KR20120049047A - 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증 조성물 및 굴 단백질 가수분해물의 제조방법과 상기 가수분해물로부터 펩티드를 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면 굴 단백질 가수분해물, 상기 가수분해물로부터 분리, 정제된 항염 펩티드 및 상기 가수분해물을 포함하는 조성물은 항염증 활성을 가지므로 기능성 의약품 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Description

굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물 {Antiinflammatory composition comprising enzymatic hydrolysates of Crassostrea gigas}
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증 조성물 및 굴 단백질 가수분해물의 제조방법과 상기 가수분해물로부터 펩티드를 분리 정제하는 방법 및 항염증 효능을 갖는 굴 단백질 유래 펩티드의 1차 구조 서열에 관한 것이다.
해양생물은 종의 다양성과 더불어 서식환경의 특이성이라는 요인에 의하여 기존의 육상생물이 보유?생산할 수 없는 화학물질 및 생체 분자들을 함유하고 있으며, 이들의 생합성?분해에 관여하는 특이한 신종 효소와 보조인자들도 존재하고있어서 신약물질과 새로운 생리 기능성 물질의 소재로서 관심이 집중되고 있다. 더욱이 육상생물을 대상으로 활발히 진행되어 왔던 선도물질의 탐색 및 개발이 한계에 이르기 시작함에 따라 자연히 해양생물로 관심대상이 전환되었다. 미국, 일본, 유럽 등과 같은 해양 선진국들에 의해서 현재까지 밝혀진 해양생물 유래의 항암성, 항산화성, 항곰팡이성, 항균성, 항바이러스성 및 항염증성을 나타내는 약리활성 물질들이 이미 다수 보고되어 있다. 또한 해양자원으로부터 식량자원의 생산에 관한 연구의 중요성도 점점 증가하고 있다.
일반적으로, 패류(貝類)는 삼면이 바다로 둘러싸인 우리나라의 지역특성에 의해 연안지대에 다양한 종류가 서식하여 예로부터 중요한 식품자원으로 이용되어 온 것으로서, 1990년대 이후부터 패류의 인공양식이 보편화되면서 양식 생산의 비중이 90%를 상회하게 되고 그 생산량도 매년 증가함에 따라 어가의 소득증대 및 어촌지역의 고용창출효과 측면 외에도 보다 위생적이고 풍미가 좋은 원료를 안정적으로 공급함과 동시에 패류 특유의 풍미와 영양특성을 살린 고부가가치 가공기술이 수산업 발전을 위한 주요 관심대상이 되고 있다.
특히 최근에는 동식물 단백질을 각종 효소를 이용하여 가수분해 시킨 가수분해물을 분리 정제하여 이들의 생리활성 검토에 관한 연구가 진행되고 있다. 이 가수분해물들은 항산화 활성 및 혈압강하 작용이 있다는 것으로 밝혀지면서 피부노화방지 및 고혈압 등의 성인병 예방치료제로서도 이용 가능하다는 결과가 보고되고 있다. 또한, 단백질 가수분해물은 각종 가공식품이나 조미료, 샴푸, 화장품 등 기타 여러 분야에서 필수적으로 이용되고 있다.
그러나 국내에서는 거의 단백질의 산(acid) 가수분해물을 이용하고 있는 실정이며, 단백질을 산이나 알칼리로 가수분해 할 경우 트립토판(tryptophan), 시스테인(cysteine)과 같은 필수 아미노산이 손실될 뿐만 아니라 리지노알라닌(lysinoalanine)과 같은 독성이 있는 부산물이 생성되어 일본을 비롯한 선진국에서는 단백질의 산가수분해물의 안전성 문제가 대두되고 있다.
염증반응(inflammation)은 생체 또는 조직에 물리적 작용, 화학적 물질, 세균감염 등의 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스타민(histamine), 세로토닌(serotonine), 브라디키닌(bradykinin), 프로스타글란딘(prostagladnins), 히드록실-에이코사테라에노이 산(hydorxyl-eicosatetraenoic acid, HETE) 및 류코트리엔(leukotriene)과 같은 혈관 활성물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 단핵포식세포(mononuclear phagocytes), 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 자연살해세포(NK cell)가 손상부위로 침윤되어 염증을 유발하게 된다.
감염이나 조직손상에 의해 발생하는 적당한 염증은 손상부위가 빠르게 회복 되기 위한 정상적인 반응이다. 그러나 장기간에 걸친 지속적인 염증반응은 손상부위에 대한 회복을 지연시키고 주위 세포에 대한 상해를 동반하므로, 주변조직에 대한 방어력을 떨어뜨려 증세를 더욱 악화시킬 수 있어, 정상적인 염증반응을 유지하기 위한 항염증 제제가 필요한 것이다. 현재 일반적으로 사용되는 대부분의 항염증제는 스테로이드계의 약물이나, 스테로이드계의 약물은 인체의 저항성을 약화시키거나 염증 부위의 조직재생을 지연시키는 부작용을 가지고 있어 대체약물의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 독성과 부작용이 없는 천연물 유래의 항염증제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명에 따른 굴 단백질 가수분해물의 우수한 항염증 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
결국 본 발명의 주된 목적은 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드를 유효성분으로 함유하고, 독성 및 부작용 없이 효과적인 천연 항염증 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 굴 단백질 가수분해물의 제조방법 및 상기 가수분해물로부터 강력한 항염증 효과를 갖는 기능성 펩티드를 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증 조성물 및 굴 단백질 가수분해 가수분해물의 제조방법과 상기 가수분해물로부터 펩티드를 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물을 제공한다.
상기 굴 단백질 가수분해물은 잘게 분쇄한 동결건조 된 굴을 완충액에 용해시킨 후, 상기 용액에 단백질 가수분해 효소를 첨가한 뒤 교반시켜 가수분해 반응을 진행시킨 다음, 열수 중에서 가열하고 이를 필터, 농축 및 건조하여 제조된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 완충액은 인산염 완충액(phosphate buffer) 또는 글리신-염산 완충액(glycine-HCl buffer)이며, 상기 단백질 가수분해 효소는 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 알칼라제(Alcalase) 및 프로타맥스(Protamex)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 가수분해 단계는 pH 1.0 ~ 10.0의 완충액 중에서 반응온도 25 ~ 70℃, 반응시간 6~10시간 동안 가수분해하는 것을 특징으로 하며 바람직하게는 상기 완충액의 pH가 2.0~8.0, 반응온도는 30~60℃ 반응시간 8시간 가열하고 감압증발기로 농축 후 동결건조시키는 것이 좋다.
또한, 상기 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드는 (1) 굴 단백질 가수분해물을 TFF(Tangetial Flow Filtration) 시스템에 의해 분자량별로 분리한 후 각 획분의 생리 활성을 측정하는 단계; (2) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 크로마토그래피법으로 분리하는 단계; (3) 상기 분리된 각 획분의 생리활성을 측정하는 단계; 및 (4) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 정제하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조하며, 상기 (2) 내지 (4) 단계를 반복 실시하여 단일물질로 분리 정제하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (2) 단계에 있어서, 펩티드는 음이온 교환 컬럼(DEAE-Sephacel)이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 분리한 후, GPC 컬럼(HiprepTM 26/60 SepnacrylTM S-100 HR)이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리한 후, 분취용 C18 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피, 두 번의 분석용 C18 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피를 이용한 정제과정을 거쳐 강한 항염증 능력을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 분리 정제한 펩티드를 Edman degradation 방법에 의해 PTH 분석컬럼을 이용하여 아미노산 서열을 분석하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증제 및 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명의 굴 단백질 가수분해물 및 이로부터 분리된 기능성 펩티드는 항염증제와 더불어 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료를 위한 의약품, 건강보조제, 화장료, 식품, 식품 첨가제 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 굴 단백질 가수분해물 및 이로부터 분리된 기능성 펩티드가 의약품으로 이용될 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있는데, 이렇게 이루어진 약학조성물을 권리범위로 포함한다. 또한 상기 약학 조성물을 항염증제로 사용하는 의약적 용도 역시 본 발명의 권리범위에 포함된다.
상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드, 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다. 또한 항염증 조성물을 약제화 하는 경우 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 굴 단백질 가수분해물 및 이로부터 분리된 기능성 펩티드가 화장료로 이용될 경우에는 주름개선 및 미백 기능성 화장품, 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 에센스 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 단백질 가수분해물 및 기능성 펩티드를 포함하여 주름개선 및 미백 원료 또는 통상의 화장료 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합 할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면 굴 단백질 가수분해물, 상기 가수분해물로부터 분리, 정제된 항염증 펩티드 및 상기 가수분해물을 포함하는 조성물은 항염증 활성을 가지므로 기능성 의약품 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 굴 단백질 가수분해물은 천연물 유래의 물질로써 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있다.
도 1은 굴 단백질 가수분해물의 제조 공정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 굴 단백질 가수분해물의 항염증 효과를 나타낸 것이다(1, Flavourzy- me; 2, Neutrase; 3, Protamex; 4, Alcalase; 5, Papain; 6, α-chymotrypsin; 7, Trypsin; 8, Pepsin).
도 3은 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량별 NO 생성 억제율을 나타낸 것이다(>30,000 Da; 10,000 ~ 30,000 Da; 5.000 ~ 10,000 Da; 5,000 Da<).
도 4는 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000 Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리한 것을 나타낸 것이다.
도 5는 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000 Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리한 것을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 굴 단백질 가수분해물(플라보자임)의 분자량 10,000 ~ 30,000 Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 것을 나타낸 것이다.
도 7은 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000 Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 것을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000 Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 분취용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000 Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 분취용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 것을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 분취용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 분획물을 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 분취용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 분획물을 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 것을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12은 본 발명의 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 분취용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 분획물을 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 최종적으로 다시 한 번 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 것을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 굴 단백질 가수분해물(프로타맥스)의 분자량 10,000 ~ 30,000Da에 해당하는 단백질을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 효능이 입증된 분획물을 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 분취용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 분획물을 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 후 효능이 입증된 분획물을 최종적으로 다시 한 번 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피로 분리한 것을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 굴의 단백질 가수분해물의 제조
본 실험에 사용된 굴 시료는 여수 수산시장에서 구입하였고, 가수분해물을 제조하기 위해 -20℃에 저장하여 사용하였다. 잘게 분쇄한 동결건조 된 굴은 0.1M 완충액 (buffer, pH 2.0~8.0)을 굴 : 완충액 = 1 : 50(w/w)의 비율로 용해한 후, 30분간 150rpm에서 교반하면서 30~60℃로 예열한 다음, 단백질 가수분해 효소 : 굴 = 1 : 50 (w/w)의 비율로 단백질 가수분해 효소, 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 알칼라제(Alcalase) 및 프로타맥스(Protamex)을 첨가하여 8시간 동안 180rpm에서 교반하여 30~60℃에서 가수분해한 후, 100℃에서 10분간 가열하여 가수분해 반응을 종료시켰다.
반응이 종료된 액은 와트만 필터 41번(Whatman filter No. 41)을 사용하여 필터한 후 감압증발기로 농축시킨 후, -80℃로 동결건조하여 굴 단백질 가수분해물을 제조하였다. 이때 사용된 효소의 조성 및 반응 조건은 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
단, 상기에서 PB는 인산염 완충액(Phosphate Buffer), GHB는 글리신-염산 완충액(Glycine-HCl Buffer)을 의미한다.
실험예 1. 굴 단백질 가수분해물의 항염증 효과 측정
산화질소(Nitric oxide)는 체내에서 L-아르기닌이 시트룰린을 생성할 때 생성되는 것으로, 과잉 생성 시 우리 몸의 산화를 촉진시키는 자유 라디칼(free radial)로 알려져 있다. 굴 유래 단백질 가수분해물의 항염증 효과는 마크로파지 세포 Raw 264.7에 LPS와 굴의 단백질 가수분해물을 처리하여, 마크로파지 세포 내 산화질소 생성에 미치는 영향을 측정하였다.
즉, 6-well plate에 5×105개의 마크로파지 세포를 접종하고 24시간 뒤에 8종의 굴 유래 단백질 가수분해물(1, Flavourzyme; 2, Neutrase; 3, Protamex; 4, Alcalase; 5, Papain; 6, α-chymotrypsin; 7, Trypsin; 8, Pepsin) 0.5mg/ml와 LPS(Lipopolysaccharide) 1/ml을 처리한 후 37℃, CO2 인큐베이터에 24시간 동안 반응시켰다. 24시간 후, 각 배지 50㎕를 첨가하여 실온에서 10분 방치한 다음 여기에 N-(1-나프틸) 에틸렌다이아민 다이하이드로클로라이드 (N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride) 50㎕를 첨가하고 실온에서 15분 방치하여 550nm에서 O.D. 값을 측정하였다.
그 결과, LPS 단독 처리군에 비해 굴 알칼라제 및 펩신 가수분해물 처리군을 제외한 플라보자임, 뉴트라제, 프로타맥스, 파파인, 알파키모트립신 및 트립신 등 모든 군에서 NO 생성량이 감소함을 알 수 있었다(도 2참조).
실험 예 2. 굴 단백질 유래 효소 가수분해물로부터 항염증 펩티드 소재 분리 및 정제 I
굴을 프로타맥스로 가수분해시킨 가수분해물의 항염증 펩티드를 분리 및 정제하기 위하여 멤브레인 사이즈에 따라 단백질을 분리, 정제하는 TFF 시스템을 이용하여 5,000 Da 미만, 5,000 ~ 10,000 Da, 10,000 ~ 30,000 Da, 30,000 Da 이상의 분자량별로 4개의 분획물으로 구분하여 NO 생성 억제율을 측정하였다. 그 결과, 4개의 획분 중 10,000 ~ 30,000 Da의 크기에서 가장 높은 활성을 나타냄을 확인 할 수 있었다(도 3참조).
실험 예 3. 굴 단백질 유래 효소 가수분해물로부터 항염증 펩티드 소재 분리 및 정제 II
본 실험 예는 굴을 프로타맥스 가수분해물로부터 항염증 펩티드를 얻기 위해 분리, 정제하는 두 번째 과정으로, TFF 방법에서 가장 우수한 항염증 활성을 나타낸 분획인 10,000 ~ 30,000 Da의 분획물을 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제하였다.
오픈 컬럼 크로마토그래피는 액체 흡착제로 도포된 미세한 고체로 충전된 관이나, 흡착성 액체로 된 얇은 막으로 지지된 긴 모세관을 통해 분석할 액체나 기용체를 통과시켜 혼합물의 각 조성성분들이 관 속의 고정상과 상호작용에 의해 통과속도가 달라지는 것을 이용한 혼합물을 분리하기 위한 분석화학 기법의 하나이다. 본 실험에서는 음이온 교환 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피를 실시한 결과 최종적으로 4개의 분획물을 얻었다(도 4참조). 각 분획물을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과 도 5에서 보듯이 C 획분에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
실험 예 4. 굴 단백질 유래 효소 가수분해물로부터 항염증 펩티드 소재 분리 및 정제 III
본 실험 예는 굴을 프로타맥스 가수분해물로부터 항염증 펩티드를 얻기 위해 분리, 정제하는 세 번째 과정으로, 오픈 컬럼 크로마토그래피를 사용한 위 실험 예 3에서 가장 우수한 항염증 활성을 나타낸 분획인 분획물 C를 GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제하였다.
단백질 액체 크로마토그래피는 고성능 크로마토그래피 기술을 응용하여 단백질의 정제에 특화시킨 기기로 이온 교환 혹은 크기배재 등에 적합한 충전물을 균일하게 담은 관(분리관)을 사용하는 전자동식 분리장치이다. 본 실험에서는 크기배제에에 적합한 컬럼을 장착하여 단백질 액체 크로마토그래피를 실시하였으며, 최종적으로 3개의 분획물을 얻었다(도 6참조).
각 분획물을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과 도 7에 보듯이, C-Ⅰ분획물에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
실험 예 5: 굴 단백질 유래 효소 가수분해물로부터 항염증 펩티드 소재 분리 및 정제 IV
본 실험 예는 굴을 프로타맥스 가수분해물로부터 항염증 펩티드를 얻기 위해 분리, 정제하는 네 번째 과정으로, 상기 실험 예 4에서 얻은 분획물 C-Ⅰ을 분취용 C18 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피를 이용하여 분리, 정제하였다.
고성능크로마토그래피는 적당한 충전물이 균일하게 담긴 관(분리관) 안에서 기체 시료나 기체화한 액체 또는 고체 시료를 운반기체에 의해 전개시키되 분해하지 않고 기체인 상태로 통과시켜 각 성분을 분리시키는 방법인데, 본 실험에서는 분취용 C18 컬럼을 장착하여 크로마토그래피를 실시하였으며, 최종적으로 4개의 분획물을 얻었으며(도 8), 각 획분을 동결건조하여 항염증 활성을 측정한 결과 도 9에서 보듯이 C-Ⅰ-ⅰ 분획물에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
실험 예 6: 굴 단백질 유래 효소 가수분해물로부터 항염증 펩티드 소재 분리 및 정제 V
본 실험 예는 굴을 프로타맥스 가수분해물로부터 항염증 펩티드를 얻기 위해 분리, 정제하는 다섯 번째 과정으로, 상기 실험 예 5에서 얻은 분획물 C-Ⅰ-ⅰ를 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피를 이용하여 다시 한 번 더 분리, 정제하고, 최종적으로 5개의 분획물을 얻었으며(도 10), 그 결과 도 11에서 나타난 바와 같이 C-Ⅰ-ⅰ-c 분획물에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
실험 예 7: 굴 단백질 유래 효소 가수분해물로부터 항염증 펩티드 소재 분리 및 정제 V
본 실험 예는 굴을 프로타맥스 가수분해물로부터 항염증 펩티드를 얻기 위해 분리, 정제하는 여섯 번째 과정으로, 상기 실험 예 6에서 얻은 분획물 C-Ⅰ-ⅰ-c 를 분석용 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피를 이용하여 다시 한 번 더 분리, 정제하여 단일 분획물을 얻었으며(도 12), 그 결과 도 13에서 나타난 바와 같이 분획물의 산화질소생성 억제율은 72.2% 소거율을 나타내었다.
실험 예 8: 항염증 활성을 갖는 펩티드 아미노산 배열 확인
본 실험 예는 상기 실험 예 7에서 얻은 항염증 펩티드의 아미노산 배열을 확인하기 위하여, Edman 분해법(Edman, P., Acta Chemica Scandinavica, 283-293, 1950)에 준하여 N-termina로부터 아미노산 배열을 분석하였다.
그 결과, 항염증 펩티드의 아미노산 배열은 각각 서열번호 1로 기재되는 Gln-Cys-Gln-Cys-Ala-Val-Glu-Gly-Gly-Leu으로 확인되었다(표 2참조).
Figure pat00002
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Antiinflammatory composition comprising enzymatic hydrolysates of Crassostrea gigas <130> P10-E428 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Crassostrea gigas <400> 1 Gln Cys Gln Cys Ala Val Glu Gly Gly Leu 1 5 10

Claims (10)

  1. 굴 단백질 가수분해물로부터 분리된 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항염증제 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 굴 단백질 가수분해물은
    (1) 동결건조된 굴을 완충액 중에 용해시키는 단계;
    (2) 상기 용액에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 가수분해하는 단계;
    (3) 상기 가수분해물을 열수 중에서 가열하는 단계;
    (4) 상기 가열된 가수분해물을 필터, 농축 및 건조하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 완충액은 인산염 완충액(Phosphate buffer) 또는 글리신-염산 완충액(Glycine-HCl buffer) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 완충액의 pH는 1.0~10.0인 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 단백질 가수분해 효소는 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 알칼라제(Alcalase) 및 프로타맥스(Protamex)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 항염증제 조성물.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 (2) 단계의 단백질 가수분해는 반응온도 25 ~ 70℃에서 반응시간 6~10시간으로 효소처리하는 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드는
    (1) 굴 단백질 가수분해물을 TFF(Tangetial Flow Filtration) 시스템에 의해 분자량별로 분리한 후 각 획분의 생리 활성을 측정하는 단계;
    (2) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 크로마토그래피법으로 분리하는 단계;
    (3) 상기 분리된 각 획분의 생리활성을 측정하는 단계; 및
    (4) 상기 분리된 획분 중 생리활성이 가장 뛰어난 획분을 정제하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조하며, 상기 (2) 내지 (4) 단계를 반복 실시하여 단일물질로 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 (2) 단계는 음이온 결합 컬럼이 사용된 오픈 컬럼 크로마토그래피, GPC 컬럼이 장착된 단백질 액체 크로마토그래피, 분취용 C18 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피 및 두 번의 분석용 C18 컬럼이 장착된 고성능크로마토그래피를 이용하여 정제과정을 실시하는 것을 특징으로 하는 항염증제 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 항염증제.
  10. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
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KR20200036275A (ko) 2018-09-28 2020-04-07 부경대학교 산학협력단 숙취해소 효능이 있는 굴 가수분해물의 제조방법 및 그 장치
KR20220097747A (ko) 2020-12-31 2022-07-08 강원대학교산학협력단 저분자 흑염소육골즙 효소분해물 및 유효 펩타이드 서열을 함유하는 조성물

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