KR101189888B1 - Ｒｎａ 함량이 증대된 신규 효모 변이주, 그 제조방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

칸디다 속(Candida sp .) 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35, 수탁번호: KFCC11480P) 및 그 제조방법을 제공한다. 또한, 핵산 함량이 높은 효모 추출물 또는 추출물의 엑기스 및 이를 포함하는 식품 첨가제를 제공한다. 상기 효모 변이주는 고농도의 RNA를 함유하며, 이를 추출한 추출물은 정미성이 우수하고, 식품 첨가제 또는 건강식품 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

Description

ＲＮＡ 함량이 증대된 신규 효모 변이주, 그 제조방법 및 용도{Novel yeast mutant containing increased RNA content, method for producing the same and use thereof}
본 발명은 RNA 함량이 증대된 신규 효모 변이주, 그 제조방법 및 상기 효모 변이주에 대한 활용방안에 관한 것이다.
핵산 조미료는 1950년대 이후 널리 이용되는 조미료로서, 이에 대한 연구가 시작된 것은 일본 고유의 조미료인 가다랭이의 맛을 결정하는 주성분이 IMP(inosine monophosphate), GMP(guanosine monophosphate) 등과 같은 핵산 성분이라는 것이 1913년 고다마(Kodama)에 의하여 밝혀진 이후이다. 핵산 조미료는 1950년대 이후 널리 이용되었고, 1960년대에는 핵산 조미료 제조법의 기초연구가 쿠니나카(kuninaka) 등에 의하여 확립됨으로써 효모 RNA의 분해법에 의한 공업적인 생산이 시작되었다.
핵산 조미료의 맛은 함유된 뉴클레오티드의 구조에 따라 결정된다. 예를 들어, 핵산 조미료의 맛을 충분히 내기 위해서는, (i) 뉴클레오티드의 구조 내에 퓨린 핵을 가질 것, (ii) 푸린의 6번 탄소 위치에 하이드록시기가 있을 것, (iii) 리보스의 5번 탄소위치에 인산기가 있을 것 등의 조건을 만족하여야 한다. 이러한 조건을 만족시키는 뉴클레오티드의 종류로는 IMP(inosine monophosphate), GMP(guanosine monophosphate) 및 XMP(xanthosine monophosphate) 등이 있으며, 맛의 세기는 GMP, IMP 및 XMP의 순이고, 일반적으로 둘 또는 그 이상을 혼합하였을 때 상승 효과를 나타낸다.
한편, 뉴클레오티드는 MSG(monosodium glutamate)와 혼합하였을 때 맛의 상승 효과를 나타내기 때문에, MSG와 혼합한 복합 조미료의 형태로 판매되기도 한다. 그러나, 최근에는 화학적 합성으로 만든 제품에 대한 기호도가 떨어지면서 MSG(monosodium glutamic acid)를 대체 할 수 있는 천연 풍미 소재에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 천연 풍미 소재로 등장한 것이 바로 효모 추출물이다. 일반적으로 효모는 GRAS(generally recongnized as safe)의 범주에 들어가는 안전한 미생물로 식품 및 음료에 있어서 알코올 발효에 이용될 뿐만 아니라, 효모 세포 자체를 보강하거나 변형시켜 얻어낸 추출물 등이 다양하게 이용되고 있다.
종래의 효모 추출물을 제조하는 방법은, 자가소화방법을 포함하고 있기 때문에 제조시간이 길고 수율이 매우 낮아 경제성이 떨어지며, 발효과정에서 특유의 효모취 등이 발생되는 문제점이 있다. 이를 보완하기 위해서, 한국특허출원공개 제1998-00030호에는 효소처리에 의해 효모 추출물을 제조하는 방법이 개시되어 있으나, 효소처리에 의한 방법 역시 단백질의 분리가 불충분하여 쓴맛 펩티드가 최종 제품까지 이전되어 품질이 떨어지고, 특히 제조공정이 복합하여 실제 생산 공정에 적용하기에는 무리가 있다.
본 발명의 일실시예의 목적은 칸디다 속(Candida sp .) 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 M35를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 높은 RNA 함량을 갖는 고핵산 효모 변이주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일실시예의 목적은 핵산 함량이 높은 효모 추출물 또는 엑기스를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 하여, 칸디다 속(Candida sp .) 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35, 수탁번호: KFCC11480P) 및 그 제조방법을 제공한다. 또한, 핵산 함량이 높은 효모 추출물, 엑기스 및 이를 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 신규 효모 변이주는 고농도의 RNA를 함유하며, 이를 추출한 추출물은 정미성이 우수하고, 식품 첨가제 또는 건강식품 분야에서 다양하게 활용 가능하다.
도 1은 배지에 함유된 탄소원의 성분을 달리하여 효모 변이주를 배양한 결과를 분석한 그래프이다;
도 2는 배지에 함유된 질소원의 성분을 달리하여 효모 변이주를 배양한 결과를 분석한 그래프이다;
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 효모 변이주와 기존의 야생종에 함유된 RNA 함량 등을 비교 분석한 그래프이다.
본 발명은 신규 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35)를 제공한다. 상기 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35)는 칸디다 속(Candida sp .) 효모 변이주로서, RNA를 고농도로 함유하며 염화칼륨(KCl)에 대한 내성을 갖는다. 상기 효모 변이주는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)를 모균주로 하고, 변이유도제를 처리하여 모균주보다 염화칼륨 내성이 증가한 변이주를 선택함으로써 얻어진다. 본 발명의 일실시예에 따른 신규 효모 변이주에 함유된 RNA 농도는, 1,500 내지 10,000 mg-RNA/L, 보다 구체적으로는 3,000 내지 7,000 mg-RNA/L이다. 상기 RNA 농도 범위는 기존의 야생균주와 비교하여 2~5 배 증가한 수치이다. 또 다른 일실시예에서, 신규 효모 변이주에 함유된 RNA 함량은, 건조 균체 중량당, 5 내지 30 중량%이다.
상기 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35)는 2010년 2월 12일 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms)에 미생물 수탁번호 KFCC11480P로 기탁하였다.
본 발명은 또한, RNA 함량이 높은 고핵산 효모의 제조방법을 제공한다. 일실시예에서, 상기 제조방법은,
모균주인 칸디다속(Candida sp .) 효모에 변이유도제를 처리하는 공정; 및
효모의 RNase의 활성을 억제하는 금속염이 첨가된 배지에서 생장이 가능한 균체를 선별 및 분리하는 공정을 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 모균주인 칸디다속 효모는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)(기탁기관: 한국미생물보존센터, 수탁번호: KCCM50342)이며, 사용된 변이유도제는 EMS(Ethyl methanesulfonate)일 수 있다. 상기 금속염은, 효모의 RNase의 활성을 억제하는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 염화칼륨(KCl)일 수 있다. 일실시예에서, 상기 제조방법으로 제조된 효모는 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35)(한국미생물보존센터에 미생물 수탁번호 KFCC11480P로 2010년 2월 12일 기탁됨)이다.
상기 고핵산 효모의 제조방법은, 모균주를 선별하는 공정을 더 포함할 수 있다. 모균주를 선별하는 공정에서는, 금속염이 첨가되지 않은 배지에서는 자라지만 금속염이 첨가된 배지에서는 자라지 못하는 효모주를 분리한 후, RNA 함량이 높은 균체를 선별하는 과정을 포함한다. 고핵산 효모의 제조방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저, 염화칼륨(KCl)이 첨가된 배지에서는 자라지 못하지만 염화칼륨이 첨가되지 않는 배지에서는 잘 자라는 효모주 중에서 RNA 함량이 높은 균체를 선별한다. 선별된 균체에 변이유도제인 EMS(Ethyl methanesulfonate)를 처리하여 변이를 유도한다. 변이가 유도된 균체 중에서 염화칼륨(KCl)이 첨가된 배지에서 생장이 가능하고, RNA 함량이 높은 변이주를 선정하게 된다.
상기 고핵산 효모의 제조방법에서 사용된 배지는 탄소원, 질소원 및 무기염 등을 포함할 수 있다.
일실시예에서, 상기 효모의 제조방법에 사용된 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 탄소원 3~10 중량%를 함유하며, 상기 탄소원으로, 말토오스(maltose), 슈크로오스(sucrose), 칼락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 프락토오스(fructose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose) 및 콘스팁리커(corn steep liquor)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 효모의 제조방법에 사용된 배지는, 배지 전체 중량을 기준으로, 질소원 1~5 중량%를 함유하며, 상기 질소원으로, 콘스팁리커(corn steep liquor), 염화암모늄(NH4Cl), 인산암모늄(NH4H2PO4), 황산암모늄((NH4)2PO4), 대두 펩톤(soy peptone), 효모추출물(yeast extract) 및 맥아추출물(malt extract)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
일실시예에서, 상기 효모의 제조방법에서, 배지에서의 배양온도는 20~35℃, 보다 구체적으로는 온도 28~32℃, 보다 구체적으로는 30℃일 수 있다. 또한, 배양시 pH는 4~6, 보다 구체적으로는 4.5~5.5 범위일 수 있다. 상기 배양조건은, 효모가 염화칼륨이 첨가된 배지에서는 잘 자라지 못하지만, 염화칼륨이 첨가되지 않은 배지에서는 잘 자라는 범위를 선정한 것이다. 또한, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 염화칼륨의 존재 유무와 관계없이 효모의 생장이 저하될 수 있다.
또한, 본 발명은 고핵산 효모 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 일실시예에서, 상기 고핵산 효모 추출물의 제조방법은,
모균주인 칸디다속 효모에 변이유도제, 방사선 또는 UV(Ultraviolet)를 처리하여 변이를 유도하는 공정;
변이된 효모주 중에서, RNase의 활성을 억제하는 금속염이 첨가된 배지에서 생장이 가능한 균체를 선별 및 분리하는 공정; 및
분리된 균체에 세포벽 분해효소, 핵산 분해효소, AMP 전환효소 및 단백질 분해효소를 처리하여 효소 분해하는 공정을 포함한다.
상기 고핵산 효모 추출물의 제조방법에서, 효모의 변이를 유도하기 위해서, 변이유도체, 방사선 또는 UV를 처리하는 방법 등이 사용될 수 있다. 사용 가능한 변이유도체의 예로는 EMS(Ethyl methanesulfonate) 등이 있다. 또한, 상기 금속염은 효모의 RNase의 활성을 억제하는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 염화칼륨(KCl)일 수 있다. 상기 제조방법으로 제조된 효모는, 예를 들어, 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35)이다.
일실시예에서, 상기 효소 분해하는 공정은 pH 4~8, 온도 50~70℃에서 45~60 시간 동안 진행될 수 있다. 상기 조건 및 시간은, 분해효소에 의한 분해효율을 고려한 것이다.
또 다른 일실시예에서, 상기 고핵산 효모 추출물의 제조방법은, 효소 분해하는 공정 이후에, 반응 생성물을 원심분리 및 활성탄 처리를 통해 탈색 및 탈취한 후 여과하여 농축하는 과정을 더 포함한다. 이러한 후처리 공정을 통해, 제조된 효모 추출물의 상품 가치를 높이고, 활용범위를 넓히는 효과가 있다.
본 발명에 따른 고핵산 효모 추출물의 제조방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 염화칼륨(KCl)이 첨가된 배지에서는 자라지 못하지만 염화칼륨이 첨가되지 않는 배지에서는 잘 자라는 효모주 중에서 RNA 함량이 높은 균체를 선별한다. 선별된 균체에 변이유도제인 EMS(Ethyl methanesulfonate)를 처리하여 변이를 유도한다. 변이가 유도된 균체 중에서 염화칼륨(KCl)이 첨가된 배지에서 생장이 가능하고, RNA 함량이 높은 효모 변이주를 선정하게 된다.
선정된 효모 변이주는 1차 원심분리를 거쳐 효모 슬러리를 제조하게 된다. 1차 원심분리는, 특별히 제한되는 것은 아니나, 관형 원심분리기, 연속식 원심분리기, 연속식 고액 분리, 농축장비 등을 이용하여 시행할 수 있다. 1차 원심분리된 효모 슬러리는 수세과정을 통해 효모취 및 배양배지를 씻어낸 후, 살균 처리한다.
살균 처리를 통해 효모의 세포벽을 연화시키게 되며, 세포벽 분해효소, 핵산 분해효소, 핵산 전이 효소, 엑소형 단백질 분해효소를 첨가하여 반응을 진행시킨다. 효소 반응은 pH 4~8, 온도 50~70℃에서 48 시간 이상 진행할 수 있다. 효소 반응이 완료되면, 활성탄 처리를 통해 특유의 효모취를 제거하고 색도를 밝게 유지하는 과정을 추가적으로 거칠 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 효모 배양물, 추출물 또는 엑기스를 포함하는 식품 첨가제 및 기능성 식품을 제공한다. 일실시예에서, 상기 식품 첨가제는 조미료일 수 있다. 또한, 상기 효모는 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35)일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 포함하는 다양한 형태의 식품 첨가제 또는 기능성 식품을 제공한다. 상기 조성물을 포함하는 조미료, 생균제제 및 건강보조식품 등으로 가공될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가제의 형태로 사용될 수 있다.
일실시예에서 상기 조성물은, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01~5 중량%, 보다 구체적으로는 0.01~3 중량% 범위일 수 있다.
이하, 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상술하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 모균주의 선별
염화칼륨이 첨가된 배지에서는 자라지 못하고, 염화칼륨 무첨가 배지에서 잘 자라는 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 균주 20 주 선별하여 배양하였다. 배양 후 균체를 회수하여 건조 균체량 및 RNA 함량을 측정하여 건조 균체량 당 RNA 함량의 함량이 높은 효모주를 선별하였다.
[실시예 2] 효모 변이주의 배양
실시예 1에서 선별된 칸디다 유틸리스(Candida utilis)를 YM(Difco TM YM Broth, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1% dextrose)배지를 포함하는 시험관에서 대수증식기까지 배양하였다. 배양된 균체에 EMS(Ethyl methanesulfonate)를 처리한 후, 생존율이 30% 이하가 되는 조건에서 변이를 유도하였다. 돌연변이가 유발된 균주 20 주를 1.5 M 염화칼륨을 함유하는 YM 배지에 도말하고, 30℃에서 48 시간 이상 배양하였다.
배양된 효모에 대해 RNA 함량을 측정하여, RNA 함량이 증가된 M35 균주를 획득하였다. 획득한 효모 변이주(칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35))는 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms)에 KFCC11480P의 번호로 기탁하였다.
[실시예 3] 효모 변이주의 균학적 성질
1. 배양 온도 및 pH
배양 온도 및 pH를 달리한 조건에서 변이주 M35를 접종하여 배양을 실시하였다. 온도 및 pH에 따른 핵산 함량 및 건조 균체량의 측정을 통하여 최적 배양 조건을 검색하였다. 결과는 하기 표 1에 개재하였다.
온도 pH 균체 농도
(g-DCW/L)		 RNA 농도
(mg RNA/L)		 RNA 함량
(mg-RNA/g-DCW)
25℃ 3 3.02 529.6 175.4
3.5 4.17 862.9 206.9
4 5.47 1121.3 205.0
4.5 5.77 1321.3 229.0
5 5.98 1408.8 235.6
5.5 5.79 1192.1 205.9
6 6.17 1392.1 225.6
7 6.31 1383.8 219.3
30℃ 3 3.92 683.8 174.4
3.5 4.78 912.9 191.0
4 5.01 1125.4 224.6
4.5 5.96 1408.8 236.4
5 5.98 1137.9 190.3
5.5 6.18 1300.4 210.4
6 6.35 1342.1 211.4
7 6.06 1258.8 207.7
상기 표 1을 참조하면, 배양온도는 30℃가 적당하고, pH는 4.5~5.5 수준을 유지하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
2. 배양 배지
배양 배지에 함유되는 탄소원 및 질소원의 종류에 따른 효모 변이주 M35의 균체농도, RNA 농도 및 RNA 함량을 측정하였다.
탄소원으로 말토오스(maltose), 슈크로오스(sucrose), 칼락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 프락토오스(fructose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose) 및 콘스팁리커(corn steep liquor)을 각각 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 배지에 동량으로 첨가하고, 효모 변이주 M35를 배양하였다. 대조군으로는 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 배지를 사용하였다.
질소원으로 콘스팁리커(corn steep liquor), 염화암모늄(NH4Cl), 인산암모늄(NH4H2PO4), 황산암모늄((NH4)2PO4), 대두 펩톤(soy peptone), 효모추출물(yeast extract) 및 맥아추출물(malt extract)을 각각 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 배지에 동량으로 첨가하고, 효모 변이주 M35를 배양하였다. 대조군으로는 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 배지를 사용하였다.
배양 배지에 함유되는 탄소원 및 질소원의 종류에 따른 효모 변이주 M35의 균체농도, RNA 농도 및 RNA 함량을 측정하였고, 측정결과는 도 1(탄소원) 및 2(질소원)에 각각 도시하였다.
[실시예 4] RNA 함량 비교
전배양으로 효모 야생종과 변이종(Candida utilis M35)을 각각 1차 종배지 함유 시험관에서 12 시간 배양한 다음, 2차 종배지에서 12 시간 배양 후, 발효조에 접종하였다. 1차 종배지로는 YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) 배지를 사용하였고, 2차 종배지로는 산업용 배지(5% 당밀, 2% CSL)를 사용하였다. 또한, 발효배지로는 0.03% 우레아, 0.004% KH2PO4, 0.02% MgSO4, 0.02%ZnSO4, 1 ppm 비오틴을 첨가한 산업용 배지(10% 당밀, 5% CSL)를 사용하였다.
발효조 내 배양 조건은 작업부피 2.5 L, pH 5.5, 30℃, 교반 속도 200~500 rpm, 공기 포화도 20% 이상으로 유지하였다. 이 같은 조건으로 20 시간까지 배양하였을 때, 시간에 따른 RNA 농도와 균체 농도의 변화 및 RNA 함량 변화를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 발효조에서의 야생종과 변이종은 모든 실험 처리구에서 변이종이 매우 우수한 결과를 보여주었다. 우선 건조균체량은 변이종이 야생종보다 4 배 이상 증가된 것으로 나타났으며, RNA 함량 또한 10 배 이상 증가된 수치를 보여주었다.
[실시예 5] RNA 함량 비교
효모 야생종과 변이종(Candida utilis M35)으로부터 효모 추출물을 제조하였다. 실시예 4를 통해 배양된 균체를 회수한 후 물로 1~5 회 세척하였다. 세척된 균체를 열처리하고 세포벽 분해효소, 핵산 분해효소, AMP 전환효소 및 단백질 분해효소를 처리하였다. 효소분해가 완료된 효모에 대하여 RNA 함량 등을 측정하였으며, 측정된 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
RNA 농도
(mg-RNA/L)		 건조 균체량
(g-DCW/L)		 RNA함량
(mg-RNA/g-DCW)		 IMP
(%, w/w)		 GMP
(%, w/w)
야생종 1285.0. 12.0 107.08 1.5 2.1
변이종(M35) 6523.0 24.2 269.5 7.1 8.5
표 2를 참조하면, 변이종(M35)은 야생종에 비해 균체량은 2 배, RNA 농도는 5배 이상, IMP+GMP 함량은 4 배 이상 증가한 수치를 보였으며, 최종적으로 제조된 효모추출물의 IG 함량은 15% 이상인 고핵산 효모 추출물이 제조되었다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11480 20100212

Claims (12)

  1. 온도 30℃ 및 pH 5.5 조건 아래 10% 당밀과 5% 콘 스팁 리커(corn steep liquor)를 포함하는 배지에서 배양하였을 때, 건조 균체 g당 269.5 mg 이상의 RNA 함량을 가지는 칸디다 속(Candida sp.) 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 M35(Candida utilis M35, 수탁번호: KFCC11480P).
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    염화칼륨(KCl) 내성을 갖는 칸디다 유틸리스 M 35(Candida utilis M35).
  4. RNA 함량이 높은 고핵산 효모의 제조방법으로,
    모균주인 칸디다속(Candida sp.) 효모에 변이유도제를 처리하는 공정; 및
    효모의 RNase의 활성을 억제하는 금속염이 첨가된 배지에서 생장이 가능한 균체를 선별 및 분리하는 공정을 포함하는 제1항에 따른 칸디다 유틸리스 M35 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    모균주는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)이고, 변이유도제는 EMS(Ethyl methanesulfonate)이며, 금속염은 염화칼륨(KCl)인 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 모균주인 칸디다속(Candida sp.) 효모에 변이유도제를 처리하는 공정;
    효모의 RNase의 활성을 억제하는 금속염이 첨가된 배지에서 생장이 가능한 균체를 선별 및 분리하는 공정; 및
    분리된 균체에 세포벽 분해효소, 핵산 분해효소, AMP 전환효소 및 단백질 분해효소를 처리하여 효소 분해하는 공정을 포함하는 제1항에 따른 칸디다 유틸리스 M35의 추출물 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    모균주인 칸디다속(Candida sp.) 효모는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)이고, 변이유도제는 EMS(Ethyl methanesulfonate)이며, 금속염은 염화칼륨(KCl)인 제조방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    효소 분해하는 공정은 pH 4~8, 온도 50~70℃에서 45~60 시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    효소 분해하는 공정 이후에,
    반응 생성물을 원심분리 및 활성탄 처리를 통해 탈색 및 탈취 후 여과하여 농축하는 공정을 더 포함하는 제조방법.
  12. 삭제
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