KR101150148B1 - 글루타치온 함량이 증대된 신규 효모 변이주, 그 제조 방법 및 용도 - Google Patents
글루타치온 함량이 증대된 신규 효모 변이주, 그 제조 방법 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
칸디다 속(Candida sp.) 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, 기탁번호: KFCC11487P) 및 그 제조 방법을 제공한다. 상기 효모 변이주는 다량의 글루타치온을 포함하며, 우수한 항산화 효과를 가지고, 정미성이 뛰어나 식품 분야 등에서 다양하게 활용 가능하다.
Description
본 발명은 글루타치온 함량이 증대된 효모 변이주에 관한 것이다.
조미료는 오래 전부터 음식을 만드는 주재료인 식품에 첨가하여 음식의 맛을 돋우는 물질로 사용되어 왔다. 그러나 최근 조류 독감, 광우병, 돼지 콜레라, 가축 사료의 항생제, monosodium glutamate(MSG), genetically modified organism(GMO) 등의 안전성 문제로, 소비자의 선택이 천연 지향적, 건강 지향적으로 변화하면서 국내 조미료 산업은 정체기를 맞고 있다. 따라서 조미 식품업체들은 소비자의 선호도에 맞추어 조미 식품 제조에 천연 추출물을 이용하고 있다. 이러한 쳔연 추출물을 이용하여 제조되어 최근 판매되고 있는 소재는 고꾸미 조미 소재라고도 불린다. 여기서 고꾸미란 5가지 기본 맛 외에 깊고 풍부하며 지속적인 맛을 의미하는 일본식 용어이다. 고꾸미 조미 소재는 식물성 단백질, 야채 추출물 및 효모 엑기스 등을 원료로 이용하고, 효소 처리 공정과 maillard 반응 등을 거쳐 고기 향이나 고소한 향 등을 지닌다. 이러한 고꾸미 조미 소재는 기존 우마미 소재보다 농후감을 가지며, 원료인 밀, 대두 등의 단백질이 분해 숙성되거나 원료 단백질이 분해되어 생성되는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1을 제공하고자 한다.
본 발명은 고글루타치온 효모 또는 그 추출물의 제조 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 고글루타치온 효모 추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 칸디다 속(Candida sp .) 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, 기탁번호: KFCC11487P)을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 칸디다속(Candida sp .) 효모에 변이 유도원을 처리하는 단계를 포함하는 고글루타치온 효모의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 칸디다속(Candida sp .) 효모에 변이 유도원을 처리하는 단계; 상기 단계에서 변이 유도원을 처리한 효모 균체 중 배지에서 생장 가능한 균체를 선별하는 단계; 및 상기 단계에서 선별한 효모 균체에 세포벽 분해 효소, 핵산 분해 효소, AMP 전환 효소 및 단백질 분해 효소 중 하나 이상을 처리하여 효소 분해하는 단계를 포함하는 고글루타치온 효모 추출물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 상기 고글루타치온 효모 추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 효모 변이주는 고농도의 글루타치온을 함유하며, 항산화 효과가 뛰어나고, 정미성이 우수하여 이의 배양액, 추출물은 식품 조성물 분야에서 다양하게 활용 가능하다.
도 1은 실험예 1에서 8종 효모들의 생장 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험예 1에서 8종 효모들의 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 2에서 1차 UV 처리한 효모 배양액의 글루타치온 농도를 비교한 그래프이다.
도 4는 실험예 3에서 2차 UV 처리한 효모 배양액의 글루타치온 농도를 비교한 그래프이다.
도 5는 실험예 4에서 효모 추출물의 항산화 활성(DPPH 라디컬 소거능)을 비교한 그래프이다.
도 6은 실험예 5의 효모 추출물과 마늘 및 양파 추출물의 관능 평가 결과를 비교한 그래프이다.
도 2는 실험예 1에서 8종 효모들의 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 2에서 1차 UV 처리한 효모 배양액의 글루타치온 농도를 비교한 그래프이다.
도 4는 실험예 3에서 2차 UV 처리한 효모 배양액의 글루타치온 농도를 비교한 그래프이다.
도 5는 실험예 4에서 효모 추출물의 항산화 활성(DPPH 라디컬 소거능)을 비교한 그래프이다.
도 6은 실험예 5의 효모 추출물과 마늘 및 양파 추출물의 관능 평가 결과를 비교한 그래프이다.
일반적으로 효모는 배양이 용이하여 경제적이며, 이를 자가소화, 산 또는 알칼리 처리, 물리적으로 추출하여 효모 추출물을 제조할 수 있다. 효모 추출물은 위해성이 적은 단세포단백질(single cell protein: SCP)인 효모의 부분적 분해로 생산되는 천연 조성물이다. 이러한 효모 추출물에는 고기 유래의 향 및 정미 성분인 핵산과 단백질이 다량 함유되어 있다. 식품 조성물과 관련하여 지금까지의 효모 추출물에 대한 연구는 주로 핵산과 연관되어 이루어져 왔을 뿐 효모 내 글루타치온의 정미성이나 생리 활성에 대한 연구는 미미한 실정이다.
글루타치온(L-glutamyl-L-cysteinylglycine)은 글루타민산, 글리신, 시스테인의 3개의 아미노산으로 구성되는 트리펩타이드이며, 효모나 동물의 간장, 근육 등의 조직 중에 널리 분포한다. 글루타치온은 환원형(reduced form)으로 미생물과 동식물의 세포 내에 존재하면서 산화적 스트레스(oxidative damage)에 대한 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 간질환 개선, 당뇨병 치료, 항암 활성 등 다양한 약리 효과를 가진다고 알려져 있다. 또한 글루타치온이 식품 조성물에 포함되는 경우 정미 성분으로 작용하여 맛의 지속성을 유지시켜 줄 수 있다.
이에, 본 발명자들은 글루타치온을 다량 함유하는 균주를 개발하여 여러 응용 분야에 이용하고자 한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, 기탁번호: KFCC11487P)을 제공한다. 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 칸디다 속(Candida sp.) 효모 변이주로서, 고농도의 글루타치온(glutathion)을 포함하며 항산화 효과, 우수한 정미성을 가진다. 본 발명의 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, 기탁번호: KFCC11487P)은 칸디다 유틸리스(Candida utilis)(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁번호: KCCM50342)을 출발물질로 할 수 있다. 칸디다 유틸리스(Candida utilis)는 문헌상으로 단백질 생산 효율이 매우 높은 효모 균주이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 100 내지 200 μg-글루타치온/mL을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 110 내지 170 μg-글루타치온/mL을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 건조 균체 중량당 50 내지 100 ㎎-글루타치온/g을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 건조 균체 중량당 60 내지 90 ㎎-글루타치온/g을 포함할 수 있다. 상기 포함된 글루타치온 값은 기존의 야생 균주와 비교하여 2~3배 증가한 수치일 수 있다.
본 명세서에서 효모가 "글루타치온을 포함한다" 내지 "글루타치온을 생산한다"라는 것은 글루타치온을 균체 내에 축적하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 우수한 항산화 효과를 가진다. 이는 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 뛰어난 DPPH 라디컬(radical) 소거능으로 표현될 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 30-90%의 DPPH 라디컬 소거능을 가질 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 36-81%의 DPPH 라디컬 소거능을 가질 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 80% 이상의 DPPH 라디컬 소거능을 가질 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 DPPH 라디컬 50%를 소거함에 필요한 농도인 IC50값은 야생 균주의 그것에 비해 3배 이상 작을 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 뛰어난 정미성을 가진다. 본 명세서에서 상기 "정미성"은 신맛, 단맛, 짠맛, 쓴맛, 감칠맛 등을 가진다는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1, 그 배양액 또는 그 추출물을 식품 조성물 분야에 다양하게 활용하여, 정미성이 뛰어난 식품 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 일측면은 상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 추출물, 배양액 또는 엑기스를 제공한다.
상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)은 2010년 3월 31일 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 미생물 기탁번호 KFCC11487P로 기탁하였다.
본 발명은 고글루타치온 효모의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 제조 방법은 칸디다속(Candida sp .) 효모에 변이 유도원을 처리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서 상기 고글루타치온 효모 제조 방법은 상기 단계 이후, 변이 유도원을 처리한 칸디다속 효모 균체 중 배지에서 생장 가능한 균체를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 고글루타치온 효모 추출물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 추출물의 제조 방법은
칸디다속(Candida sp .) 효모에 변이 유도원을 처리하는 단계;
상기 단계에서 변이 유도원을 처리한 효모 균체 중 배지에서 생장 가능한 균체를 선별하는 단계; 및
상기 단계에서 선별한 효모 균체에 세포벽 분해 효소, 핵산 분해 효소, AMP 전환 효소 및 단백질 분해 효소 중 하나 이상을 처리하여 효소 분해하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 칸디다 속(Candida sp .) 효모는 칸디다 속에 속하는 것으로, 당업자가 용이하게 입수 가능한 모든 효모를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 칸디다 속(Candida sp .) 효모는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁번호: KCCM50342)를 포함한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 변이 유도원은 일반적으로 균주에 변이를 유도할 수 있는 모든 수단을 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 변이 유도원은 화학 물질, 방사선 또는 UV를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 변이 유도원은 UV이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 UV는 5-10분 동안 2회 이상 칸디다속(Candida sp.) 효모에 처리될 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 상기 UV는 칸디다속(Candida sp.) 효모에 5-10분 동안 2회 내지 5회 처리될 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 제조 방법에 의해 제조된 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)(기탁기관: 한국미생물보존센터, 기탁번호: KFCC11487P) 또는 그의 추출물을 포함한다.
본 발명의 일측면에 따른 제조 방법은 칸디다속 효모에 변이 유도원을 처리하는 단계 이후, 상기 효모를 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 제조 방법 중 효모 균체 중 배지에서 생장 가능한 균체를 선별하는 단계에서, 상기 배지는 효모 배양용 배지로 사용될 수 있는 모든 배지, 예를 들어 YM 배지를 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글루코스(glucose), NH4H2PO4 및 L-시스테인(cystein)을 포함하는 배지를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 배지는 총 배지 부피당 3.0-5.0%(v/v)의 이스트 추출물, 1.0-3.0%(v/v)의 글루코스, 0.01-0.1%(v/v)의 NH4H2PO4 및 0.01-0.1%(v/v)의 L-시스테인을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 배지는 글루코스(glucose), 펩톤(peptone), 이스트 추출물(yeast extract) 및 말토스 추출물(maltose extract)을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 배지는 총 배지 부피 당 1.0%(v/v) 글루코스, 0.5%(v/v) 펩톤, 0.3%(v/v) 이스트 추출물 및 0.3%(v/v) 말토스 추출물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 효모 균체 중 배지에서 생장 가능한 균체를 선별하는 단계는 상기 배지에서 생장 가능한 균체를 분리하여 글루타치온 함량이 높은 균체를 선별하는 과정을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 배지는 이스트 추출물, 글루코스, NH4H2PO4 및 L-시스테인을 포함하는 배지일 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 효모 균체를 배양하여 선별하는 단계 이후, 상기 효모 균체를 원심 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 원심 분리는 관형 원심분리기, 연속식 원심분리기, 연속식 고액 분리, 농축 장비 등을 이용하여 시행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에서, 상기 효소 분해하는 단계는 세포벽 분해 효소, 핵산 분해 효소, AMP 전환 효소 및 단백질 분해 효소 중 하나 이상을 처리하는 과정을 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 세포벽 분해 효소의 예로는 글루카나제(glucanase)를 들 수 있고, 핵산 분해 효소의 예로는 포스포디에스트라제(phosphodiestrase)를 들 수 있으며, AMP 전환 효소의 예로는 디아미나제(deaminase)를 들 수 있고, 단백질 분해 효소의 예로는 알칼라제(alcalase), 플레보자임(flavourzyme)을 들 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 상기 효소 분해하는 단계는 pH 4~8, 온도 50~70℃에서 45~60 시간 동안 진행될 수 있다. 상기 조건 및 시간은, 분해 효소에 의한 분해 효율을 고려한 것이다.
본 발명의 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 추출물의 제조 방법은, 효소 분해하는 단계 이후, 반응 생성물을 원심 분리 및 활성탄 처리를 통해 탈색 및 탈취한 후 여과하여 농축하는 단계를 더 포함한다. 이러한 후 처리 단계를 통해, 특유의 효모취를 제거하여 제조된 효모 추출물의 상품 가치를 높이고, 활용 범위를 넓히는 효과가 있다.
본 발명의 일측면에 따른 제조 방법에 의해 제조된 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 100 내지 200 μg-글루타치온/mL을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 110 내지 170 μg-글루타치온/mL을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 건조 균체 중량당 50 내지 100 ㎎-글루타치온/g을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 건조 균체 중량당 60 내지 90 ㎎-글루타치온/g을 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 제조 방법에 의해 제조된 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 우수한 항산화 효과를 가진다. 이는 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물의 뛰어난 DPPH 라디컬(radical) 소거능으로 표현될 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 1-10 mg/ml 농도 범위에서 30-90%의 DPPH 라디컬 소거능을 가질 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 1-10 mg/ml 농도 범위에서 36-81%의 DPPH 라디컬 소거능을 가질 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물은 1-10 mg/ml 농도 범위에서 80% 이상의 DPPH 라디컬 소거능을 가질 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모 또는 고글루타치온 효모 추출물의 DPPH 라디컬 50%를 소거함에 필요한 농도인 IC50값은 야생 균주 또는 그의 추출물에 비해 3배 이상 작을 수 있다.
본 발명은 상기 고글루타치온 효모를 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에서, 상기 고글루타치온 효모의 배양액 또는 엑기스를 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 고글루타치온 효모 추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에서, 상기 식품 조성물은 건강 식품 조성물일 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 상기 식품 조성물은 식품 첨가물일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 상기 식품 조성물은 조미료 또는 생균제제 등으로 사용될 수 있으며, 그 외 다양한 식품 첨가물의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 일측면에서 상기 조성물은, 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 물성 개선을 위하여 향료, 색소, 살균제, 산화 방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 무기염류, 유화제 및 합성 고분자 물질 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 그 외에도, 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당 및 해초 엑기스 등의 보조 성분을 더 포함할 수도 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용 목적에 따라서 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 그 첨가량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 성분들의 첨가량은, 조성물 전체 중량을 기준으로, 0.01~5 중량%, 보다 구체적으로는 0.01~3 중량% 범위일 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예 1] 효모 균주의 선별
(1) 효모 균주 준비
상업용 시판 균주 및 자연 발효물에서 분리한 균주 등 68종의 효모 균주를 준비하였다. YM 배지(broth)에 상기 준비한 효모 균주를 각각 접종한 다음 30℃ 진탕 배양기에서 30시간 배양하여 얻은 배양액을 멸균수로 희석하여 600 nm에서 흡광도를 측정한 후 동일하게 보정하였다. 배양액은 4000 rpm에서 5분 동안 원심 분리 후 상등액을 제거하고, 멸균수를 이용하여 3회 반복하여 세척한 다음, 침전물(yeast cream)만 회수하여 자가소화에 이용하였다. 10%(w/v) 침전물을 40 ℃ 진탕 배양기(shaking incubator)에서 48시간 동안 150 rpm에서 진탕하여 침전물(yeast cream) 현탁액(10%, w/v)을 제조하였다. 이후 100℃에서 5분간 살균한 다음, 4000 rpm에서 5분간 원심 분리 하여 상등액을 회수하였다.
(2) 효모 균주 선별을 위한 관능 평가
상기에서 회수한 상등액으로 효모 균주를 선별하기 위한 관능 검사를 수행하였다. 그 결과 사카로미세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae) 3종, 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 4종 및 지고사카로미세스 루시(Zygosaccharomyces rouxii) 1종 등 모두 8종의 효모가 정미성이 우수한 균주로 선별되었다. 이의 목록은 아래 표 1과 같다.
| 명명 | 효모 균주 |
| SEM-Y4 | 사카로미세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae) Y4 |
| SEM-Y5 | 사카로미세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae) Y5 |
| SEM-Y6 | 사카로미세스 세레비제(Saccharomyces cerevisae) Y6 |
| SEM-Y8 | 칸디다 유틸리스(Candida utilis) Y8 |
| SEM-Y9 | 칸디다 유틸리스(Candida utilis) Y9 |
| SEM-Y10 | 칸디다 유틸리스(Candida utilis) Y10 |
| SEM-Y11 | 칸디다 유틸리스(Candida utilis) Y11 |
| SEM-Y12 | 지고사카로미세스 루시(Zygosaccharomyces rouxii) |
(3) 효모 균주 선별을 위한 생육 특성 분석
효모의 생육 특성을 분석하기 위해 YM 배지에 상기 8종 균주를 접종한 다음 30℃ 진탕 배양기에서 30시간 동안 배양하였다. 이후 각 균주의 성장 정도는 600 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하여 그 결과를 도 1에 나타내었고, 배양 시간에 따른 pH 변화는 pH 미터(meter)를 이용하여 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 1에서 볼 수 있듯이, 균체 증식은 배양 12시간까지 대수 증식기로 성장하였으며, 배양 12시간 이후 정지기에 다다랐다. 특히, 칸디다 유틸리스(Candida utilis)의 일종인 SEM-Y11은 전반적으로 낮은 증식능을 나타내었고, 배양 24시간 이후에는 균체 증식이 감소하는 경향을 보였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 배양 시간에 따른 pH 변화는 SEM-Y6(Saccharomyces cerevisiae)을 제외한 모든 균주에서 배양 12시간까지 감소하다가, 이후 일정한 pH를 유지하는 것으로 나타났다. 이는 같은 속의 효모일지라도 그 종류에 따라 생육 특성이 다르게 나타남을 보여준다.
칸디다 유틸리스(Candida utilis)는 단백질 생산 효율이 가장 좋은 것으로 알려진 효모 균주이다. 그리고 4종의 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 중 SEM-Y8이 가장 좋은 균체 성장을 나타냈다. 이를 토대로, 본 발명의 사용 균주로써 칸디다 유틸리스(Candida utilis)인 SEM-Y8 균주를 선택하였다.
[실험예 2] 고글루타치온 생산용 균주 개량
(1) 1차 UV 처리
SEM-Y8 균주를 YM 배지에 접종하고 30℃에서 24시간 진탕 배양한 종균 배양액을 배지 부피에 대해 2%(v/v)가 되도록 YM 배지에 접종하고, 다시 24시간 진탕 배양 하였다. 균체가 포함된 6 mL의 배양액을 원심 분리 하여 회수하고 생리식염수 6 mL에 현탁 시킨 후 페트리-디쉬(petri-dish)에 옮겨 UV 램프(40 Watt)로부터 30 cm의 거리에서 6분 동안 UV를 조사하였다. 조사한 균액을 30 ug/mL의 소듐 아자이드(sodium azide)가 첨가된 YM 배지에 2%(v/v) 농도가 되도록 접종하였다. 25℃에서 2일간 진탕 배양한 다음 YM 아가(agar)에 도말하여 균주의 생육 유무를 확인하였다. 이 때 균주의 사멸 정도를 표준 곡선으로 계산한 결과, 초기 균체량 4.6X108 CFU/mL에서 6분간 UV 처리시 1.1X103 CFU/mL까지 감소함을 확인할 수 있었다.
따라서 SEM-Y8 균주를 108-109 CFU/mL이 되도록 배양한 후, 약 7분간 UV 처리하여 plate상에서 생존한 10종의 효모 균주만을 선택하여 YM 배지에서 배양하였다.
(2) 글루타치온 농도 분석
상기 효모 균주 배양액의 글루타치온 농도를 알록산 시약법(Alloxan reagent method)을 사용하여 분석하였다. 즉, 배양액 1 mL을 0.25 M 인산염 버퍼(phosphate buffer)(pH 7.6) 3.5 mL에 녹인 후 0.1 M 글라이신 용액(glycine solution) 0.5 mL을 가하였다. 배양액 혼합액에 0.1% 알록산 시약(Alloxan reagent)(0.1 M HCl에 용해) 1.0 mL을 가한 후 알루미늄 호일(aluminum foil)을 이용하여 빛을 차단하고 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응액의 흡광도는 305 nm에서 측정하였고, 0-200 μM의 글루타치온을 이용하여 검량선을 구하였다.
생산된 글루타치온 농도를 비교하여 도 3에 나타내었다. 도 3에서 볼 수 있듯이, 상기 10종의 효모 균주 중 SY8-M2 균주가 69.7 ㎍/mL의 글루타치온을 생산하여, SEM-Y8(54.8 ㎍/mL)에 비해 1.3배 향상된 글루타치온 생산능을 나타냈다.
(3) 2차 UV 처리
상기 SY8-M2 균주에 2차 UV 처리를 하여 SEM-Y8과 SY8-M2에 비해 각각 2.0배 및 1.6배 증가한 글루타치온 생산이 가능한 SY8-M2-1(113.8 ug/mL)의 개량 효모 균주를 얻었다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 획득한 효모 변이주(칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1))는 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 KFCC11487P의 번호로 기탁하였다.
[실험예 3] 배지 조성에 따른 글루타치온 생산능 비교
배지 조성에 따른 글루타치온 생성능을 비교하고자, 효모 배양용 기본 배지인 YM 배지(1.0% 글루코스(glucose), 0.5% 펩톤(peptone), 0.3% 이스트 추출물(yeast extract), 0.3% 말토스 추출물(maltose extract)) 및 선택 배지(4.0% 이스트 추출물(yeast extract), 1.5% 글루코스(glucose), 0.04% NH4H2PO4, 0.04% L-시스테인(cystein))에 SY8-M2-1 균주를 1% (v/v)의 농도가 되도록 접종하여 30℃, 400 rpm, pH 5.5에서 배양하였다. 각 배지에 따른 글루타치온 생산 농도를 비교한 결과는 아래 표 2에 나타난다.
| YM 배지 | 선택 배지 | |
| 글루타치온 (ug/mL) | 69.7 | 170.7 |
| 글루타치온/건조 균체 중량 (mg/g) | 56.7 | 86.4 |
| 글루타치온 생산 속도 (mg/g/h) | 1.8 | 2.7 |
배지 종류에 따라 생산된 글루타치온 농도는 YM 배지 69.7 ㎍/mL, 선택 배지 170.7 ㎍/mL로, 선택 배지에서 2.5배 증가함을 보였다. 건조 균체 중량 대비 글루타치온 농도는 YM 배지 56.7 ㎎/g, 선택 배지 86.4 ㎎/g으로, 선택 배지에서 1.5배 향상됨을 보였다. 따라서 4.0% 이스트 추출물, 1.5% 글루코즈, 0.04% NH4H2PO4, 0.04% L-시스테인의 배지 조성을 갖는 선택 배지를 사용하는 경우 글루타치온 생산능이 보다 우수한 효모를 얻을 수 있다.
[실시예] 효모 추출물의 제조
SEM-Y8, SY8-M2 및 SY8-M2-1 효모 변이주 배양액을 연속식 원심 분리기로 1차 원심 분리하여 효모 슬러리를 제조하였다. 1차 원심 분리된 효모 슬러리를 수세하여 효모취 및 배양 배지를 씻어낸 후, 살균 처리하였다. 살균 처리를 통해 효모의 세포벽이 연화하게 된다. 이후 세포벽 분해 효소, 핵산 분해 효소, 핵산 전이 효소, 엑소형 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시켰다. 이 때 효소 반응은 pH 4~8, 온도 50~70℃에서 48 시간 이상 진행되었다. 효소 반응이 완료되면, 활성탄 처리를 통해 특유의 효모취를 제거하고, 농축하여 각각의 효모 추출물을 제조하였다.
[실험예 4] DPPH 라디컬(radical) 소거능 평가
세포 내 주요 항산화 물질로 알려져 있는 글루타치온의 라디컬 소거능을 효모 변이 정도에 따라 평가하고자, 상기 실시예에서 제조한 SEM-Y8, SY8-M2 및 SY8-M2-1의 추출물 2 mL에 0.1 mM 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, 95% 에탄올에 제조) 2 mL을 첨가하여 암실에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 5와 같다.
도 5에서 알 수 있듯이, 1-10 mg/mL의 농도 범위에서 SEM-Y8, SY8-M2, SY8-M2-1 추출물은 각각 14-61%, 21-75%, 36-81%의 라디컬 소거효과를 보였다. DPPH 라디컬의 50%를 소거함에 필요한 농도인 IC50값은 와일드 타입(wild type)인 SEM-Y8 추출물은 3.8 mg/mL, 1차 변이종인 SY8-M2 추출물은 1.5 mg/mL, 2차 변이종 SY8-M2-1 추출물은 1.2 mg/mL을 보임으로써 변이에 의해 최대 3.2배 활성이 증가함을 확인할 수 있었다.
[실험예 5] 관능 평가
상기 SY8-M2-1 추출물에 대한 관능 검사를 치킨 콘소메 스프를 기본 베이스로 수행하였다. 훈련된 관능 검사원을 대상으로 SY8-M2-1 추출물과 양파 및 마늘 추출물을 각각 배합한 치킨 콘소매 혼합물이 최종 농도 5.3%가 되도록 물에 용해한 검사물을 검사원에게 제시하였다. 각 검사물에 대하여 우마미(감칠맛), 쓴맛(이미이취), 맛의 지속성(고꾸미), 치킨 맛 증가도, 부드럽고 깊은 맛 및 전체적인 기호도에 대해 9점 평가법(약함 1, 강함 9)을 행하였다. 각 용기에는 검사물에 대한 편견을 없애기 위하여 난수표에서 추출한 세 자리 숫자를 표기하였으며, 검사물의 관능적 특성 강도는 7점 항목 척도를 사용하였고, 검사물 제시는 무작위로 하였다. 또한 평가 사이에 입을 헹굴 수 있도록 정수기를 통과시킨 상온(27±2℃)의 물을 함께 제시하였다. 향미 특성 평가를 위한 검사물은 색의 차이에서 오는 편견을 배제시키기 위하여 개인 검사대의 어두운 적색등 밑에 제시하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 볼 수 있듯이, SY8-M2-1 추출물은 양파와 마늘 추출물보다 우수한 우마미와 부드럽고 깊은 맛을 가짐을 확인할 수 있었다.
Claims (12)
- 총 배지 부피당 3 내지 5 %(v/v)의 이스트 추출물, 1 내지 3 %(v/v)의 글루코스, 0.01 내지 0.1%(v/v)의 NH4H2PO4 및 0.01 내지 0.1%(v/v)의 L-시스테인을 포함하는 배지에서 배양하여, 건조 균체 중량(g) 당 50 내지 100 ㎎의 글루타치온(glutathione)을 포함하는 칸디다 속(Candida sp.) 효모 변이주인 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, 기탁번호: KFCC11487P).
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1은 항산화 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1. - 고글루타치온 효모 제조 방법으로서,
칸디다속(Candida sp.) 효모에 변이 유도원을 처리하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, 기탁번호: KFCC11487P)의 제조 방법. - 제 4 항에 있어서,
상기 칸디다속 효모는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)이고, 상기 변이 유도원은 UV인 것을 특징으로 하는 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 제조 방법. - 삭제
- 고글루타치온 효모 추출물의 제조 방법으로서,
칸디다속(Candida sp.) 효모에 변이 유도원을 처리하는 단계;
상기 단계에서 변이 유도원을 처리한 효모 균체 중 배지에서 생장 가능한 효모 균체를 선별하는 단계; 및
상기 단계에서 선별한 효모 균체에 세포벽 분해 효소, 핵산 분해 효소, AMP 전환 효소 및 단백질 분해 효소 중 하나 이상을 처리하여 효소 분해하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1) 추출물의 제조 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 칸디다속 효모는 칸디다 유틸리스(Candida utilis)이고, 상기 변이 유도원은 UV인 것을 특징으로 하는 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1 추출물의 제조 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 배지는 이스트 추출물(yeast extract), 글루코스(glucose), NH4H2PO4 및 L-시스테인(cystein)을 포함하는 배지인 것을 특징으로 하는 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1 추출물의 제조 방법. - 삭제
- 제 7 항에 있어서,
상기 제조 방법에 의해 제조된 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1 효모의 추출물은 30-90%의 라디컬(radical) 소거 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1 추출물의 제조 방법. - 제 7 항 내지 제 9 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 추출물을 포함하는 식품 조성물.
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