する微生物を利用して、低コストで効率よく、高純度のβ−グルカンを得ることができる、β−グルカンの生産技術を提供することにある。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明のβ−グルカン高産生菌株は、アウレオバシジウム プルランスに属する菌株を親株とする変異株であって、３１．５℃で３日間培養したときの培養液中のβ−グルカン含有量として、前記親株に比べて２倍以上に該β−グルカン産生能が高められていることを特徴とする。

また、本発明のβ−グルカン高産生菌株は、アウレオバシジウム プルランスに属する菌株であって、３１．５℃で３日間培養したときの培養液中のβ−グルカン含有量が３ｇ／Ｌ以上であることを特徴とする。

本発明のβ−グルカン高産生菌株によれば、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する微生物を利用するので、所定の培養により、高純度のβ−グルカンを生産することができる。加えて、比較的に高温の培養条件下においてもβ−グルカン産生能が高いので、工業的生産において、大型の通気攪拌槽等の設備による培養の際、至適温度への温調が必要ないか、あるいはその必要性の程度が軽減される。これにより、工業的生産のためのエネルギーコストを大幅に削減することができ、低コストで効率よくβ−グルカンを生産することができる。

上記のβ−グルカン高産生菌株としては、例えば、Aureobasidium pullulans M-3株が挙げられる。

一方、本発明のβ−グルカンの製造方法は、上記のβ−グルカン高産生菌株を液体培地で培養し、β−グルカンを得ることを特徴とする。

本発明のβ−グルカンの製造方法によれば、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する微生物を利用するので、所定の培養により、高純度のβ−グルカンを生産することができる。加えて、比較的に高温の培養条件下においてもβ−グルカン産生能が高いので、工業的生産において、大型の通気攪拌槽等の設備による培養の際、至適温度への温調が必要ないか、あるいはその必要性の程度が軽減される。これにより、工業的生産のためのエネルギーコストを大幅に削減することができ、低コストで効率よくβ−グルカンを生産することができる。

本発明のβ−グルカンの製造方法においては、前記培養を２０．０〜３５．０℃の温度条件で行うことが好ましい。これによれば、β−グルカン生産のより一層の効率化を図ることができる。

本発明のβ−グルカンの製造方法においては、前記培養を魚粉及び／又は大豆粉を窒素源とする液他培地で行うことが好ましい。これによれば、β−グルカン生産のより一層の促進を図ることができる。

他方、本発明のβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法は、アウレオバシジウム プルランスに属する菌株を親株とし、変異処理を行ない、３０．０〜３５．０℃の温度条件で培養して、前記温度条件で生育可能な菌株を選別し、更に、前記親株に比べてβ−グルカンの産生能が高められている菌株を選別することを特徴とする。

本発明のβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法によれば、β−グルカンを工業的に生産するのに適したβ−グルカン高産生菌株を得ることができる。

本発明のβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法においては、前記温度条件で生育可能な菌株を寒天培地上で選別することが好ましい。これによれば、寒天培地上に生育するコロニーの数を調整すること等により、変異処理の程度の調整が容易である。

本発明のβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法においては、前記親株に比べてβ−グルカンの産生能が高められている菌株の選別を、液体培地で培養したときの該培養液中のβ−グルカン含有量を、前記親株のそれと比較することにより行うことが好ましい。これによれば、β−グルカンの産生能が高められた菌株をより確実に選別することができる。

本発明によれば、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する微生物を利用するので、所定の培養により、高純度のβ−グルカンを生産することができる。加えて、比較的に高温の培養条件下においてもβ−グルカン産生能が高いので、工業的生産において、大型の通気攪拌槽等の設備による培養の際、至適温度への温調が必要ないか、あるいはその必要性の程度が軽減される。これにより、工業的生産のためのエネルギーコストを大幅に削減することができ、低コストで効率よくβ−グルカンを生産することができる。

試験例２において、Ｍ−２株又はＭ−３株を、３１．５℃で６日間、液体培養したときの菌体の形状を示す顕微鏡写真であり、図１（ａ）はＭ−２株の写真であり、図１（ｂ）はＭ−３株の写真である。

本発明において、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する微生物の培養のための培地としては、特に言及しない限り、当業者に周知の培養組成のものを適宜選択して用いることができる。また、その微生物の培養方法や、継代方法、保管方法等についても、特に言及しない限り、当業者に周知の手段で行うことができる。

なお、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）に属する微生物の培養液中のβ−グルカン含有量の決定は、例えば次のような方法で行うことができる。すなわち、培養物から菌体を遠心分離機で除去し、その培養液に対して、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼ等を用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルラン等のα−グルカンを分解した後、エタノール沈殿を行う。更に、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンで更に洗浄し、硫酸を加え、加水分解を行う。加水分解後、中和し、そのろ液を採取して、グルコースオキシダーゼ法によりブドウ糖を定量し、下記数式１に基づいて計算した値をβ−グルカン量とする。

・数式１：β−グルカン（ｇ/１００ｇ）＝ブドウ糖（ｇ/１００ｇ）×０．９

また、β−グルカン含有量の決定は、いわゆる糖鎖含有高分子物質（多糖）量として決定することもできる。この場合は、培養終了後の培養物から菌体を遠心分離機で除去し、その培養液に対して、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼ等を用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルラン等のα−グルカンを分解した後、エタノール沈殿を行う。更に、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンで更に洗浄したものの重量を測定することで糖鎖含有高分子物質（多糖）量とする。なお、このようにして定量されるβ−グルカンは、硫酸基、リン酸基等の官能基を有するもの、あるいはβ−グルカンの構成糖であるグルコース以外の糖からなる多糖などをも含むものとして定量される。

（β−グルカン高産生菌株の作出）
本発明に用いられるβ−グルカン高産生菌株は、例えば、以下に示すスクリーニングを行うことにより、当業者にとって特別の困難性なく、作出することが可能である。ただし、以下に示す記載は、本発明の範囲を、特定の手法により作出される菌株にかかるものに限定する趣旨の記載ではない。

まず、親株として、アウレオバシジウム プルランスに属する菌株を準備する。通常、アウレオバシジウム プルランスに属する微生物であれば、所定の培養により、その培養液中にβ−グルカンを生成する。そして、その培養後の培養液から高純度のβ−グルカンを得ることができる。ただし、その培養の至適温度は２０〜２５℃付近である。

例えば、本出願人らによるアウレオバシジウム プルランス Ｍ−１株（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６１５）は、β−グルカンの大量生産に適したβ−グルカン産生菌株である（以下、「Ｍ−１株」と称する場合がある）。そして、得られるβ−グルカンには、優れた皮膚保湿機能や便秘改善機能や免疫賦活機能があることが示されている（特許第４００００７８号公報、特許第４０５４６９７号公報、特許第４３６９２５８号公報）。また、本出願人らによるアウレオバシジウム プルランス Ｍ−２株（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４）は、そのβ−グルカン産物に上記Ｍ−１株と同様の生理活性機能が備わるとともに、加えて、メラニン色素の生成蓄積が少ない、良質なβ−グルカンが含まれた、白黄色のジェル状物質を安定的に培養液中の菌体外に生成する。

次に、上記親株に対して変異処理を行なう。変異処理としては、当業者に周知の微生物の突然変異作出手段を採用することが可能であり、例えば、紫外線照射処理、変異原性物質処理等で行うことができる。変異源としての紫外線照射は、例えば、ＵＶランプ等を用いて行うことができる。また、変異原性物質としては、例えば、メタンスルホン酸エチル、ニトロソグアニジン、エチジムブロマイド等を用いることができる。

ただし、本発明においては、上記の変異処理とともに、又は、その処理の後で３０．０〜３５．０℃の温度条件で培養し、その温度条件で生育可能な菌株を選別する必要がある。このようにすることで、通常であればアウレオバシジウム プルランスに属する微生物が生育するのには苛酷な高温下にあっても、その環境下でよく生育する変異株を得ることができる。その場合、紫外線照射であれば照射時間や照射距離等の調節によって、変異原性物質であれば濃度等の調節によって、微生物に対する変異処理の程度を調節することができる。本発明の好ましい態様においては、変異処理の程度として、処理後の微生物の３０．０〜３５．０℃下の生存率が、仮に変異処理しないときの生存率を１００％としたとき、およそ５〜５０％程度、より好ましくはおよそ１０〜３０％程度となるようにすることが好ましい。また、この操作を複数回、より好ましくは２〜５回、更により好ましくは２〜３回繰り返すことが好ましい。このように、適宜強弱が調整された変異処理と、高温下での培養を繰り返すことにより、高温下にあっても、よく生育する変異株を、より効率的に得ることができる。

本発明の一形態においては、上記温度条件で生育可能な菌株の選別を、寒天培地上で行うことが好ましい。これによれば、上記変異処理とともにおこなうか、あるいは、その変異処理の後に行う、選別のための培養の操作を、寒天培地上に微生物の懸濁液を塗布した後、コロニーを形成させること等により行うことができ、高温下にあっても、よく生育する変異株を、より確実に得ることができる。また、上記変異処理を、平板上の寒天培地に微生物の懸濁液を塗布した後にＵＶを照射したり、変異原性物質を培地組成中に含有せしめたりすることにより、その寒天培地上で行うことができ、より一層効率よく変異株を得ることができる。

次に、親株に比べてβ−グルカンの産生能が高められている菌株の選別を更に行なう。β−グルカンの産生能が高められているかどうかは、当業者に周知の手段を適宜採用して決定すればよく、その手段は特に制限はない。例えば、液体培地で培養したときのその培養液中のβ−グルカン含有量を、親株のそれと比較すること等により行うことができる。

なお、本発明の好ましい態様においては、上記のようにして得られた菌株が、下記の培養条件で３日間培養したときの培養液中のβ−グルカン含有量として、親株に比べて２倍以上、より好ましくは２．５倍以上、更により好ましくは３倍以上に高められていることを基準にして、菌株のβ−グルカン産生能が高められているかを決定し、選別することが好ましい。あるいは、場合によっては、下記の培養条件で３日間培養したときの培養液中のβ−グルカン含有量が３ｇ／Ｌ以上、より好ましくは３．５ｇ／Ｌ以上、更により好ましくは４ｇ／Ｌ以上であることを基準にして、菌株のβ−グルカン産生能が高められているかを決定し、選別してもよい。

（培養条件）
培地：スクロースを最終濃度が２．０質量％であり、米ぬかを最終濃度が０．３質量％であるように、それぞれを水に溶解してなる液体培地であって、ｐＨ５．８〜６．０であり、これをオートクレーブ滅菌した該液体培地
温度条件：３１．５℃
培養容器：５００ｍＬ容の三角フラスコ
通気条件：溶存酸素濃度が１ｐｐｍ以上（例えば、１０％飽和体積濃度を下回らないよう、振とう培養装置の振とう条件として１００〜３００ｒｐｍ）

以上のような基準を採用することにより、β−グルカンを工業的に生産するのに適した菌株をより確実に得ることができる。

上述したように、高温下にあってもよく生育する菌株の選別は、変異処理と所定高温下での培養からなる一連の選別操作を複数回繰り返して行ってもよいが、その場合、上記β−グルカン産生能による選別を組み合わせて行ってもよい。より具体的には、高温下であってもよく生育する菌株であって、更に、β−グルカン産生能が所定基準以上のものを選別し、これを一連の選別操作として複数回、より好ましくは２〜５回、更により好ましくは２〜３回繰り返してもよい。このように、適宜強弱が調整された変異処理と、高温下での培養と、β−グルカン産生能の評価とを組み合わせて、更には、この一連の選別操作を複数回繰り返して菌株を選別することにより、高温下にあってもよく生育し、なお且つ、β−グルカン産生能に優れた変異株を、より効率的に得ることができる。

（β−グルカン高産生菌株の例示）
本発明に用いられるβ−グルカン高産生菌株としては、例えば、Aureobasidium pullulans M-3株等が挙げられる。この菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されており、分譲可能とされている（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２７４４）。菌株以外にも、上述した方法に準じて作出された菌株や、上記所定の培養条件におけるβ−グルカン産生能の条件を満たす菌株を、適宜使用可能である。

（β−グルカンの製造方法）
本発明のβ−グルカンの製造方法では、上記に説明したβ−グルカン高産生菌株を液体培地で培養し、β−グルカンを得る。液体培地としては、上述したように、当業者に周知の培地組成のものを適宜選択して用いることができるが、より詳細には、以下のような組成が挙げられる。

すなわち、炭素源、窒素源、リン、カリウム、マグネシウム、亜鉛等の通常微生物の培養に必要な栄養成分を含む液体培地が用いられる。炭素源としてはスクロース、グルコース、マルトース、キシロース等、微生物の培養に一般的な市販の炭水化物であればいずれも使用できるが、特にスクロース、グルコース、マルトースが好ましい。後述の実施例で示されるように、スクロースであればβ−グルカンの生産性が高まる傾向があるので、より好ましい。炭素源の含有量としては、液体培地中１〜１０質量％程度であることが好ましく、１〜３質量％程度であることがより好ましい（複数用いる場合はその合計量として）。窒素源としては微生物の培養に一般的に使用される大豆粉、魚粉、ファーマメディア、コーンミール、コーンスティープリカー、米ぬか等であればいずれも使用可能であるが、特に魚粉、大豆粉、米ぬかが好ましい。後述の実施例で示されるように、魚粉又は大豆粉であればβ−グルカンの生産性が高まる傾向があるので、より好ましい。また、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、ＤＬ−アラニン等のアミノ酸も窒素源として利用できる。窒素源の含有量としては、液体培地中０．１〜５質量％程度であることが好ましく、０．２〜０．５質量％程度であることがより好ましい（複数用いる場合はその合計量として）。その他にも、液体培地には、例えばＫＨ₂ＰＯ₄を０〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１ｇ／Ｌで、例えばＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを０〜５ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜０．５ｇ／Ｌで、例えばＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏを０〜５ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１．０ｇ／Ｌで、例えばＺｎＳＯ₄を０〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜１ｇ／Ｌで、適宜配合し得る。

培養は、通常の温度範囲である２０〜３５℃で行ってもよいが、好ましくは３０〜３５℃、より好ましくはチラー（冷却装置）を使用しないで、水道水、あるいは地下水、あるいは河川水を培養タンクの温度制御に利用できる範囲の温度で培養するのがより好ましい。これによれば、冷却のためのエネルギーを削減することができる。また、工業的生産のためには、好ましくは２００〜２００，０００Ｌの容量、より好ましくは２，０００〜５０，０００Ｌの容量、更により好ましくは５，０００〜２０，０００Ｌの容量の培養槽を備えた設備で培養することが望ましい。その際、適当な攪拌翼と空気圧縮機によるスパージャーからの通気装置を備えた培養装置等を用いて、培養液中の溶存酸素を確保することが好ましい。溶存酸素濃度としては、１０％飽和体積濃度を下回らないようにすることが好ましく、１５％飽和体積濃度を下回らにようにすることがより好ましい。また、より確実に確保するためには、培養液の溶存酸素濃度をモニターする溶存酸素検出計を設けたり、その検出計による測定値に基づいて、攪拌数や通気量を制御して培養期間中培養液の溶存酸素濃度を維持するようにすることがより好ましい。

本発明の製造方法によって得られるβ−グルカンは、上記液体培地中で上記菌株を増殖させることによって得られる培養物自体の形態で提供されてもよく、あるいは、その培養物の一部であり、培養物から遠心分離やろ過等によって菌体部分を分離除去した溶液部分の形態で提供されてもよい。すなわち、β−グルカン含有組成物の形態で提供されてもよく、例えば、培養物自体からなる場合は、アウレオバシジウム プルランスの菌体を含有する組成物となり、菌体内や菌体外に放出されているものの溶液中に拡散せずに菌体表面にとどまっているβ−グルカンをも同時に含有することとなる。また、培養物の溶液部分からなる場合は、菌体を含有しない組成物となり、それぞれ用途に応じて使用することができる。

本発明の製造方法によって得られるβ−グルカンは、上記菌株の培養物の溶液部分を、更に、エタノール沈澱処理等することによってβ−グルカンを沈殿部に分離濃縮し、エタノール沈澱処理等によってその沈殿部に分離濃縮されない低分子物質を除いた形態のものとすることもできる。

本発明の製造方法によって得られるβ−グルカンは、上記菌株が生産するβ−グルカンの割合が、水分を除く固形分中に５〜９０質量％含有する形態として提供されることが好ましく、２０〜９０質量％含有する形態として提供されることがより好ましい。

本発明の製造方法によって得られるβ−グルカンは、殺菌処理しない形態のものとして提供されることもできるが、通常は、上記培養物を殺菌した形態のもの、もしくは、培養物から遠心分離やろ過等によって菌体部分を分離除去した溶液部分を加熱又は加圧加熱殺菌した形態のものとして提供されることが好ましい。また、ビタミンＣ、有機酸（リンゴ酸、クエン酸等）等のｐＨ調整剤でｐＨを４．５、より好ましくは４．０未満に調整し、食品衛生法の製造基準に定められている緩和な加熱条件で殺菌することにより、食感、着色、味、香り等の食品としての特性の変化を最小限に抑制できる。更に、ビタミンＣ及び／又は有機酸（リンゴ酸、クエン酸等）の添加によれば、本発明のβ−グルカン含有組成物をさわやかな呈味性を伴うものとすることができる。

本発明の製造方法によって得られるβ−グルカンは、上記菌株が産生するβ−１，３−１，６グルカン等の構造を有するβ−グルカンのほか、上記菌株が生産するその他の多糖類、オリゴ糖、食物繊維、ポリフェノール類やその他の成分、あるいは培地から持ち込まれる糖類、アミノ酸類、ビタミン類、ミネラル類等を含有する組成物の形態で提供されてもよい。

本発明の製造方法によって得られるβ−グルカン、あるいはそれを含む組成物の形態であるβ−グルカン含有組成物は、通常用いられる製剤法によって各種製剤に調製することができるが、溶解性の点から、凍結乾燥、噴霧造粒等の粉体・造粒加によって粉末、あるいは顆粒とすることが好ましい。また、それらからカプセル剤や錠剤等を調製することもできる。

本発明の製造方法によって得られるβ−グルカン、あるいはそれを含む組成物の形態であるβ−グルカン含有組成物は、清涼飲料、牛乳、ヨーグルト、乳酸菌飲料、ゼリー飲料、果汁飲料、野菜ジュース、スープ、味噌汁等の各種飲食品に配合することができる。

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、本実施例において、糖質、粘度、及び濁度の測定は、それぞれ次のようにして行った。

（糖質）
液体培養物から遠心分離機を用いて菌体を除いた培養液を蒸留水で２０倍希釈し、これをＡ液とした。次いでこのＡ液をさらに蒸留水で１０倍希釈したものをＢ液とした。このＢ液０．５ｍＬとフェノール試薬０．５ｍＬとの混合液に対して、濃硫酸２．５ｍＬを勢いよく添加し、１０分放置後、激しく攪拌して、更に４０分放置し、分光光度計（SHIMADZU 紫外可視分光光度計 UVmini-1240）を用いて４９０ｎｍの波長での吸光度を測定した。グルコースの水溶液を標準液として定量し、そのグルコース換算量（単位：ｇ／ｄｌ）を全糖値（ＴＳ）とした。一方、Ｂ液の０．２ｍＬをマイクロピペットを用いてマイクロチューブに採取し、エタノールを０．８ｍＬ加え、ボルテックスミキサーで５分間攪拌した後、１４５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心上澄みを０．５ｍＬ採取し、全糖と同様の方法でグルコース換算量（単位：ｇ／ｄｌ）を求めこれを残糖値（ＲＳ）とした。この全糖値（ＴＳ）と残糖値（ＲＳ）から、多糖値（ＰＳ）とβ−グルカン値（ＢＧ）を以下の計算式で求めた。

・多糖値（ＰＳ）＝全糖値（ＴＳ）−残糖値（ＲＳ）
・β−グルカン値（ＢＧ）＝０．７５×多糖値（ＰＳ）

（粘度）
液体培養物から遠心分離機を用いて菌体を除いた培養液の約５０ｍＬをバイアル瓶（４０ｍｍ×７５０ｍｍ）に入れ、粘度計（TVB-10M SPINDLE No. M2、東機産業）のスピンドルをセットし、スピンドル回転速度０．３ｒｐｍの設定において、その３０分後の値を測定した。その後、５分ごとに３回測定し、最大値と最小値を切り捨てて、中間値の平均を求めた。

（濁度）
液体培養物から遠心分離機を用いて菌体を除いた培養液を蒸留水で１０〜２０倍に希釈し、ボルテックスミキサーを用いて十分攪拌した後、分光光度（SHIMADZU 紫外可視分光光度計 UVmini-1240）を用いて波長６６０ｎｍで吸光度を測定した。吸光度に希釈率を乗じた値をＵＯＤ（unit of optical density）として表示した。

［試験例１］
アウレオバシジウム プルランス Ｍ−２株（独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１４）は、メラニン色素の生成蓄積が少ない、良質なβ−グルカンが含まれた、白黄色のジェル状物質を安定的に培養液中の菌体外に生成する、β−グルカンの大量生産に適した菌株である（以下、「Ｍ−２株」という。）。ただし、β−グルカン生産に対する至適温度が２０〜２５℃と、工業的生産の目的からすると温調のエネルギーコスト等の観点からは、若干低く、またそのβ−グルカンの蓄積濃度も０．３〜０．６ｇ／ｄｌと、十分とはいい難かった。そこでＭ−２株を親株として、β−グルカン生産に対する至適温度が改善した菌株の取得を試みた。

具体的には、以下のスクリーニングにより、Ｍ−２株の変異株として、β−グルカン高産生菌株を得た。即ち、Ｍ−２株をＰＤＡ（Potato Dextrose Agar：Difco 社製）のスラント培地上で７日間培養し、得られた菌体をＰＢＳの１０ｍＬに懸濁し、菌体濃度がおよそ１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ程度の菌体懸濁液とした。その菌体懸濁液の０．１ｍＬをＰＤＡのプレート培地上に塗布し、その後のプレート培地上の菌体に対して生存率５〜１５％程度となるような照射時間でＵＶ照射処理を行った。３１．５℃で７日間静置培養してコロニーを採取し、以下の培養試験により更に選別した。

炭素源としてスクロースを２．０質量％、窒素源として魚粉（市販の煮干しイワシを自家粉末化して調製した魚粉）を０．３質量％含有した培地（オートクレーブ装置にて１２１℃、２５分殺菌）の１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコに入れ、上記コロニー個々をそれぞれ滅菌したスパーテルで細かく砕いたのち植菌し、ロータリーシェーカー（振とう条件：１５０ｒｐｍ）を用いて３１．５℃で３日間培養した。培養後の培養液について粘度、β−グルカンの蓄積濃度を測定し、両者が高い値を示したコロニーを候補株として選別した。

選別した候補株について、上記の変異操作処理とこれに続く培養試験による選別を、更に２回繰り返し、最終的に得られた変異株をAureobasidium pullulans M-3株と命名し、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−０２７４４）。

［試験例２］
Aureobasidium pullulans M-3株（以下、「Ｍ−３株」という。）の菌学的性質を、親株であるＭ−２株と比較するために、寒天平板培地上でＭ−２株は２４．５℃、Ｍ−３株は３１．５℃で１週間培養したコロニーについて、その直径・色調、表面性状、可溶性色素生産の有無になどを巨視的に観察し、また、その栄養菌糸の形状や分生子形成様式などの微視的形態を顕微鏡下に観察した。その結果、寒天平板培地上のＭ−３株のコロニーの形状は、直径、色調、表面形状、色素生産などに関して、親株であるＭ−２株の諸形状と何らの相違も認められなかった。更に、Ｍ−３株が、親株であるＭ−２株同様、所定の液体培地による培養後の培養液にβ−グルカンを分泌するβ−グルカン産生菌であることは、別途、Ｍ−２株の産物を指標にしたＨＰＬＣ分析等により確認された。

一方、Ｍ−３株を液体培養したときの細胞形態は、Ｍ−２株を３１．５℃で液体培養した場合に比較して、著しく異なっていた。その結果を図１に示す。

図１は、Ｍ−２株又はＭ−３株を、炭素源としてスクロースを２．０質量％、窒素源として魚粉を０．３質量％含有した液体培地（下記試験例４で使用したものと同様の培地）を用いて、３１．５℃で６日間、液体培養したときの菌体の形状を示す顕微鏡写真である。図１（ａ）に示されるように、親株であるＭ−２株では、培養液中の菌体はほとんどが糸状菌型を呈していた。これに対し、図１（ｂ）に示されるように、Ｍ−２株の変異株であるＭ−３株は、培養液中の菌体はほとんどが酵母型を呈していた。

アウレオバシジウム プルランスのような不完全菌のライフサイクルでは、貧栄養培地あるいは低温などの環境条件が悪い時には、出芽後の細胞間の分離が妨げられ、細胞が連鎖した菌糸状の細胞になるものと考えられている（宮脇香織他，生物工学誌, 第88巻, 12号, 634-641（2010））。しかしながらＭ−３株の場合、図１で示したように、菌糸状の細胞がほとんど検出できなかった。また、別途の試験においても、窒素源の如何にかかわらず、更には、培養温度を従来の２４．５℃と低くしても、Ｍ−３株では、図１（ａ）のＭ−２株にみられるような菌糸状の細胞がほとんど検出できなかった。これは、Ｍ−３株は遺伝子レベルで、環境条件が悪くなった場合に出芽後の娘細胞を分離する能力が喪失もしくは低下したためであると考えられた。そして、酵母型細胞が維持されると、細胞が連鎖した菌糸状の菌糸同士の絡み合い、菌糸塊（ペレット）の形成が抑制されて、個々の細胞に酸素や栄養成分がよりいきわたりやすくなるので、これにより高温下でのβ−グルカンの生産性に優れているものと考えられた。

［試験例３］
Ｍ−３株の培養最適化の一環として、培地の炭素源がβ−グルカン産生能に与える影響について調べた。具体的には次のようにフラスコ振とう培養試験を行った。

炭素源として、グルコース、スクロース、フラクトース、キシロース、又はマルトースをそれぞれ最終濃度が２．０質量％であるように、あるいはデンプンを硫酸で酸加水分解した糖化液をグルコース換算量にして最終濃度が２．０質量％であるように、及び、窒素源として、魚粉（いわし粉末、ヤマキ）を最終濃度が０．３質量％であるように水道水に溶解し、ｐＨが５．８〜６．０付近にあることを確認した後、その１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコに分注して、フラスコごとオートクレーブ処理して（１２１℃、２０分間）、滅菌した。これにＭ−３株を植菌し、振とう培養装置（TB-12R-2F、高崎科学器械）を使用して、振とう条件１５０ｒｐｍ、温度条件３１．５℃にて、４日間培養した。培養２日目には、フラスコ壁面に付着した固形分を手で振り落した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去した培養液上澄み中の糖質量、粘度、及び濁度の諸物性を分析した。その結果を表１に示す。

その結果、β−グルカン生産能に与える炭素源の種類の影響は、親株であるＭ−２株と同様の傾向となり、Ｍ−２株の変異株であるＭ−３株の培養において、β−グルカン産生のための炭素源としては、スクロースが最適であることが明らかとなった。

［試験例４］
Ｍ−３株の培養最適化の一環として、培地の窒素源がβ−グルカン産生能に与える影響について調べた。具体的には次のようにフラスコ振とう培養試験を行った。

炭素源として、スクロースを最終濃度が２．０質量％であるように、及び、窒素源として、米ぬか（商品名「オリザドリム」、オリザ油化）、大豆粉（商品名「ソーヤフラワーFT-N」、日清オイリオグループ）、魚粉（いわし粉末、ヤマキ）、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）（商品名「ソルリス」、オリエンタル酵母工業）、又は酵母エキス（酵母エキスＢ２、オリエンタル酵母工業）をそれぞれ最終濃度が０．３質量％であるように水道水に溶解し、ｐＨが５．８〜６．０付近にあることを確認した後、その１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコに分注して、そのフラスコごとオートクレーブ処理して（１２１℃、２０分間）、滅菌した。これにＭ−３株を植菌し、振とう培養装置（TB-12R-2F型、高崎科学器械）を使用して、振とう条件１５０ｒｐｍ、温度条件３１．５℃にて、４日間培養した。培養２日目には、フラスコ壁面に付着した固形分を手で振り落した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去した培養液上澄み中の糖質量、ｐＨ、粘度、及び濁度の諸物性を分析した。培養試験は、各窒素源について２回行った。その結果を表２に示す。

その結果、Ｍ−２株の変異株であるＭ−３株の培養において、β−グルカン産生のための窒素源としては、米ぬか、大豆粉、魚粉、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、酵母エキスのいずれも使用可能であったが、特に、魚粉が最も優れており、大豆粉がそれに続いて優れていた。

［試験例５］
Ｍ−３株の培養最適化の一環として、培地の炭素源あるいは窒素源の濃厚化がβ−グルカン産生能に与える影響について調べた。具体的には、炭素源をスクロース、窒素源を魚粉とし、下記表３に示す通り、それぞれに最終濃度を変化させ、培養日数を６日にした以外は、試験例３、４と同様にして、フラスコ振とう培養試験を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去した培養液上澄み中の糖質量及び粘度の諸物性を分析した。培養試験は、窒素源の各濃度について２回行った。その結果を表３に示す。

その結果、Ｍ−２株の変異株であるＭ−３株の培養において、窒素源である魚粉を濃厚化しても、β−グルカン産生及びその結果としての粘度への影響はほとんど見られなかった。一方で、炭素源であるスクロースを濃厚化し、培養日数を延長したとき、β-グルカン産生量は顕著に増加し、結果的に培養液の粘度も増加した。

［試験例６］
試験例１のスクリーニングで得られたＭ−３株について、親株であるＭ−２株と比較して、その培養特性の優位性を確認するために、３Ｌ−ジャーファーメンター（３ＭＤＬ、丸菱バイオエンジ）での培養試験を行った。なお、両株の比較にあたっては、それぞれの菌株での最適培養条件、すなわち親株であるＭ−２株については培養温度２４．５℃で６日培養（現行培養法）、Ｍ−３株については培養温度３１．５℃で３日培養、で行った。

具体的には、液体培地としてオリザ培地（炭素源：スクロース２．０質量％、窒素源：米ぬか０．３質量％、ｐＨ５．８〜６．０、オリザ油化）又はＦＭ培地（炭素源：スクロース２．０質量％、窒素源：魚粉０．３質量％、ｐＨ５．８〜６．０、オリザ油化）を使用し、それぞれ１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌したものに、Ｍ−２株又はＭ−３株の凍結保存株の１ｍＬを添加して、各至適温度である２４．５℃又は３１．５℃で３日間培養し、これを前培養液とした、その前培養液の全量を、１．６Ｌの滅菌したオリザ培地又はＦＭ培地を仕込んだ３Ｌ−ジャーファーメンター（３ＭＤＬ、丸菱バイオエンジ）に植菌し、溶存酸素濃度(Dissolved Oxygen, DO)を監視ながら、攪拌数と通気量を適切に制御しつつ、Ｍ−２株については培養温度２４．５℃で６日間培養し、Ｍ−３株については培養温度３１．５℃で３日間培養した。表４に、それぞれの培養結果を示した。

その結果、Ｍ−２株及びＭ−３株のそれぞれの最適培養条件で比較した場合、β-グルカンの平均生産速度（ｇ／ｄｌ／日）が、Ｍ−３株では、Ｍ−２株と比較して２〜３倍近く増加しており、β-グルカン生産能力が著しく高いことが明らかとなった。

［試験例７］
Ｍ−３株の工業的実用性を実証するため、２００Ｌ通気攪拌槽による実証試験を行った。具体的には次のように試験を行った。

液体培地としてＦＭ培地（炭素源：スクロース２．０質量％、窒素源：魚粉０．３質量％、ｐＨ５．８〜６．０、オリザ油化）を使用し、その１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌（１２１℃、２５分間）したものに、Ｍ−３株の凍結保存株の１ｍＬを添加して、２４．５℃、３日間培養し、これを前前培養液とした。次いで、その前前培養液の１２ｍＬを、同様にＦＭ培地４００ｍＬを２L三角フラスコに入れてオートクレーブ滅菌（１２１℃、２５分間）したものの４本にそれぞれ植菌し、３１．５℃の培養温度で３日間振とう培養し、この４本のフラスコの培養液１．２Ｌを、２００Ｌ通気攪拌槽ヘの前培養液とした。

一方、２００Ｌ通気攪拌槽には１２０Ｌの水道水を張り込み、これに攪拌しながらスクロース２．４ｋｇ、魚粉０．３６ｋｇを投入し、１２１℃で２５分間滅菌した。培地の温度が３１．５℃になった後、上記前培養液１．２Ｌを無菌的に通気攪拌槽に植菌した。攪拌翼回転速１５０ｒｐｍ、通気量５０Ｌ／ｍｉｎで培養を開始した。溶存酸素センサー（モデルＳＯＤＣ、株式会社バイオット）で溶存酸素を監視しながら、溶存酸素濃度が２ｐｐｍ（１５％飽和体積濃度を下回らならないように、攪拌翼回転速を最高２００ｒｐｍまで上げる制御を行った。また、それでも溶存酸素濃度を１５％飽和体積濃度に維持できない場合は、通気量を最高１２０Ｌ／ｍｉｎまで上げる制御を行った。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去した培養液上澄み中の糖質量、粘度、ｐＨ、及び濁度の諸物性を分析した。その結果を表５に示す。

その結果、現行のＭ−２株による培養生産では、管理目標値をβ−グルカンの含有量を０．６ｇ／ｄｌ、粘度を４０Ｐａ・ｓ前後に設定し、６日間の培養でその目標値を達成しているが、Ｍ−３株を使用した培養生産では、培養２日目で現行の目標値を上回っており、Ｍ−３株の工業的実用性について実証されたとともに、Ｍ−２株に対する優位性が確認された。

［試験例８］
Ｍ−３株の工業的実用性を更に実証するため、２００Ｌ通気攪拌槽による実証試験を行った。具体的には、培養３日目にスクロースをフィードする以外、試験例７に準じて、２００Ｌ通気攪拌槽による実証試験を行った。表６に、培養液物性の経時変化示した。

その結果、試験例７でも確認されたように、培養２日目で、β-グルカン蓄積量、粘度ともに、Ｍ−２株の６日目の培養液と同じレベルに達しており、Ｍ−３株の優位性が再確認された。加えて、スクロースを３日目にフィードすることにより、β−グルカンの蓄積がさらに継続し、最終的なβ-グルカン蓄積量が２ｇ／ｄｌ以上となり、現行法の３倍以上に達することが明らかとなった。

［試験例９］
調製例７で製造されたβ−グルカン培養液について、アスコルビン酸、リンゴ酸、又はクエン酸を用いて、その培養液のｐＨを調整した。すなわち、培養終了後、菌体を遠心分離機で除去した後の培養液に、上記有機酸の１０％水溶液を用いて、攪拌下でそれぞれｐＨを４．０に合わせ、オートクレーブ装置で８５℃、３０分間滅菌を行った。冷蔵庫で１夜放置した後、試食を行い、香味の比較を行った。その結果、酸味としては、アスコルビン酸＞クエン酸＞リンゴ酸の順番で強く、リンゴ酸については特に爽快感があり、さわやかな酸味が感じられた。

［試験例１０］
試験例１と同様のスクリーニングにより、Ｍ−２株を親株として、その変異株のなかか３１．５℃の培養で、培養後の培養液の粘度が高く、β−グルカンの蓄積量が向上した菌株を、更に３株単離した。それらをアウレオバシジウム プルランス ＮＹ３（Ｃ４８３）株、ＮＹ３（Ｃ１５１）株、又はＮＹ３（Ｃ２４６）株と命名した。

試験例１０のスクリーニングで得られたＮＹ３（Ｃ４８３）株、ＮＹ３（Ｃ１５１）株、及びＮＹ３（Ｃ２４６）株について、親株であるＭ−２株や試験例１のスクリーニングで得られたＭ−３株と比較して、その培養特性の優位性を確認するために、５００ｍＬ三角フラスコでのフラスコ振とう培養試験を行った。

具体的には、炭素源として、シュクローを最終濃度が２．０質量％であるように、及び、窒素源として、米ぬか（商品名「オリザドリム」、オリザ油化）又は魚粉魚粉（いわし粉末、ヤマキ）を最終濃度が０．３質量％であるように水道水に溶解し、ｐＨが５．８〜６．０付近にあることを確認した後、その１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコに分注して、フラスコごとオートクレーブ処理して（１２１℃、２０分間）、滅菌した。各菌株を植菌し、振とう培養装置（TB-12R-2F、高崎科学器械）を使用して、振とう条件１５０ｒｐｍ、温度条件３１．５℃にて、３日間培養した。表７に、それぞれの培養結果を示した。

その結果、上記３１．５℃での培養条件において、各変異株のβ−グルカン産生能は、その親株であるＭ−２株に比べて、いずれも顕著に向上していた。例えば、炭素源としてスクロース２．０質量％、窒素源として米ぬか０．３質量％を含有する液体培地で３日間培養した後のβ−グルカン値は、Ｍ−２株では０．１４ｇ／ｄｌであったのに比べて、Ｍ−３株では０．４１ｇ／ｄｌであり、ＮＹ３（Ｃ４８３）株では０．５１ｇ／ｄｌであり、ＮＹ３（Ｃ１５１）株では０．４５ｇ／ｄｌであり、ＮＹ３（Ｃ２４６）株では０．５３ｇ／ｄｌであり、いずれも少なくとも２倍以上に生産能が高められることが明らかとなった。

Claims (9)

1. アウレオバシジウム プルランスに属する菌株を親株とする変異株であって、３１．５℃で３日間培養したときの培養液中のβ−グルカン含有量として、前記親株に比べて２倍以上に該β−グルカン産生能が高められていることを特徴とするβ−グルカン高産生菌株。
2. アウレオバシジウム プルランスに属する菌株であって、３１．５℃で３日間培養したときの培養液中のβ−グルカン含有量が３ｇ／Ｌ以上であることを特徴とするβ−グルカン高産生菌株。
3. Aureobasidium pullulans M-3株である、請求項１又は２記載のβ−グルカン高産生菌株。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のβ−グルカン高産生菌株を液体培地で培養し、β−グルカンを得ることを特徴とするβ−グルカンの製造方法。
5. 前記培養を２０．０〜３５．０℃の温度条件で行う、請求項４記載のβ−グルカンの製造方法。
6. 前記培養を魚粉及び／又は大豆粉を窒素源とする液他体培地で行う、請求項４又は５記載のβ−グルカンの製造方法。
7. アウレオバシジウム プルランスに属する菌株を親株とし、変異処理を行ない、３０．０〜３５．０℃の温度条件で培養して、前記温度条件で生育可能な菌株を選別し、更に、前記親株に比べてβ−グルカンの産生能が高められている菌株を選別することを特徴とするβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法。
8. 前記温度条件で生育可能な菌株を寒天培地上で選別する、請求項７記載のβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法。
9. 前記親株に比べてβ−グルカンの産生能が高められている菌株の選別を、液体培地で培養したときの該培養液中のβ−グルカン含有量を、前記親株のそれと比較することにより行う、請求項７又は８記載のβ−グルカン高産生菌株のスクリーニング方法。