KR100562385B1

KR100562385B1 - 플라보자임에 의한 신경전달물질인 Cyclo-His-Pro 함유하는 효모 가수분해물 제조방법

Info

Publication number: KR100562385B1
Application number: KR1020040042439A
Authority: KR
Inventors: 서형주
Original assignee: 서형주; (주)새롬바이오
Priority date: 2004-06-10
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2006-03-20
Also published as: KR20050117196A

Abstract

본 발명은 신경전달물질인 CHP(cyclo-His-Pro)가 함유된 효모 가수분해물 제조 및 CHP의 함량을 높이는 방법에 관한 것으로, 플라보자임(flavourzyme)을 가수분해 효소로 사용하여 효모 가수분해물을 제조하는 방법을 제공하는 본원 발명에 의하면 플라보자임에 의한 효모 가수분해물이 다른 효소 가수분해물에 비해 CHP의 함량이 월등하였으며, 효모 가수분해물에 함유된 CHP의 함량을 높이기 위해 사용된 방법인 활성탄과 한외여과를 각각 단독 또는 병행사용하여 CHP의 함량이 약 10배에서 85배까지 증가 시키는 효과가 있었다.

효모, 플라보자임, CHP (cyclo-His-Pro), 한외여과, 활성탄

Description

플라보자임에 의한 신경전달물질인 Cyclo-His-Pro 함유하는 효모 가수분해물 제조방법{Method for production of yeast hydrolysate containing cyclo-His-Pro as neurotransmitter with flavourzyme}

도 1은 효모가수분해물 제조공정을 나타낸 그림이다.

식품 내에서 펩타이드는 식품의 영양적, 관능적, 건강 기능성 특성에 영향을 끼치는 중요한 역할을 한다. 살아있는 생물체내에 존재하는 많은 펩타이드는 여러 생화학적 활성을 지니고 있는데, 일부 예를들면 다양한 펩타이드 호르몬, 신경전달물질(neurotransmitter), interleukins , 세포성장인자들(cell growth factors), 그리고 박테리오신들이 있다. 많은 펩타이드는 특히 발효 과정 중에 식품 내에서 형성되며 이런 펩타이드의 일부는 다양한 생리학적 활성을 나타낸다. 생리활성 펩타이드는 1970년대 이래로 nutraceutical로서의 이용 가능성이 제시되어 왔으며 opioid agonist 또 antagonist, angiotensin Ⅰ-converting enzyme 저해, 면역조절, 항균, 항혈전, 지질산화억제, mineral 결합 활성 등의 생리활성이 있다고 알려져 있다. 즉, Casein 및 lactalbumin 등의 우유 단백질 유래 펩타이드들이 phagocytosis를 증진시키거나 lymphocyte의 분화를 조절하는 기능을 나타낸다고 보고되고 있다. 또 대두 단백질로부터 면역조절 펩타이드가 생성되었으며 glycinin 단백질의 효소적 가수분해물로부터 분리된 HCQRPR 및 QRPR등의 펩타이드가 macrophage의 phagocytosis를 활성화시킬 뿐 아니라 세균감염에 대한 방어작용 및 TNF 분비를 촉진시키는 면역조절 활성을 나타내었다는 등의 연구 결과들이 보고된 바 있다. 단백질 유래 활성 펩타이는 주로 콩과 우유 단백인 카제인 유래 단백질이 많이 사용되어왔으나 최근에는 대량 생산이 가능한 효모에 관심을 가지고 있다. 효모는 양조, 제빵산업 등 식품분야에서 오래전부터 여러 가지 유용물질 생산의 원료로 사용되고 있으며, 균체내에 50%내외의 단백질, 지질, RNA 등의 핵산, 각종 비타민 및 미네랄을 함유하고 있다. 효모 추출물은 가공식품 제조시 식품소재에 풍미를 자유롭게 부여하여 기호성을 증가시키는 목적으로 주로 많이 사용되고 있으나 최근 들어 효모의 여러생리활성 등이 보고되고 있다. 특히 효모에 의한 월경전증후군 완화효과, 항스트레스 효과 등을 보고하고 있으며 이러한 효과는 효모의 발효과정 또는 가수분해과정에서 생성된 신경전달물질에 기인하는 것으로 추정하고 있다. CHP 역시 신경전달물질로서 다양한 생리활성을 가지고 있으나, 식품속에는 사람의 혈액에서 발견되는 양보다 많은 양이 존재함이 보고되어 있다.

일반식품내의 CHP 함량을 측정한 결과, 우유에 6 pmol/g부터 건조된 새우에 6.58 nmol/g의 함량을 보고하였으며, 이는 사람의 혈청에서 발견되는 CHP 함량의 5-1500배에 달하는 높은 농도를 보고하였다. 그러나 지금까지 식품속에 함유된 단백질을 가수분해하여 신경전달물질인 CHP를 제조하고자 하는 시도는 없었으며, 특히 식품생산에 널리 사용되는 효모의 가수분해물에 CHP를 함유시키는 제조방법은 전혀 없었다.

식품속에는 사람의 혈액에서 발견되는 양보다 많은 양의 CHP가 존재함이 보고되어 있다. 그러나 존재하는 양이 nmol 또는 pmol 수준으로 상당히 소량 존재하고 있으므로 CHP가 지니는 생리활성을 이용하기위한 소재로 활용하기에는 문제가 있다. 따라서 본 연구에서는 기존에 보고된 CHP 양보다 더 많은 양을 함유하는 가수분해물을 제조하기 위해 효모를 선택하였으며, 효모 가수분해에 사용되는 효소중에 플라보자임이 가장 우수한 것을 입증하여 이를 효모 가수분해물 제조에 사용하였다. 또한 플라보자임에 의해 제조된 효모 가수분해물의 CHP 함량을 높이고자 활성탄과 한외여과를 단독 또는 병합 사용함에 따라 CHP의 함량이 적게는 10에서 많게는 85배까지 증가시키게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 가수분해 효소를 이용하여 CHP가 가장 많이 함유되는 효모가수분해물을 제조하여 정제과정을 거쳐 CHP의 함량을 높이는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효모 현탁액에 가수분해효소를 첨가하여 효소반응시킴으로써 신경전달물질인 CHP를 함유하는 효모 가수분해물을 제조하는 방법에 있어서, 가수분해효소로 플라보자임을 사용하여 제조한 가수분해물에 CHP 함유량을 높이는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.

CHP가 함유된 가수분해물 제조를 위해 가수분해물에 함유 되어있는 CHP의 함량을 측정한 결과, 효모 가수분해물이 602 μg/g, corn gluten과 새우 가수분해물이 23.3과 12.3 μg/g로 비교적 높은 함량을 보였다. 단백분해효소를 이용하여 제조한 효모 가수분해물중에 플라보자임(아스퍼질러스 오리제에서 유래된 단백분해효소)에 의한 가수분해물이 가장 높은 CHP 함량인 674 μg/g을 함유하고 있었으며, 회수율은 16.2% 였다. 효모가수분해물에 함유된 CHP는 95% 알콜로 추출시 0.10% 였으며, 11.4%의 회수율을 보였다. 추출에 사용된 알콜의 함유량이 줄어들수록 수율은 증가하였으나 CHP의 함량은 감소되는 경향을 보였다. CHP의 함량을 높이기 위해 산처리, 활성탄 처리 및 한외 여과 처리를 실시한 결과, 수율은 한외여과가 67.4%, 산처리가 51.7%로 비교적 높은 수율을 보였으며, CHP 함량은 한외여과가 1.2%로 가장 높은 함량을 보였으며, 활성탄 처리시 0.66%로 비교적 높은 CHP의 함량을 보였다. 이상의 결과에 의해 CHP가 함유된 효모 가수분해물 제조공정은 0.8%의 효모 현탁액을 만든 후 이에 플라보자임(flavourzyme)을 0.5-1.5% 첨가하여 pH를 6.0-7.0으로 조정 후 50℃에서 48-72시간 가수분해하여 얻은 효모 가수분해물을 여과 또는 원심분리에 의하여 상징액을 회수하였다. 회수한 상징액을 한외여과하여 얻은 가수분해물을 건조하거나 또는 활성탄 처리 후 건조하여 CHP 함유 효모가수분해물을 제조하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 작용을 실시의 예를들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

하기의 실시예는 가수분해물에서의 CHP함량을 측정하여 가수분해물 소재를 선정, 효모 가수분해물 효소 선정, 효모 가수분해물에서의 CHP 함량 증대방법을 선정하는 단계로 구성된다.

하기의 실시예에서 사용된 재료 Cyclo (His-Pro)는 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 CHP분석에 표준물질로 사용하였다. 돈육, 새우, 바지락, 오징어, 게 및 소고기 가수분해물은 해마식품에서, 효모가수분해물은 (주) 뉴로타이드에서 각각 구입하여 CHP의 함량을 측정하는 시료로 사용하였으며, 효모 가수분해물 제조에 사용한 단백분해효소인 뉴트라제(neutrase), 알카라제(alcalase), 플라보자임(flavourzyme), 프로타맥스(protamax)는 NovoKorea에서, 피신(ficin)은 Sigma Chemical Co.에서 세균단백분해효소(bacterial protease)는 (주) 태평양화학에서 각각 구입하여 사용하였다. 그 외에 분석에 필요한 시약은 일급이상의 시약을 사용하였다.

CHP는 HPLC를 이용하여 다음과 같은 조건에서 분석하였다. Hamilton PRP-1 RP 10 μm (250 mm × 4.1 mm ID, Hamilton Co.) column과 pre-column Hamilton PRP 10 10 μm (25 mm × 1.3 mm ID)에 시료 20 μl 주입하여 유속 0.5 ml/min으로 elutent (acenitrile : 0.75 g/l 1-heptanesulfonic acid in 0.004 M aqueous TFA = 10:90 v/v)로 용출하여 206 nm 파장을 가지는 UV 검출기를 이용하여 시료내에 CHP 함량을 측정하였다.

효모 가수분해물의 제조는 압착효모 8 g을 증류수 100 ml에 현탁하여 pH를 6-8로 조정한 후 단백분해효소를 0.05-1.0%를 첨가하여 50℃에서 48-72시간 동안 가수분해하여 원심분리 후 상징액을 건조하여 효모 가수분해물로 사용하였다. 효모 가수분해물에 함유된 CHP의 함량을 높이고자 산처리, 활성탄처리 및 한외여과를 실시하였다. 산처리는 5% 효모 가수분해물 용액에 구연산을 가하여 pH를 3.5로 조정 후 30분간 방치하여 생긴 침전을 여과하여 제거한 다음 NaOH로 pH를 7.0으로 중화 처리하여 건조하였다. 활성탄 처리는 5% 효모 가수분해물 용액 100 ml에 활성탄 1g을 가하여 30분간 진탕한 후 여과하여 여액을 제거하여 얻은 활성탄에 0.3% 암모니아수를 70 ml를 가하여 30분간 진탕 후에 여과하여 얻은 여액의 pH를 7.0으로 조정하여 건조하였다. 한외여과 처리는 5% 효모 가수분해물 용액을 한외여과막 (PM -10)을 이용하여 분자량 10000이하되는 여과액을 모아 이를 건조하였다.

실시예 1 : CHP함유 가수분해물제조 소재의 선정

상업적으로 사용되는 가수분해물을 구입하여 가수분해물에 함유 되어있는 CHP의 함량을 측정한 결과 (표 1), 효모 가수분해물이 602 μg/g로 가장 높은 함량을 보이고 있으며, corn gluten과 새우 가수분해물이 23.3과 12.3 μg/g로 비교적 높은 함량을 보이고 있다. 이는 Hilton 등 (1992)이 일반식품중에 건조 새우의 경우 6576 pmol/g과 fish sauce에서 5209 pmol/g보고한 것 보다 높은 함량을 보이고 있으며, 새우가수분해물의 경우 건조새우에 비해 6배의 높은 함량을 보였으며, 효모 가수분해물은 건조새우보다 300배정도의 높은 함량을 보여, CHP 함유된 기능성 소재로의 가능성을 보였다.

가수분해물	CHP 함량 (μg/g)	가수분해물	CHP 함량 (μg/g)
돈육	2.24	소고기	-
바지락	-	오징어	1.82
게	-	옥수수단백	23.3
새우	12.3	효모	602.3

실시예 2 : 효모 가수분해물제조에 적합한 가수분해 효소 선정

다른 가수분해물에 비해 효모 가수분해물이 높은 CHP의 함량을 보임에 따라 상업적으로 사용되는 단백분해효소를 각각 달리하여 만든 효모 가수분해물의 CHP 함량을 측정한 결과 (표 2), 효모 가수분해물의 경우 플라보자임이 가장 높은 CHP 함량인 674 μg/g을 함유하고 있으나 회수율은 16.2%를 보였으며, 피신이 가장 높은 회수율인 33.8%와 468 μg/g의 CHP 함량을 보였다. 단백분해효소 첨가한 가수분해물에 비해 비교적 회수율이 낮은 효모 자가분해효소 (autolysis)의 경우 CHP의 함량도 603 μg/g으로 플라보자임 가수분해물 다음으로 높은 CHP 함량을 보였다.

가수분해물	수율(%)	CHP 함량 (μg/g)	가수분해물	수율(%)	CHP 함량 (μg/g)
뉴트라제 (neutrase)	21.4	502	플라보자임 (flvourzyme)	16.2	674
알카라제 (alcalase)	21.0	286	프로타맥스 (protamax)	27.5	430
세균단백분해효소 (bacterial protease)	28.0	349	자가분해 (autolysis)	25.5	603
피신 (ficine)	33.8	468

실시예 3 : 알콜함량에 의한 CHP함유량 증가 효과

효모 가수분해물에 들어있는 CHP는 histidine과 proline이 cyclization되어있는 물질로 어느정도 비극성을 가지고 있다. 따라서 알콜에 용해시 고분자 단백질은 잘 녹지 않고 저분자 단백질만이 알콜에 잘 녹는 특성을 이용하여 각 알콜 농도에 다른 CHP의 추출량을 측정한 결과 (표 4), 95% 알콜로 추출시 11.4%의 회수율을 보이며 이대의 CHP함량은 0.10%로 효모 가수분해물 보다 60% 증가된 함량을 보인 반면, 알콜의 함유량이 줄어들수록 수율은 증가를 하나 CHP의 함량은 감소되는 경향을 보였다.

알콜농도	수율	CHP 함량
95%	11.4%	0.10%
80%	76.8%	0.06%
60%	85.0%	0.01%

실시예 4 : CHP함유량 높이기 위한 처리공정 효과

효모 가수분해물의 CHP 함량은 0.06%로 CHP가 지니는 생리활성을 이용하기위한 기능성 소재로 활용하기 위해서는 CHP의 함량이 낮으므로 CHP의 함량을 상승시키고자 정제를 실시하였다. CHP의 함량을 높이기 위해 산처리, 활성탄 처리 및 한외 여과 처리를 실시하여 얻은 건조물의 CHP 함량을 측정한 결과 (표 4), 수율은 한외여과가 67.4%, 산처리가 51.7%로 비교적 높은 수율을 보였으며, CHP 함량은 한외여과가 1.2%로 가장 높은 함량을 보였으며, 활성탄 처리시 0.66%로 비교적 높은 CHP의 함량을 보였다. CHP의 함량과 수율도 가장 높은 한외여과가 가장 바람직한 정제과정이었다. 각각의 처리공정중 한외여과 처리와 활성탄 처리공정을 병행 사용시 수율은 4.5%로 급격히 감소하였으나, CHP의 함유량은 5.13%로 효모가수분해물 초기의 함유량인 0.06%보다 약 85배정도 증가하는 효과를 보였다.

처리공정	수율 (%)	CHP함량 (%)
산처리	51.7	0.12
활성탄처리	13.9	0.66
한외여과	67.4	1.20
한외여과/활성탄처리	4.5	5.13

이상의 결과에 의해 CHP가 함유된 효모 가수분해물 제조공정은 도 1과 같다. 8%의 효모 현탁액을 만든 후 이에 플라보자임을 0.5-1.5% 첨가하여 pH를 6.0-7.0으로 조정 후 50℃에서 48-72시간 가수분해하여 얻은 효모 가수분해물을 여과 또는 원심분리에 의하여 상징액을 회수하였다. 회수한 상징액을 한외여과하여 얻은 가수분해물을 건조하거나 또는 활성탄 처리 후 건조하여 CHP 함유 효모가수분해물을 제조하였다.

이상 상기에서 살펴본 바와같이 플라보자임을 가수분해 효소로 사용하여 신경전달물질인 CHP를 함유하는 효모를 제조하고, 효모 가수분해물내에 함유된 CHP의 함유량을 증대시키는 본 발명은 기존의 식품내에 함유된 CHP 함유량보다 월등히 높은 함유하는 효모 가수분해물을 제조하였을뿐만 아니라, 정제과정을 거칠 경우 정제전에 비해 10에서 최고 85배까지 CHP의 함유량을 높였으므 이를 식품소재로 활용시 매우 유용할 것이다.

Claims

효모 현탁액에 플라보자임을 첨가하여 가수분해시키는 것을 특징으로 하는 사이클로-히스티딘-프롤린을 함유하는 효모 가수분해물의 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 효모 현탁액에 플라보자임을 0.5∼1.5중량% 첨가한 후, 50℃에서 pH를 6.0∼7.0으로 조정하고 48∼72시간 동안 가수분해시키는 것을 특징으로 하는 사이클로-히스티딘-프롤린을 함유하는 효모 가수분해물의 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 가수분해 후 얻어진 효모 가수분해물을 여과 또는 원심분리하여 상징액을 회수하고,

상기 상징액을 (1) 한외여과 한 후 건조하거나, (2) 활성탄 처리 후 건조하거나, (3) 상기 (1) 및 (2) 단계를 병행하는 것을 특징으로 하는 사이클로-히스티딘-프롤린을 함유하는 효모 가수분해물의 제조방법.