KR101150425B1

KR101150425B1 - 미더덕 유래의 혈압조절용 조성물

Info

Publication number: KR101150425B1
Application number: KR1020110096701A
Authority: KR
Inventors: 전유진; 고석천; 이경구
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2012-06-01

Abstract

본 발명은 양식 미더덕 유래 혈압 조절 효과를 가지는 조성물에 관한 것으로서, 양식 미더덕으로부터 혈압조절에 관여하고 있는 인자 중의 하나인 안지오텐신 I-전환효소(Angiotensin I-converting enzyme) 활성을 저해하고, 산화질소(Nitric oxide) 생성에 의한 혈관확장을 유도하는 혈압 조절 효과를 가지는 펩타이드를 분리하고 이를 유효성분으로 함유하는 혈압조절 조성물을 개시한다.

Description

미더덕 유래의 혈압조절용 조성물{Composition for controlling blood pressure from Styela clava}

본 발명은 미더덕 유래의 혈압 조절 효과를 가지는 조성물에 관한 것이다.

종래 화학 합성 방법 등을 통하여 제조되었던 고혈압 제제의 부작용들의 문제가 발생됨에 따라 최근 세계 각국에서는 천연 물질로부터 항고혈압 효과를 갖는 물질을 얻기 위한 노력이 지속되고 있다. 이에 각국에서는 항고혈압제 뿐만 아니라 항생물질, 항암제와 같이 인체에 유용한 의약품은 물론이고, 효소와 건강보조제와 같은 식품 소재 등 다양한 용도에 활용될 수 있는 새로운 물질을 탐색하기 위하여 자연 상태의 생물, 특히 대량 배양 및 번식이 용이한 생물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 해양생물은 육상생물에 없는 특유의 대사과정과 독특한 환경으로 인하여 다양한 신규 생리활성물질의 탐색 기능성을 가지고 있다. 또한, 육상생물은 이미 많은 연구가 진행되었으나 해양생물은 아직 제한된 연구로 인하여 미지의 천연물질의 개발에 대한 기대가 높이 평가되고 있다.

그 중에서도 미더덕은 전 세계적으로 우리나라에서만 식용으로 사용하며 유일하게 양식을 하고 있어 대량 생산이 용이할 뿐만 아니라 소재로서의 부가가치가 매우 높기 때문에 생물 소재 산업에 있어서 중요한 위치를 차지하고 있다. 예를 들어 한국식품영양과학회지 제35권 제3호에서는 미더덕의 가공방법과 용매에 따른 항산화 및 항암효과에 대해 기술하고 있으며, 한국식품영양과학회지 제36권 제10호에서는 알코올로 인한 쥐의 백혈구 및 간에 미치는 손상에 대한 보호 효과에 대해 기술하고 있으며, 한국식품영양과학회지 제37권 제12호에서는 미더덕의 부위별 항산화 활성에 대해 기술하고 있다. 한편, 한국식품영양과학회지 제39권 제3호에서는 미더덕의 채취시기별 및 부위별에 따른 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과에 대해 기술하고 있다.

그렇지만, 대량 양식이 가능하고 다양한 생리활성 성분을 함유하고 있는 미더덕이 가지고 있는 잠재력을 고려해 볼 때, 미더덕으로부터 약품 또는 기능성 식품과 같이 인체의 건강을 증진시킬 수 있는 조성물을 얻기 위한 연구는 지속적으로 필요한 실정이다.

본 발명은 해양생물인 미더덕으로부터 혈압조절 효과를 얻기 위하여 미더덕을 인간에게 적용이 가능한 효소적 가수분해를 통해 혈압조절 효과를 가지는 조성물을 효과적으로 회수하여, 이들로부터 혈압조절 펩타이드를 분리, 정제하고자 하는 것이다. 본 발명의 다른 이점 및 목적은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 첨부하는 도면을 통해서 더욱 분명해질 것이다.

본 발명의 일 구현예에서는 미더덕(Styela clava)의 육(肉) 및 껍질 부위 중 선택되는 단독 또는 혼합물의 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 혈압조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예에서는 미더덕(Styela clava)의 육(肉) 및 껍질 부위 중 선택되는 단독 또는 혼합물의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈압조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 의한 혈압조절용 조성물에 있어서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 미더덕의 육의 단백질 가수분해물을 한외여과와 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 컬럼 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획 성분을 역상 HPLC로 분리하는 단계를 포함하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의한 혈압조절용 조성물에 있어서, 미더덕의 육의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 혈관수축을 유도하여 혈압을 상승시키는 안지오텐신 I-전환효소의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의한 혈압조절용 조성물에 있어서, 미더덕의 육의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 혈관내피에서 산화질소를 생성시켜 혈관 확장을 유도할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 의한 혈압조절용 조성물에 있어서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 5개의 아미노산 잔기 Ala-His-Ile-Ile-Ile의 아미노산 서열을 포함하고, 안지오텐신 I-전환효소 저해와 산화질소 생성을 통한 혈관확장 효과를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의한 혈압조절용 조성물에 있어서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 안지오텐신 I-전환효소 활성 저해 효과 범위가 0.02 ~ 7.0 mg/ml일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의한 혈압조절용 조성물에 있어서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 산화질소 생성 효과 범위가 0.05 ~ 0.2 mg/ml일 수 있다.

본 발명에서는 미더덕의 효소적 가수분해물 유래의 혈압조절 펩타이드의 존재를 확인하고, 이것이 다양한 경로를 통해 혈압조절 효과를 발현함을 확인한다. 또한 미더덕의 효소적 가수분해물은 인간을 대상으로 적용하기에 매우 유리하며 부작용이 없는 천연 혈압조절제의 유효성분으로 활용할 수 있는 효과가 크다고 할 수 있다. 또한 미더덕은 전 세계에서 우리나라만이 양식을 하면서 식용으로도 쓰이고 있어 약품 및 기능성 식품의 개발이 이루어진다면 전 세계적으로 원천기술의 확보는 물론 우리나라만이 전적으로 자원을 확보하기 때문에 세계 시장에서 크게 활용가치를 증진시킬 것으로 판단된다. 이 외에도 해양생물 유래의 새로운 혈압조절용 식품소재의 개발, 기존의 혈압치료제라는 의약품 개념에서 기능성 식품으로 안전하게 복용이 가능하고 수용성 및 식품용으로 사용 가능한 효소적 추출공정으로 인하여 부작용이 없을 것으로 기대되며, 미이용 수산물의 다양한 용도 개발, 해양생물산업의 활성화와 최근 전세계적으로 해양생물 선호에 따른 개발제품의 수출 증대와 같은 기대효과가 있을 것으로 사료된다.

도 1은 미더덕의 혈압조절 물질의 효소적 가수분해물의 제조 분리과정의 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 미더덕 육부위를 프로타맥스에 의해 가수분해하여 얻어진 효소적 가수분해물의 혈관내피세포 존재 유무에 따른 혈관확장 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 프로타맥스에 의해 가수분해하여 얻어진 미더덕 유래의 효소적 가수분해물을, 한외여과하여 분리된 분자량별 분획물에 대한 혈관내피세포 존재 유무에 따른 혈관확장 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 프로타맥스에 의해 가수분해하여 얻어진 미더덕 유래의 효소적 추출물을, 한외여과하여 분리된 분자량별 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해효과와 혈관확장효과를 가지는 분획물(5 kDa 이하 분획물)을 겔여과 크로마토그래피에 적용시켜 분획된 성분에 대한 분석 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 겔여과 크로마토그래피를 통해 얻어진 분획물에 대한 혈관내피세포 존재 유무에 따른 혈관확장효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 겔여과 크로마토그래피에 의하여 분리된 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해효과와 혈관확장효과를 가지는 분획물(F-I)을 역상-고성능액체크로마토그래피(HPLC)에 적용시켜 분석한 결과를 도시한 그래프로서, 총 2개(F-I-A~F-I-B)의 분획 성분으로 분리되었음을 보여주고 있다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 역상-고성능액체크로마토그래피(HPLC)에 의하여 분리된 분획물에 대한 혈관내피세포 존재 시 혈관확장효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 역상-고성능액체크로마토그래피로 분리, 정제한 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과와 혈관확장효과를 가지는 분획물 (F-I-B)을 Q-TOF 질량분석기에 적용시켜 아미노산 서열 및 분자량을 분석한 결과를 도시한 그래프이다.
도 9에 있어서, A는 본 발명의 실시예에 따라 역상-고성능액체크로마토그래피(RP-HPLC)로 분리, 정제한 분획물 중 혈관확장효과를 가지는 분획물 (F-I-B)의 인간유래 혈관내피세포를 통해 산화질소(Nitric oxide)의 생성효과를 도시한 그래프이고, B는 혈관내피세포내 산화질소 합성효소(eNOS)의 활성화를 나타낸 그림이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라 겔여과 크로마토그래피에 의하여 분리된 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해효과와 혈관확장효과를 가지는 분획물(F-I)을 선천성고혈압쥐(SHR)에 경구투여하여 24시간 동안 혈압 강하 효과를 도시한 그래프이다.

이와 같은 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

본 발명은 양식 미더덕 유래 혈압조절 효과를 발현하는 조성물에 관한 것으로서, 양식 미더덕으로부터 혈압조절에 관여하고 있는 인자 중의 하나인 안지오텐신 I-전환효소(Angiotensin I-converting enzyme) 활성을 저해하고, 산화질소(Nitric oxide) 생성에 의한 혈관확장을 유도하는 혈압 조절 효과를 가지는 펩타이드를 분리하고 이를 유효성분으로 함유하는 혈압 조절 조성물에 관한 것이다.

미더덕의 항고혈압 효능과 관련하여 이 건 출원인은 기 출원한바 있으며(특허공개 10-2009-0030831), 이때 추출물은 수용성 추출물 또는 유기용매 추출물이며, 얻어진 추출물에 대해 안지오텐신 I-전환효소 저해활성 및 조추출물액의 고혈압 유발 쥐에 대한 혈압강하 효과를 확인한 바 있다.

유기용매 추출물의 경우 식품이나 약학적 조성으로 적용시 바람직하지 못하고 본 발명에 따라 실험한 결과에 따르면 수용성 추출물의 경우 안지오텐신 I-전환효소 저해활성 측면에서 단백질 가수분해물에 비하여 우수하지 못하다.

이에 본 발명의 일 구현예에서는 인간에게 적용이 가능한 효소적 추출을 통해 얻어지는 미더덕의 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 혈압조절용 조성물을 제공한다.

미더덕의 육, 껍질 부위 또는 전체의 단백질 가수분해물은 도 1로 도시한 일련의 공정을 통해 얻어질 수 있으나 이에 한정이 있는 것은 아니다. 도 1을 참조하여 구체적으로 설명하면, 미더덕 시료의 선별 및 수세과정(S1)과; 선별된 미더덕을 동결건조 하는 동결건조과정(S2)과; 건조된 미더덕을 분말화 하는 과정(S3)과; 분말화 미더덕에 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 효소가 가지는 최적조건에서 수행하는 가수분해 과정(S4)과; 그 여액을 원심분리하는 과정(S5)과; 원심분리 후 청징화 시킨 여액을 감압여과 하는 과정(S6)과; 이를 동결건조 하는 과정(S7)을 포함할 수 있다. S3에 있어서, 분말화는 27메쉬 이하, 좋기로는 10메쉬 내지 30메쉬 정도로 분쇄하는 것이 바람직할 수 있다. S4에 있어서, 단백질 가수분해 효소로는 식품적으로 용인된 것이면 그 한정이 있는 것은 아니고, 일예로 뉴트라제, 알칼라제, 플라보자임, 프로타맥스, 코지자임, 알파-카이모트립신, 트립신, 파파인 및 펩신 중에서 선택된 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 가수분해물의 수율로는 알칼라제가 유리하나, 혈압조절 효능을 발현하는 측면에서는 프로타맥스가 바람직할 수 있다. 이러한 단백질 가수분해 효소를 이용한 가수분해는 완충액 내에서 수행할 수 있고, 분말화 된 미더덕 중량 1g에 대하여 완충액은 50 내지 100 ml 정도 되는 것이 바람직하다. 또한 가수분해는 각 효소마다 최적 조건에 차이가 있음을 고려할 때 조건은 37℃ 내지 50℃에서 12시간 내지 24시간 동안 수행하는 것일 수 있다.

상기와 같은 일련의 과정을 거쳐 얻어지는 미더덕의 육 및 껍질 부위 중 선택되는 단독 또는 혼합물의 단백질 가수분해물은 혈압조절 효과를 발현할 수 있고, 이를 식품이나 약학적 조성으로 유용할 수 있음은 물론이다.

한편 혈압조절 효과를 발현하는 성분을 극대화하기 위하여 본 발명의 다른 일 구현예에서는 미더덕(Styela clava)의 육(肉) 및 껍질 부위 중 선택되는 단독 또는 혼합물의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈압조절용 조성물을 제공한다.

여기서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 미더덕의 육의 단백질 가수분해물을 한외여과와 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 컬럼 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획 성분을 역상-고성능액체크로마토그래피(RP-HPLC)로 분리하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다. 미더덕은 껍질에 비하여 육에 단백질 함량이 다량 높고, 따라서 단백질 가수분해물의 수율이 높을 뿐만 아니라 혈압조절 유효성분의 함량 또한 많으므로, 단백질 가수분해물로서 미더덕의 육의 단백질 가수분해물을 도 1을 참조한 상술한 방법에 따라 얻고, 이로부터 상기한 방법을 통해 펩타이드를 분리할 수 있다.

얻어진 미더덕의 육의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 혈관수축을 유도하여 혈압을 상승시키는 안지오텐신 I-전환효소의 활성을 저해할 수 있다.

또한 이는 혈관내피에서 산화질소를 생성시켜 혈관 확장을 유도할 수 있다.

이와 같이 얻어진 미더덕 육의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 도 8로 도시한 것과 같이, 5개의 아미노산 잔기 Ala-His-Ile-Ile-Ile의 아미노산 서열을 포함하며, 이는 산화질소 생성을 통한 혈관확장 효과를 갖는다. 따라서 이러한 펩타이드를 식품이나 약학적 조성물 중에 포함하면 혈압조절 효과를 발현할 수 있다.

이러한 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 산화질소 생성 효과 범위가 0.05 ~ 0.2 mg/ml으로 소량으로도 효과적인 혈압조절 효과를 발현할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아님은 물론이다.

[실시예 1]

(1) 재료의 준비

시험에 사용한 재료는 해양생물인 미더덕(Styela clava)을 구입하여 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻어 물기를 제거한 후, 육부위와 껍질 부위를 구분하고, 분쇄하여 사용하였으며, 심온동결기(-70℃)에서 24시간 저장하고, 동결건조하여 완전히 건조시켰다. 건조된 시료는 분쇄기를 이용하여 분말화하여 사용하였다.

(2) 미더덕 부위별 건조물의 일반성분 측정

미더덕 추출물의 일반성분은 AOAC법(1990)에 따라 수분 함량은 105℃ 상압건조법, 조지방은 속실렛(Soxhlet) 추출법, 조단백질은 킬달법(kjeldahl), 조회분은 550℃ 건식 회화법으로 분석하였으며, 탄수화물 함량은 고형분의 총량에서 수분, 회분, 조단백질, 그리고 조지방의 함량을 뺀 값으로 나타내었다. 이를 하기의 표 1로 요약하였다.

미더덕 부위별 건조물의 일반성분
일반성분	함량(중량%)
일반성분	전체부위	육부위	껍질부위
수분	9.34	1.84	1.78
회분	10.77	7.05	3.57
단백질	33.12	67.80	31.51
탄수화물	42.52	16.77	60.38
지방	4.25	6.54	2.76
총량	95.75	93.46	97.24

표 1에 나타나 있는 것처럼, 미더덕의 건조물의 일반성분 중에서 전체 부위는 탄수화물(42.52 중량%), 단백질(33.12 중량%), 회분(10.77 중량%), 수분(9.34 중량%) 및 지방(4.25 중량%)로서, 탄수화물의 함량이 가장 높은 것으로 분석되었다. 한편, 부위별 건조물의 일반성분에서는 육부위에서 단백질(67.80 중량%)로 함량이 가장 높았으며, 껍질부위에서는 탄수화물(60.38 중량%) 함량이 가장 높은 것으로 분석 되었다.

(3) 미더덕 유래 혈압조절 물질의 가수분해물액의 제조

도 1은 미더덕의 혈압조절 물질의 가수분해물액의 제조 분리과정의 흐름도를 나타나낸 것으로 이를 상세하게 설명하면, 미더덕의 효소 가수분해물 제조에 있어서, 상기에서 미더덕시료의 선별 및 수세과정(1)과, 선별된 미더덕을 동결건조 하는 동결건조과정(2)과 건조된 미더덕을 27 메쉬 이하의 크기로 분쇄하는 분말화과정(3)과 상기의 분말화 미더덕 1g에 100 ml의 완충용액에 9가지 단백질 가수분해 효소를 첨가하여 제조 반응시간을 24시간으로 하여 각 효소들이 가지는 최적조건에서 수행하는 가수분해 과정(4)과 그 여액을 3500 rpm에서 20분간 원심분리하여 청징화하는 원심분리과정(5)과 원심분리 후 청징화 시킨 여액을 와트만 필터 종이(Whatman No.4)를 이용하여 감압여과(6) 후 동결건조(7) 하여 -20℃에서 보관하면서 미더덕 유래 혈압조절 물질의 효소 가수분해물을 제조하여 사용하였다.

(4) 미더덕 전체부위 효소 가수분해물의 수율 측정

미더덕의 단백질을 이용하기 위하여 단백질 가수분해 효소를 이용하여 가수분해를 실시하여, 미더덕 전체부위 가수분해물의 수율을 측정하였다. 수율은 미더덕으로부터 유효성분을 제조방법에 따라 획득한 다음, 양을 백분율(%)로 계산하였으며, 수율은 표 2와 같다.

미더덕 전체부위 효소 추출물의 수율(%)
효소	수율(%)
뉴트라제	37.4± 0.2
알칼라제	29.3± 0.3
플라보자임	25.3± 0.1
프로타맥스	34.1± 0.2
코지자임	21.8± 0.2
알파-카이모트립신	31.4± 0.2
트립신	27.7± 0.3
파파인	25.6± 0.1
펩신	22.9± 0.2
수용성 추출물	15.4± 0.1

각각의 가수분해물의 수율 측정 결과 수용성 추출물 보다 효소를 이용한 가수분해물의 수율이 높은 것으로 분석되었고, 뉴트라제 가수분해물이 37.4%로 수율이 가장 높았으며, 다음 프로타맥스 가수분해물이 34.1%로 수율이 높은 것으로 분석되었다.

(5) 미더덕 전체 부위 효소 가수분해물의 혈압조절( 안지오텐신 I-전환 효소 저해) 효과 분석

본 실시예 에서는 상기 (4)를 통하여 얻어진 미더덕 유래의 단백질 가수분해 산물에 대한 혈압조절 효과를 측정하기 위하여 안지오텐신 I-전환효소(ACE) 저해 활성을 측정하였다. 안지오텐신 I-전환 효소(ACE) 저해활성 측정 방법은 Cushman과 Cheung(1971)의 방법에 준하여 측정을 하였다.

미더덕 가수분해물을 300 mM NaCl이 포함된 0.1 M 나트륨 붕산염 완충용액(Sodium borate buffer, pH 8.3)에 녹인 가수분해물 50㎕에 25 mU/ml ACE 효소액 50 ㎕를 가한 후, 37℃에서 10분간 항온처리하였다. 이에 기질로서 25 mM HHL 용액 100 ㎕를 가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 1N HCl 용액 0.25 ml를 가하여 시험관 혼합기로 교반하여 반응을 정지시켰다. 그 결과 얻은 반응용액에 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 0.5 ml를 가하여 교반한 다음 4,000 rpm의 조건에서 10분 동안 원심분리시킨 후 에틸 아세테이트층인 상층액 0.2 ml를 분취하였다. 분취액을 감압하여 완전히 건조시켜 증류수 1 ml를 가하여 용해시킨 후 228 nm에서 흡광도를 측정하여 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과를 농도별로 측정하여 50% 저해시키는데 필요한 농도를 계산하여 IC₅₀값(mg/ml)로 정의하여 표 3에 나타내었다.

미더덕 전체부위 효소 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과
가수분해물	안지오텐신 I-전환효소 저해효과 IC₅₀값(mg/ml)
뉴트라제 가수분해물	2.481
알칼라제 가수분해물	1.781
플라보자임 가수분해물	2.343
프로타맥스 가수분해물	1.023
코지자임 가수분해물	2.481
알파-카이모트립신 가수분해물	2.263
트립신 가수분해물	2.427
파파인 가수분해물	2.282
펩신 가수분해물	2.147
수용성 추출물	6.887

미더덕 전체부위를 가수분해효소로 분해한 후, 각각의 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과를 측정한 결과, 수용성 추출물 보다 가수분해물의 저해 효과가 높은 것으로 분석되었으며, 프로타맥스 가수분해물의 저해 효과가 1.023 mg/ml로 다른 가수분해물에 비해 높게 나타나는 것을 확인 하였다.

(6) 미더덕 부위별 효소 가수분해물의 수율 측정

본 실시예는 상기의 (5)에서 확인된 결과로 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과가 가장 우수한 가수분해물 제조에 사용된 프로타맥스를 이용하여 미더덕을 육부위와 껍질부위로 분리하여 각각의 가수분해물을 제조하였으며, 가수분해물 제조 방법은 상기 (3)과 동일하게 수행하였으며, 수율 측정은 상기의 (4)와 동일하게 수행하였으며, 수율은 표 4와 같다.

미더덕 부위별 효소 가수분해물의 수율
부위	수율(%)
육부위	49.7
껍질부위	14.1

단백질 함량이 많은 육부위 가수분해물의 수율이 49.7%로 껍질부위 가수분해물의 14.1% 보다 3배 이상이 높은 것으로 확인되었다.

(7) 미더덕 부위별 효소 가수분해물의 혈압조절( 안지오텐신 I-전환효소 저해) 효과 분석

본 예에서는 상기(6)에서 얻어진 미더덕의 부위별 프로타맥스 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과를 측정하였으며, 측정방법은 상기의 (5)와 동일한 방법으로 수행하였다. 각각의 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과를 농도별로 측정하여 50% 저해시키는데 필요한 농도를 계산하여 IC₅₀값(mg/ml)로 정의하여 표 5에 나타내었다.

미더덕 부위별 효소 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과
부위	안지오텐신 I-전환효소 저해효과 IC₅₀값(mg/ml)
육부위	0.455
껍질부위	2.060

미더덕 부위별로 프로타맥스로 가수분해 분해한 후, 각각의 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과를 측정한 결과, 껍질부위 가수분해물 보다 육부위의 가수분해물의 저해 효과가 높은 것으로 분석되었으며, 이는 전체부위 프로타맥스 가수분해물의 저해 효과보다 높게 나타나는 것을 확인 하였다.

(8) 미더덕 육부위 효소 가수분해물의 혈압조절(혈관확장) 효과 분석

본 예에서는 상기의 (6)에서 확인된 미더덕 육부위 프로타맥스 가수분해물의 혈관확장 효과를 측정하였다. 혈관확장 효과는 정상 실험쥐를 이산화탄소를 이용하여 치사 시킨 후 흉부대동맥을 적출하여 약 1cm 길의 절편을 만든 후 흉부대동맥 내에 내피세포를 제거한 것과 제거하지 않은 것을 사용하였다. 이는 혈관확장 효과가 내피세포 존재 여부에 따라 달라지며, 또한 혈관확장 작용을 하는 메커니즘이 내피세포 존재 여부에 따라 다르기 때문에 어떠한 경로로 혈관확장 작용이 나타나는지 확인하기 위함이다. 그리하여 적출된 흉부대동맥 절편을 산소로 포화시킨 크랩스 용액(Kreb's solution)으로 채운 조직 배양기 내에 특수 제작된 스테인리스 조직 홀더로 현수하였다. 조직 배양기 내의 온도는 37℃로 유지하며, 실험이 진행되는 동안 95% 산소, 5% 이산화탄소를 공급하여 용액의 pH를 7.4로 유지하였다. 적출 대동맥에 20분마다 조직 배양기내 크랩스 용액을 바꾸어 주면서 2시간 동안 안정화시켰다. 혈관의 수축이완 반응은 고정된 대동맥 고리의 다른 한쪽을 굴곡력-전환기에 연결시켜, 생리기록계로 기록하고 차트6 윈도우 프로그램으로 분석하였다. 미더덕 육부위 프로타맥스 가수분해물의 혈관확장 효과는 농도별로 분석하였으며, 결과를 도 2에 나타내었다. 혈관확장 효과는 농도 의존적으로 효과가 증가함을 나타내었으며, 최고 농도 3 mg/ml에서 약 40%의 혈관확장 효과가 나타났다. 또한 혈관내피세포 존재 시에만 혈관확장 효과가 나타났다.

[실시예 2] 혈압조절 펩타이드의 정제 및 분리

(1) 한외여과 시스템을 통한 정제 및 분리

본 실시예에서는 상기 실시예 1로부터 얻어진 미더덕 육부위 프로타맥스 가수분해물로부터 혈압조절 펩타이드를 정제, 분리하기 위하여 한외여과 시스템을 통한 분자량별 분리를 실시하였다. 밀리포어 랩스캐일 한외여과 시스템을 이용하여 5 kDa과 10 kDa 사이즈의 한외여과막을 이용해 5 kDa 이하, 5-10 kDa, 10 kDa 이상의 3가지 분자량별 분획물을 제조하여 동결건조 한 후 상기 실시예 1의 (5)와 동일한 방법으로 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과와 상기의 실시예 1의 (7)과 동일한 방법으로 혈관확장 효과를 측정하여 효과가 가장 우수한 분획물을 선정하였다. 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과는 저해효과를 50% 저해시키는데 필요한 농도를 계산하여 IC₅₀값(mg/ml)으로 정의하여 표 6에 나타내었다.

한외여과 시스템을 통해 분리된 분획물의 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과
분획물	안지오텐신 I-전환효소 저해효과 IC₅₀값(mg/ml)
프로타맥스 가수분해물(육부위)	0.455
10 kDa 이상 분획물	0.325
5-10 kDa 분획물	0.552
5 kDa 분획물	0.281

한외여과 시스템을 통해 분리한 분자량별 분획물 중에서 5 kDa 이하 분획물의 IC₅₀값이 0.281 mg/ml로 가장 우수한 효과를 나타내었으며, 분리 전 가수분해물보다 효과가 우수함을 나타내었다. 혈관확장 효과는 농도별로 측정을 하였으며, 결과를 도 3에 나타내었으며 모든 분획물에서 농도 의존적으로 혈관확장효과가 나타났으며, 상기의 실시예 7에서와 동일하게 내피세포 존재 시에만 효과가 나타났다. 분자량별 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해효과의 경향이 동일하게 5 kDa 이하 분획물이 혈관확장효과가 가장 우수하였으며 1.5 mg/ml의 농도에서 약 40%, 3 mg/ml의 농도에서 80%에 가까운 혈관확장효과가 나타났으며, 분리 전 가수분해물보다 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

(2) 겔여과 크로마토그래피를 통한 정제 및 분리

본 실시예에서는 상기 (1)에서 확인한 혈압조절 효과가 가장 우수한 5 kDa 이하의 분획물로부터 혈압조절 펩타이드를 정제, 분리하기 위하여 겔여과 크로마토그래피를 통한 정제 및 분리를 실시하였다. 겔여과 크로마토그래피는 '세파덱스(Sephadex) G-25'를 충진시킨 컬럼(column)에 의한 크로마토그래피를 이용하였으며, 분리 조건은 여과와 탈기 과정을 거친 100% 증류수를 2 ml/분의 유속으로 300분간 흘려주었으며, 각 분획물은 분광광도계로 파장 220 nm에서 흡광도를 측정하였다. 분획물의 흡광도를 측정한 결과 4개(F-I~F-IV)의 분획물로 분리된 그래프를 도 4에 나타내었다. 각 분획물을 회수하여 동결건조한 후 일정량을 취하여 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과와 혈관확장효과를 측정하였다. 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과는 저해효과를 50% 저해시키는데 필요한 농도를 계산하여 IC₅₀값(mg/ml)으로 정의하여 표 7에 나타내었다.

겔여과 크로마토그래피를 통해 분리된 분획물의 안지오텐신 I-전환효소 저해효과
분획물	안지오텐신 I-전환효소 저해효과 IC₅₀값(mg/ml)
5 kDa 이하 분획물	0.281
F-I 분획물	0.161
F-II 분획물	0.926
F-III 분획물	0.285
F-IV 분획물	>1

겔여과 크로마토그래피를 통해 분리한 분획물 중에서 F-I 분획물의 IC₅₀값이 0.161 mg/ml로 가장 우수한 효과를 나타내었으며, 겔여과 크로마토그래피 정제 및 분리 전 분획물인 5 kDa 이하 분획물 보다 저해효과가 우수함을 나타내었다.

혈관확장 효과는 농도별로 측정을 하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었으며 모든 분획물에서 농도 의존적으로 혈관확장효과가 나타났으며, 상기의 실시예 1의 (8)에서와 동일하게 내피세포 존재 시에만 효과가 나타났다. 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해효과의 경향이 동일하게 F-1 분획물이 혈관확장효과가 가장 우수하였으며 0.75 mg/ml의 농도에서 약 45%, 1.5 mg/ml의 농도에서 약 60%, 3 mg/ml의 농도에서 80% 이상의 혈관확장효과가 나타났으며, 분리 전 5 kDa 이하 분획물보다 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

(3) 역상 -고성능액체크로마토그래피( Reverse phase - HPLC )를 통한 정제 및 분리

본 예에서는 상기의 (2)에서 확인한 혈압조절 효과가 가장 우수한 F-I 분획물로부터 혈압조절 펩타이드를 정제, 분리하기 위하여 역상-고성능액체크로마토그래피를 통한 정제 및 분리를 실시하였다. F-I 분획물의 정제 및 분리는 역상 ODS 컬럼을 사용하였으며, 분당 0.6 ml의 유속으로 아세토나이트릴(acetonitrile)을 0%에서 15% 까지 선형 기울기(linear gradient)로 50분간 흘려주었다. 그 결과 도 6에서와 같이 2개의 분획물(F-I-A~F-I-B)로 분리되었다. 각 분획물을 회수하여 동결건조한 후 일정량을 취하여 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과와 혈관확장효과를 측정하였다. 안지오텐신 I-전환효소 저해 효과는 저해효과를 50% 저해시키는데 필요한 농도를 계산하여 IC₅₀값(mg/ml)으로 정의하여 표 8에 나타내었다.

역상-고성능액체크로마토그래피 통해 분리된 분획물의 안지오텐신 I-전환효소 저해효과
분획물	안지오텐신 I-전환효소 저해효과 IC₅₀값(mg/ml)
F-I 분획물	0.161
F-I-A 분획물	0.168
F-I-B 분획물	0.021

겔여과 크로마토그래피를 통해 분리한 분획물 중에서 F-I-B 분획물의 IC₅₀값이 0.021 mg/ml로 가장 우수한 효과를 나타내었으며, 역상-고성능액체크로마토그래피 정제 및 분리 전 분획물인 F-I 분획물 보다 저해효과가 우수함을 나타내었다. 분리 및 정제 전의 가수분해물의 안지오텐신 I-전환효소 저해효과보다 21.67배 증가하였다. 혈관확장 효과는 실험실 스케일의 기기의 사용으로 농도별로 측정을 하기에 어려움이 있어 한가지의 농도를 설정하여 혈관내피세포 존재하의 조건에서 측정을 하였으며, 결과를 도 7에 나타내었다. 0.1 mg/ml 농도의 F-I-B 분획물에서 F-I-A 분획물보다 효과가 우수하였으며, 약 33%의 혈관확장효과가 나타났다. 상기의 (2) 결과인 도 4에서 최저농도 0.18 mg/ml에서 약 20%의 효과와 비교하여 볼 때 더욱 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있다.

(4) 정제 및 분리를 통해 획득한 단일 펩타이드의 아미노산 구조 분석

상기 (3)과 같이 역상-고성능액체크로마토그래피를 통해 분리된 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해효과와 혈관확장 효과를 동시에 가지는 F-I-A 분획물을 TOF 질량분석기를 이용해 아미노산 구조 분석을 하였으며, 결과는 도 8에 나타내었다. Ala-His-Ile-Ile-Ile(AHIII, 서열번호 1)의 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드임을 확인하였다.

[실험예 1] 인간유래 혈관내피세포를 통한 산화질소(nitric oxide) 생성 확인

상기의 실시예들을 통해 확인된 결과들을 종합하여 볼 때 혈관내피세포 존재 시 혈관확장효과가 나타남을 고려하여 볼 때 혈관내피세포를 통한 혈관확장효과가 나타남을 확인할 수 있다. 혈관내피세포를 통한 혈관확장효과의 경로 중 가장 대표적인 것이 산화질소(Nitric oxide) 생성에 의한 혈관확장이다. 그리하여 본 실험예에서는 인간유래 혈관내피세포 (EA. hy 926 cell)를 이용하여 상기 실시예 3과 4를 통해 획득한 서열번호 1의 펩타이드를 통해 산화질소의 생성 및 혈관내피세포내 산화질소합성효소 (eNOS)의 활성화를 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 있어서 A는 산화질소의 생성량을 나타낸 그래프로서 PBS 처리군에 비하여 산화질소의 양이 증가함을 나타내었으며, 0.1 mM의 농도에서 1.5배 증가함을 나타내었다. 도 9에 있어서 B는 산화질소합성효소(eNOS)의 활성화를 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 통해 확인한 그림으로 PBS를 처리한 군에 비해 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 군에서 활성화 된 산화질소합성효소(p-eNOS)의 발현이 현저히 증가함을 확인할 수 있다. 이 결과를 통해 혈관확장효과는 혈관내피세포에서 산화질소의 생성을 통한 경로로 나타남을 확인하였다.

[실험예 2] 선천성고혈압쥐(SHR)을 통한 혈압강하효과 확인

본 실험예에서는 선천적으로 고혈압을 가지고 있는 동물모델을 통해 혈압강하효과를 확인하였다.

구체적으로, 선천성고혈압쥐를 이용하여 상기 실시예 2로부터 얻어진, 겔여과 크로마토그래피를 통해 분리한 분획물 중 안지오텐신 I-전환효소 저해효과와 혈관확장효과가 가장 우수한 F-I 분획물을 통해 혈압강하효과를 확인하였다. 혈압강하효과 확인은 생리식염수 투여군, F-I 분획물 투여군, 대조군인 암로디핀(칼슘채널차단제) 투여군, 총3군으로 나누어 실시하였으며, 각각의 군의 동물모델에게 경구투여를 실시한 후 24시간 동안의 혈압변화를 확인하였다. 결과는 도 10에 나타내었으며, 현재 항고혈압 제제로 사용되고 있는 암로디핀은 30분부터 혈압강하효과가 나타나 160 mmHg 정도 까지 혈압이 강하하는 효과를 보였다. F-I 분획물 또한 180분부터 혈압강하효과가 나타나 720분에는 암로디핀의 혈압강하효과와 동일한 효과를 나타내었다. 투여전 혈압을 고려해 볼 때 F-I 분획물의 혈압강하효과는 40 mmHg 이상을 강하시키는 것을 확인하였으며, 암로디핀과 유사한 혈압강하 효과를 나타냄을 확인하였다.

Claims

미더덕(Styela clava)의 육 및 껍질 부위 중 선택되는 단독 또는 혼합물의 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 혈압조절용 조성물로,
상기 단백질 가수분해물은 프로타맥스를 단백질 가수분해 효소로 하여 얻어진 것인 혈압조절용 조성물.
미더덕(Styela clava)의 육 및 껍질 부위 중 선택되는 단독 또는 혼합물의 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈압조절용 조성물로,
상기 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 프로타맥스를 단백질 가수분해 효소로 하여 얻어진 단백질 가수분해물 유래의 것이고, 5개의 아미노산 잔기 Ala-His-Ile-Ile-Ile의 아미노산 서열을 포함하며, 안지오텐신 I-전환효소 저해와 산화질소 생성을 통한 혈관확장 효과를 가지는 것인 혈압조절용 조성물.
제 2 항에 있어서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 미더덕의 육의 단백질 가수분해물을 한외여과와 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 컬럼 크로마토그래피에 의하여 얻어진 분획 성분을 역상 HPLC로 분리하는 단계를 포함하여 제조된 것인 혈압조절용 조성물.
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제 2 항에 있어서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 안지오텐신 I-전환효소 활성 저해 효과 범위가 0.02 ~ 7.0 mg/ml인 것인 혈압조절용 조성물.
제 2 항에 있어서, 단백질 가수분해물 유래의 펩타이드는 산화질소 생성 효과 범위가 0.05 ~ 0.2 mg/ml인 혈압조절용 조성물.