CN1731934B - 源自植物材料的ace抑制肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了从诸如种子粗粉或细粉的植物材料制备含有ACE抑制肽的水解物的改良方法。在一实施方案中，在消化前将所述的种子粗粉或细粉用有机溶剂来提取。本发明还提供了ACE抑制肽Val-Ser-Val和Phe-Leu。

Description

源自植物材料的ACE抑制肽
发明领域
本发明涉及从植物来源获得具有高度特异活性的ACE抑制肽组合物的改进方法。
发明背景
高血压或血压过高在北美是一种常见的健康问题，其中每四个成年人就有一个患高血压。由于高血压是无症状的，因此在考虑高血压之前，可能已经发生了不可逆的心血管并发症。
在血压调节中发挥主要生理作用的一种酶是血管紧张素转化酶(ACE：肽酰二肽水解酶，EC 3，4，15，1)。ACE利用将非活化的十肽血管紧张素I转化为血管收缩性盐储留肽血管紧张素II的能力(Skeggs et al.，1956)通过肾素血管紧张素系统，以及利用失活血管舒张剂和促钠尿排泄九肽、血管舒缓激肽(bradykinin)的能力(Yang et al.，1970)通过血管舒缓素-激肽系统(kallikrein-kinin system)参与血压的增加。
因此抑制ACE活性提供了降低血压的手段。
Ferreira(1965)发现了第一个强力和特异的ACE活性抑制剂，他证明巴西箭蛇(Brazilian arrowhead viper)毒液的提取物Bothrops jararaca能够加强平滑肌的收缩并引起由血管舒缓激肽诱导的低血压和毛细血管通透性增加。随后从一些蛇的毒液中分离了所谓的“血管舒缓激肽增强因子”(BPF’s)，并发现其为短肽，且是ACE的强力抑制剂。
也已经制备了一类合成的ACE抑制剂，并已上市销售，第一个产品为卡托普利(captopril)(D-2-甲基-3-巯基氧丙基-L-脯氨酸)。尽管许多这类药物对于降低高血压的作用是无可估量的，但长期应用会伴随一些不需要的副作用。因此仍需要新的控制高血压的治疗剂。
已知通过对多种来源的蛋白进行蛋白水解消化可获得ACE抑制肽，该蛋白的来源包括鱼(例如欧洲专利第1094071号)、动物奶蛋白(例如公开号为WO 99/65326的国际申请)以及植物(例如，Kawakami et al.，(1995)；Yano et al.，(1996)；Pedroche et al.，(2002)；Wu et al.，(2002))。多数所描述的用于从植物蛋白中获得ACE抑制肽的方法在水解之前均包括对所述蛋白进行初步纯化的步骤，其增加了所述方法的成本和复杂性并因此增加了产品的成本。
因此仍需要从植物材料中制备ACE抑制剂组合物的改进方法和高特异活性的ACE抑制肽的其它来源。
发明概述
根据本发明的一个实施方案，本发明涉及制备含血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的水解物方法，包括：
将基本不含油的种子粗粉(meal)或细粉(flour)与有机溶剂接触，
从所述的溶剂中分离出所述的粗粉或细粉，及
用至少一种蛋白水解酶处理所述的粗粉或细粉来产生含ACE抑制肽的水解物。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及从亚麻或油菜籽中制备含ACE抑制肽的水解物的方法，包括：
用至少一种蛋白水解酶处理基本不含油的亚麻子粗粉或基本不含油的油菜种子粗粉来产生含ACE抑制肽的水解物。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及通过上述方法制备的含ACE抑制肽的水解物。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及通过部分蛋白水解消化亚麻粗粉或油菜籽粗粉制备的含ACE抑制肽的水解物。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及通过干燥本发明的水解物制备的粉末。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及包含本发明水解物的可食用产品。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及包含肽Val-Ser-Val和Phe-Leu中至少一种和药物可接受的载体的药物组合物。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及序列式Val-Ser-Val的肽。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及序列式Phe-Leu的肽。
根据本发明的另一实施方案，本发明涉及抑制哺乳动物的ACE活性的方法，包括对所述哺乳动物给予有效剂量的本发明水解物或粉末或可食用产品或组合物。
这种对ACE活性的抑制可用于降低所述哺乳动物中已升高的血压。因此本发明提供用于治疗包括人类的哺乳动物个体的血压升高的方法和组合物。
本发明还提供本发明的水解物或粉末或可食用产品或组合物用于制备治疗包括人类的哺乳动物个体的血压升高的药剂的用途。
附图的概述
参考附图本发明对一些实施方案进行了描述，其中：
图1所示为对于多种作用于油菜籽粗粉的蛋白水解酶，作为孵育时间(X轴)函数的ACE抑制活性(Y轴)。
图2所示为对于多种作用于油菜籽粗粉的蛋白水解酶，作为孵育时间(X轴)函数的水解程度(DH-Y轴)。
图3所示为从Sephasil肽C18 12μ ST4.6/250柱获得的部分(fraction)在214nm(mAU)处的吸光度。
发明的详细描述
本发明提供用于从诸如粗粉和细粉的植物材料中制备ACE抑制组合物的改进的方法和新的来源，而不需首先从所述的植物中分离出高度富集或纯化的蛋白部分。
本发明使用的“粗粉”指磨碎的油提取后的油料种子的非油部分，而“细粉”指磨碎的诸如谷类(cereal)和豆类(legume)的非产油植物的种子。本发明方法可应用于例如油料种子粗粉，该油料种子粗粉可通过诸如对油料种子进行轧胚或压榨(expelling)，并对所产生的粗粉进行脱脂和溶剂提取的常规方法来制备；以及用于细粉，该细粉可从诸如谷类、假谷类(pseudocereals)和豆类的非油料种子中获得。
本发明所用“水解物”指将种子粗粉或细粉蛋白水解或部分蛋白水解后获得的消化混合物。
根据本发明的实施方案，本发明人发现，在蛋白水解消化产生ACE抑制肽之前用有机溶剂提取种子粗粉或细粉，得到具有增强的ACE抑制活性的水解物。通过采用有机溶剂提取步骤，本发明人能够克服将植物材料直接进行蛋白水解消化时所遇到的低产率和低ACE抑制活性的问题。表1显示，对于所检验的大多数植物材料，在蛋白水解消化前对所述粗粉或细粉进行有机溶剂提取能改进所述水解物的IC50和蛋白含量。
欲进行处理的植物材料可来自油料种子，例如亚麻、油菜籽/油菜籽(canola/rapeseed)、大豆、棉籽、向日葵、花生或芥菜(mustrad)；来自豆类(legume)种子，例如大豆(soybeans)、豌豆(peas)、扁豆(lentils)、豆(bean)或鹰嘴豆(chichpeas)的种子；或来自谷类，例如小麦、燕麦、大麦、黑麦或诸如芥麦的假谷物。
对于油料种子，例如油菜籽、亚麻和大豆，可通过将种子用常规的脱脂和油类提取方法处理可得到基本不含油的种子粗粉，诸如压榨、用溶剂提取进行压榨、以及轧胚和溶剂提取的油类提取方法，如商品植物油工业实践中所采取的方法。所产生的材料通常含有少于1％的脂肪。种子诸如谷类和假谷类(例如，小麦、燕麦、黑麦、荞麦)是天然的基本不含油的，并且不需要脱脂。
土壤植物材料可以颗粒的形式存在，其通过将全种子或脱脂粗粉进行粗碾磨，随后进行过筛，根据大小将颗粒分为粗(10-20目)、中(20-40目)或细(40-80目)颗粒；或者所述的土壤植物可以为细粉形式，其通过碾磨成非常细的颗粒来制备，使97％的所述产物能够通过100目筛子。在制备所述的细粉之前除去在蛋白中通常含量较低的外壳、外皮和麸糠。
适合用于所述粗粉或细粉提取的有机溶剂包括低级醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，或丙酮或乙酸乙酯。优选乙醇。所述醇可单独使用或以含至少50％醇的含水混合物使用。优选65％-75％的乙醇。
所述有机溶剂可与所述种子粗粉或细粉以液体∶固体比例8∶1至约25∶1进行混合，优选约10∶1至约20∶1。
在约20℃至所述有机溶剂沸点的温度下，将所述种子粗粉或细粉保持与有机溶剂接触约1小时至约24小时。在一个实施方案中，溶剂处理在室温(25℃)下进行24小时，或在更高温度下进行更短的时间，例如在50℃下进行3小时。在接触阶段，可对所述的粗粉/溶剂浆液进行搅拌或搅动。
利用任何诸如离心、过筛、过滤或倾析的适合的常规方法从所述的液体溶剂相中分离出处理的粗粉或细粉，并通过水洗来减少残留的有机溶剂水平。随后所述材料准备进行蛋白消化来产生ACE抑制肽。可选择地，可通过热气干燥去除残留的有机溶剂来产生可贮藏用于进一步再润湿和蛋白水解消化的粗粉或细粉。
通常通过本领域所属技术人员公知的方法以及本发明的进一步描述来完成用于产生所述ACE抑制肽的种子粗粉或细粉的蛋白水解消化。适合的蛋白水解酶包括酸性、中性和碱性蛋白酶和肽酶，包括丝氨酸肽链内切酶和金属肽链内切酶，或其混合物。可使用例如表2所列的多种商业销售的蛋白水解酶。本领域所属技术人员可容易地确定适合所用特定蛋白水解酶的消化条件。
对具体植物材料，测定何种蛋白水解酶产生的水解物的ACE抑制IC50最低也是本领域所属技术人员公知的，并如实施例和图1所述。例如，已发现当用于亚麻子粗粉和大豆粗粉的消化时，嗜热菌蛋白酶在所测试的酶中可产生最佳的抑制活性。可进行一段时间的蛋白水解来产生ACE抑制IC50最低的水解物。通常，约3小时的消化可产生最大的抑制活性。
如果将所述水解物用于诸如食物或食品补充剂的可食用产品时，为保留一些所述植物蛋白的食用价值，需要在达到最大的ACE抑制活性前，终止所述的蛋白水解消化。对于一些植物材料，蛋白水解消化可能会同时产生味道较差的消化产物。在这种情况下，为控制这种较差的味道，需要在达到最大的ACE抑制活性前终止所述的蛋白水解消化。
在一个实施方案中，本发明所述水解物具有低于200μg粉末/ml的ACE抑制IC50。在另一实施方案中，所述水解物的IC50低于100μg粉末/ml、或低于60μg粉末/ml或低于50μg粉末/ml。
通常，所述蛋白水解酶以约0.25％至约8.0％w/w(酶∶蛋白含量)的浓度使用。
在另一实施方案中，所述的蛋白水解酶以约0.5％-约4.0％的浓度使用。
通过适合的方法来终止所述的蛋白水解消化，例如所述酶的热失活活或将所述消化混合物的pH调节到酶活性pH范围之外。这些方法是本领域所属技术人员公知的。过滤或离心所产生的水解物，例如在沉降式离心机中，来去除残留的粗粉和细粉。
根据本发明的另一实施方案，本发明提供从亚麻和油菜籽粗粉中制备含ACE抑制肽的水解物的方法，该方法利用蛋白水解酶消化所述粗粉来产生具有高度特异活性而不需进一步纯化的含ACE抑制肽的水解物。以往没有显示亚麻和油菜籽是ACE抑制肽的来源。如上所述选择所述的蛋白水解酶，并进行消化。如上所述，在蛋白水解消化之前可任意地将所述亚麻或油菜籽粗粉用有机溶剂进行提取。
在对种子粗粉或细粉进行消化产生ACE抑制肽，并从残余的粗粉或细粉中分离出所述的水解物后，可将该水解物用于可食用的产品或可进行喷雾干燥来产生适于用作可食用产品或药物的水溶性粉末。蛋白和水解蛋白制剂作为可食用产品的用途及将其掺入食品中或作为食品补充剂的用途是食品加工领域所属技术人员公知的，例如，Clemente，A(2000)“Enzymatic Hydrolysates in Human Nutrition”，in Trends in Food Science&Technology v.11，pp.254-262所述。
在一个实施方案中，除进行常规的控制细菌污染的步骤，例如瞬间巴氏灭菌或微生物过滤外，不需进一步加工即可将所述水解物用作可食用的产品。
液体或粉末形式的本发明的水解物可用作补充饮料，例如软饮料、碳酸饮料、即混合饮料、奶和奶饮料及其衍生物；及食品，例如沙司、调味品、色拉调料、水果汁、糖浆剂、甜点(例如，布丁、明胶、糖霜和填充物、烤制品和诸如冰激凌和冰冻果子露的冷冻甜点)，软冷冻产品(例如，软冷冻奶油、软冷冻冰激凌和酸奶酪、诸如奶制或非奶制炼乳的软冷冻炼乳)、油类和乳化产品(例如，起酥油、人造黄油、蛋黄酱、黄油和色拉调料)、糖果和条形糖果(confection)、谷物食品和咀嚼口香糖片。
很早就已经认识到血压过度升高是一种威胁生命的疾病状态。而最近证明甚至轻度高于正常值的血压也会产生有害的作用。
目前临床定义的需要医学干预的高血压是收缩血压为140mm汞柱或更高(在30岁以上的成年人群中的发生率约为20％)。然而目前一些流行病学家定义了高血压的次级或“预防性模型”，将收缩压高于120mm汞柱定义为人群应采取措施降低其血压和相关心血管疾病发生风险的临界点。血压值在120-140mm汞柱范围的人群一般不认为自己为病态，并因此不太可能接受药物为基础的治疗。然而这类人群中正在寻找非药物选择来降低其中等升高的血压的人口百分率不断上升(Potential benefitsof functional foods and nutraceuticals to reduce the Risk and Costs ofDiseases in Canada.B.J.Holub.Report to AAFC 2002)。
本发明的水解物和粉末提供抗高血压试剂，其是这种血压轻度升高的病例的理想试剂，并可与食物一起或作为食物的一部分食用。
与以往发现的来自奶或乳清的ACE抑制产品降低人血压的作用相比，本发明的水解物具有约40-60μg/ml的IC50值，可以每天约2至5gm的初始剂量给予人类个体。当观察到血压降低作用时，可根据需要对这一剂量进行调整。本领域所属技术人员可以理解，根据较高或较低的IC50值的水解物来调整所述的剂量。
所述的水解物也可组方成片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、糖浆剂、悬浮剂或可注射的溶液。
由本发明所述方法产生的水解物具有相当于或高于商业销售的乳清水解物的ACE抑制活性。当利用本发明所述的ACE抑制分析进行分析时，所述商业销售的乳清产物BioZate(Davisco Foods International)的ACE抑制IC50为137μg粉末/ml。如本发明所示，不需采用任何后续的纯化策略，一些植物材料可产生ACE抑制IC50值显著低于所述乳清产物的蛋白水解物，其因此具有较高的抑制活性。
如实施例12所述，对油菜籽粗粉蛋白水解消化所得的水解物进行进一步纯化，得到两部分，各含有单一的纯化ACE抑制肽。这些以往没有描述为ACE抑制剂的肽具有氨基酸序列Val-Ser-Val和Phe-Leu。
本发明含ACE抑制肽的水解物可进一步加工得到特异活性更强的部分或如上所述的纯化的单一肽，其可作为可食用的产品或药物使用。
如果需要，通过本发明实施例所述的超滤作用可进一步强化本发明水解物的ACE抑制活性。
已经发现，具有高多糖含量的种子，如亚麻和大麦，可产生高粘度的水解物。当水解物的粘度高于约10×10-3PaS(依据在25℃时的5％水溶液的粘度和200(I/s)的剪切率)，可使用孔径高达100,000MWCO的超滤膜，但优选孔径高达10000的膜。
对低粘度的水解物，如从油菜籽中获得的水解物，可使用孔径高达10000MWCO的膜，优选孔径高达3000MWCO的膜。
实施例
以下实施例仅是为了说明目的提供的，而不是对本发明范围的限制。
本发明涉及化学、分子生物学、蛋白和肽生物化学以及免疫学的方法，但没有进行详细描述，这些方法的例子在科学文献中有报道并且是本领域所述技术人员公知的。
试剂
从以下来源获得化学药品和酶：血管紧张素转化酶(来自兔肺)和HHL(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)；HA和三氟乙酸(TFA)(AcrosOrganics，New Jersey，USA)；HPLC级乙腈(Fisher Scientific，Nepean，ON，Canada)。其它的所有化学药品均是试剂级的，并且也是从Fisher Scientific获得的。通过Milli-Q系统(Millipore，Bedford，MA，USA)产生HPLC级水。
方法
ACE抑制活性的测定
通过改进的新HPLC方法(Wu，J.P.et al.，(2002))检测了离体的抗高血压活性(ACE抑制活性)，所述新HPLC方法是Cushman与Cheung(1971)方法的改进方法。该方法利用反相高效液相色谱(HPLC)来分离和量化所述的ACE催化产物马尿酸(HA)。在Symmetry C18柱中，利用三氟乙酸(TFA)/乙腈和TFA/水的混合物作为溶剂通过梯度洗脱分离马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)和HA。与常规分光光度法比较，该新HPLC方法避免了使用乙酸乙酯萃取HA，并使得可将ACE反应混合物直接注射到该HPLC柱中。
用于HPLC分析的样品制备
对于直接HPLC分析，总的反应体积为70μl，由50μl的2.17mMHHL、10μl的2mU ACE和10μl不同浓度的蛋白水解物(全部由100mM硼酸盐缓冲液制备，含有300mM NaCl，pH 8.3)组成。对于对照试验，使用10μl缓冲液。将所述HHL和蛋白水解物或对照缓冲液混合，并在1.5ml聚乙烯微型离心管中于37℃保持10分钟。将ACE也在37℃保持10分钟，然后将所述两种溶液在450rpm连续搅拌下，在EppendorfThermomixer R(Brinkmann Instruments，Inc.New York，美国)中混合，并在37℃孵育。30分钟后，通过加入85μl的1N HCl来终止所述反应，并通过0.45μm尼龙注射器式过滤器过滤所述的溶液以用于反相RP-HPLC(RP-HPLC)分析。
高效液相色谱
在配备有996光电二极管阵列检测器(996 Photodiode Array Detector)的2690 Separation Module(Waters Inc，MA.美国)上进行HPLC。利用Millennium色谱管理软件2.15版(Chromatography Manager Softwareversion 2.15)(Waters Inc，MA.美国)进行设备控制、数据采集和分析。在Symmetry C18柱(3.0×150mm，5pm，Waters Inc.，MA，美国)上分析样品(10μl)，并在228nm检测HA和HHL。用两种溶剂体系：(A)0.05％的三氟乙酸(TFA)水溶液和(B)0.05％TFA的乙腈溶液对所述柱进行洗脱(0.5ml·min-1)，首先用5-60％的乙腈梯度溶液洗脱10分钟，并在60％的乙腈保持2分钟，然后返回到5％乙腈1分钟。随后以恒定的0.5ml·min-1流速无梯度洗脱(isocratic elution)4分钟。使用新鲜制备的外部标准HA样品来计算有蛋白水解物(HA水解物)存在或无蛋白水解物(HA对照)存在下ACE反应形成的HA的浓度，空白样品按照如下制备：首先在孵育前加入HCl使ACE失活。
ACE抑制活性计算
根据以下方程式计算抑制活性：
抑制活性(％)＝[(HA水解物-HA对照)/(HA对照-HA空白)]×100
IC50值定义为产生50％的ACE活性抑制时所述反应混合物中的抑制剂的量，如上所述进行检测。利用至少5个不同浓度的相同水解物样品来绘制抑制活性(％)对蛋白水解物浓度(μg粉末/ml)的曲线图。利用微软Excel 97 SR-1软件(微软公司)进行回归。
蛋白水解程度(DH)的测定
在碱性或中性条件下，通过加入碱来控制和维持恒定的pH。以规定的时间间隔记录碱的加入量，并用于计算水解程度(DH)。根据Adler-Nissen(1986)公式，从用于维持恒定pH的碱的体积和摩尔浓度计算出DH，并表示为肽键断裂数(h)对单位重量的总肽键数的百分比率。
在酸性水解条件下，根据Adler-Nissen J.(1979)方法确定水解程度(DH)。
水解物样品的制备
在不同时间间隔采集水解反应混合物的样品并快速转移至检测管中。对于每种样品，将每份2.0ml样品快速用吸管转移到两只含有10ml的1％NaDodSO4的检测管中，并通过浸入水浴中将所述检测管保持在75℃，并摇动至少15分钟来分散所述的蛋白水解物。
每一检测管的内容物定量转移至50ml容量瓶中并利用1％NaDodSO4稀释到该体积。通过TNBS反应来分析游离氨基基团的含量，并表示为亮氨酸等价物。
TNBS反应
将0.25ml制备的样品或空白(1.0％SDS)溶液或标准溶液与pH 8.2的2.0ml的磷酸盐缓冲液混合。
加入2ml的0.1％TNBS溶液，摇动所述的检测管，并在50℃的水浴中放置60分钟，用铝箔覆盖。
加入4.00ml的0.1N HCl来终止所述的反应，30分钟后在340nm处检测相对于水的吸光度。
利用以下改进的Beak等人的方法(1995)来计算所述的DH：
DH＝(Lt-L0)/(Lmax-L0)×100
其中Lt为在时间t释放的α-氨基酸的量；L0为原始油菜籽溶液中α-氨基酸的量；及Lmax为酸性水解(在100℃、6N HCl中进行24小时)后油菜籽粗粉中α-氨基酸的最大量。
实施例1.从脱脂油菜籽粗粉制备ACE抑制肽(ACEIP)的酶筛选
在配备有搅拌器、温度计和pH电极的反应容器中分批进行所述的反应。将商业销售的溶剂提取压榨饼油菜籽粗粉(Canbra Foods，Lethbridge，Alberta，加拿大)(31.16g)研磨并通过40目筛子(蛋白含量：40.1％)，并利用磁力搅拌器与蒸馏水充分混合形成250ml的5％蛋白浆。所评价的蛋白水解酶以及其适宜的pH和温度条件如表2所列。将所述浆液的pH调整到适合待检测酶的pH和温度。加入酶(4％，w/w，以浆液的蛋白含量为基础)来引发反应。通过加入0.5N NaOH或1N HCl来维持所述反应pH值的恒定。在特定的时间间隔记录碱的加入体积用于水解程度(DH)的计算。
在30、60、120、180、300分钟的间隔采集样品，并在沸水中加热15分钟来使酶失活。随后将所述浆液的pH调节到pH 4.0左右来沉淀未水解的蛋白、大肽和所有的固体颗粒。在10,000×g离心25分钟来去除所述的沉淀。随后将所产生的澄清的上清冻干，并储存在-5℃直到进一步的分析。利用相同的方法制作了对照(无蛋白水解酶)样品。随后对冻干的上清进行ACE抑制活性评价。
通过不同的酶消化的油菜籽蛋白水解物的ACE抑制活性(％)如图1所示。结果显示，所述的ACE抑制活性(％)差别较大，从0％至50.5％，平均值为28.4±13.47％。Alcalase 2.4从油菜籽粗粉产生最强力的ACE抑制水解物。产生显著的ACE抑制活性的其它酶包括蛋白酶S、蛋白酶M、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。尽管没有包括在此研究中，随后对嗜热菌蛋白酶的检测表明其产生与所观察到Alcalase 2.4水解物具有相似ACE抑制活性的肽成分。通常，优选3小时消化后产生具有＞35％ACE抑制作用的水解物的任何蛋白水解酶。在未水解的对照油菜籽粗粉样品中没有检测到ACE抑制活性，表明通过蛋白水解酶作用使油菜籽蛋白断裂从而形成ACE抑制肽。当将Alcalase 2.4和蛋白酶M的孵育时间延长至24小时时，孵育超过5小时后没有显著的ACE抑制活性增加。
水解程度(DH)与孵育时间的关系如图2所示；DH随孵育时间的增加而增加。碱性蛋白酶和Alcalase 2.4具有最高的DH值。蛋白酶M和蛋白酶S酶处理具有中度的DH值，而其对应的水解物显示相对高的ACE抑制活性。胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶具有最低的DH值，这表明这些酶具有非常有限的水解油菜籽蛋白的能力。在DH值与ACE抑制活性间没有正相关性。
用不同水解酶对油菜籽粗粉进行了后续处理的研究。用Alcalase 2.4水解3小时后，将所述溶液的pH和温度分别调整到对其它4种能够产生具有较高ACE抑制活性的水解物的酶中每一种的最佳的条件。随后加入第二种酶并将所述溶液进一步孵育3小时。两种不同酶的后续水解的蛋白水解物中，只有产生自Alcalase 2.4和碱性蛋白酶的后续水解产物，其IC50值(40.0μg粉末/ml)与单一酶产物(Alcalase 2.4＝68.6μg粉末/ml)、或任何其它酶自身的产物(55.7-78.6μg粉末/ml)比较得到显著改善。
实施例2亚麻子粗粉酶水解物的制备
如实施例1所述，反应在反应容器中分批进行。将商业销售的溶剂提取压榨饼亚麻子粗粉(CanAmera Foods，Atton，Manitoba，Alberta)(50g)研磨并通过40目筛子(蛋白含量：33.9％)，并利用磁力搅拌器与蒸馏水充分混合形成750ml的浆液。为进行Alcalase 2.4酶水解，将浆液pH值调节至8.0、温度调整到60℃。以4％(w/w，以浆液的蛋白含量为基础)的比例加入所述酶。在反应过程中，通过加入0.5N NaOH来维持所述浆液pH值的恒定。利用6N HCl将pH调整到4.0左右来使所述酶失活。在6,000×g离心25分钟来去除未水解的蛋白、大肽和不溶物质。将残余物在250ml水中重悬，并在相同的条件下离心。随后将所产生的澄清的上清合并、冻干、并储存在-5℃直到进一步的分析。同时，在相同条件下制备了对照提取物(无酶)。所述水解物的产率为53.54％(重量比)，蛋白含量为39.9％，ACE抑制IC50为64.3μg粉末/ml。
如实施例1所示，随后对多种蛋白水解酶进行了评价；亚麻的结果与油菜籽粗粉的结果相似。
实施例3从大豆粉制备ACE抑制肽
利用磁力搅拌器将Nutrisoy 7B大豆粉(87g，Archer Daniels MidlandCO.，Decatur，Illinois)与蒸馏水充分混合形成600ml浆液。如实施例2所述，为进行Alcalase 2.4酶水解，将所述浆液调整到pH 8.0、温度60℃。以4％的比例(w/w，以浆液的蛋白含量为基础)加入所述酶。在反应过程中，通过加入0.5N NaOH来维持所述浆液的pH值的恒定。利用6N HCl将pH调整到4.0左右使所述酶失活。通过6,000×g离心25分钟来去除未水解的蛋白、大肽和其它多聚物。将残余物在300ml水中重悬，并在相同的条件下离心。随后将所产生的澄清的上清合并、冻干、并储存在-5℃直到进一步的分析。由Alcalase 2.4产生的水解物的ACE抑制IC50为126.3μg粉末/ml，产物产率为82.8％W/W。
实施例4从豌豆粉和燕麦粉制备ACE抑制肽
在与实施例2所述相同的条件下将豌豆粉和燕麦粉(Parrheim Foods，Saskatoon，加拿大)与Alcalase 2.4孵育。所述的燕麦粉水解物在所有检测的植物材料中ACE抑制活性(1200μg粉末/ml)最弱。豌豆粉的ACE抑制活性为IC5087.1μg粉末/ml。
实施例5从全荞麦粗粉制备ACE抑制肽
从当地的食品杂货店中购得荞麦，将其研磨并通过40目筛子。如实施例2所述，用alcalase 2.4L或嗜热菌蛋白酶水解所述样品粗粉。由嗜热菌蛋白酶产生的蛋白水解物的ACE抑制IC50为78.6μg粉末/ml、产率为18％，而Alcalase 2.4L处理的水解物的ACE抑制IC50为174.3μg粉末/ml、产率为37.1％。
实施例6乙醇处理的油菜籽粗粉ACE抑制水解物的制备
将如实施例1所述的商业销售的脱脂油菜籽粗粉(31.2g)，研磨并通过40目筛子，以1∶10(重量/体积)的比例用70％(v/v)乙醇∶水溶液提取，同时在室温下搅动12小时或在50℃下3小时。回收所述的粗粉，用蒸馏水洗涤并利用Alcalase 2.4、蛋白酶M、蛋白酶S或Alcalase 2.4和碱性蛋白酶的后续处理，每种酶处理不超过3小时(组合孵育共计6小时)来进行水解。随后通过离心将乙醇处理油菜籽粗粉酶消化物分离产生含有水解的肽的上清以及含有未水解蛋白和残余粗粉的沉淀。这些水解物显示40.0μg粉末/ml至64.3μg粉末/ml的ACE抑制活性(IC50)(表3)。除与蛋白酶S孵育产生的水解物蛋白含量仅为28.7％之外，从乙醇处理粗粉制备的水解物的蛋白含量从41.7％至54.6-60.4％显著增加。
实施例7.乙醇处理脱脂亚麻子粗粉酶水解物的制备
将如实施例2中的脱脂亚麻子(50g)，研磨并通过40目筛子(蛋白含量：33.9％)，用70％(v/v)乙醇∶水溶液(1/15.w/v)在50℃下处理3小时。通过过滤回收所述的提取亚麻子，并利用磁力搅拌器将其分散在水中形成750ml浆液。如实施例2所述用Alcalase 2.4来产生酶水解物。依据产物重量，所述乙醇处理的脱脂亚麻子水解物的产率为52.0％，蛋白含量为45.5％，ACE抑制IC50为51.4μg粉末/ml。
根据Westcott&Muir(美国专利第5,705,618号)所报道的木聚糖(SDG)提取后，将回收的脱脂亚麻子粗粉也用于ACE抑制水解物的制备。利用Alcalase 2.4处理这种材料得到的蛋白水解物具有类似的ACE抑制活性(IC50＝55.7μg粉末/ml)，表明从所述粗粉中回收有价值的植物化学SDG并没有干扰从残余粗粉制备生物活性肽的能力。
实施例8.利用Alcalase 2.4和/或嗜热菌蛋白酶从乙醇处理的大豆粉制备ACE抑制肽
用70％乙醇在50℃将Nutrisoy 7B大豆粉(87g，Archer DanielsMidland CO.，Decatur，Illinois)处理3小时。用磁力搅拌器将过滤的残余物与蒸馏水充分混合得到600ml浆液。为进行Alcalase 2.4L或嗜热菌蛋白酶的消化，将所述的浆液调整到适合的pH和温度，如表2所述。以4％(w/w，以浆液的蛋白含量为基础)加入Alcalase 2.4酶或以1％(w/w，以浆液的蛋白含量为基础)加入嗜热菌蛋白酶。在反应过程中，如果需要通过加入0.5N NaOH来维持所述浆液的pH值的恒定。利用6N HCl将pH调整到4.0左右来使所述酶失活。通过6,000×g离心25分钟来去除未水解的蛋白，大肽和其它多聚物。将残余物在300ml水中重悬，并在相同的条件下离心。随后将所产生的澄清的上清合并、冻干、并储存在-5℃直到进一步的分析。由嗜热菌蛋白酶产生的水解物的ACE抑制IC50为42.9μg粉末/ml，产率为64.7％；而Alcalase 2.4处理产生的水解物的ACE抑制IC50为118.1μg粉末/ml，产率为55.7％。
实施例9.利用嗜热菌蛋白酶从亚麻子制备ACE抑制肽
将如实施例2所述的脱脂亚麻子粗粉(50g)，研磨并通过40目筛子(蛋白含量：33.9％)，并利用磁力搅拌器与蒸馏水充分混合形成750ml浆液。将所述浆液的pH调整到适合以下酶的pH和温度：嗜热菌蛋白酶(39单位/mg固体)，或与Alcalase 2.4孵育3小时并随后与嗜热菌蛋白酶进一步孵育3小时。以4％(w/w，以浆液的蛋白含量为基础)的比例加入Alcalase2.4酶或以1％(w/w，以浆液的蛋白含量为基础)的比例加入嗜热菌蛋白酶。反应引发后，如果需要通过加入0.5N NaOH来维持所述浆液的pH值的恒定。利用6N HCl将pH调整到4.0左右来使所述酶失活。通过6,000×g离心25分钟来去除未水解的蛋白，大肽和其它多聚物。将残余物在250ml水中重悬，并在相同的条件下离心。随后将所产生的澄清的上清合并、冻干、并储存在-5℃直到进一步的分析。由嗜热菌蛋白酶产生的水解物的ACE抑制IC50为37.1μg粉末/ml。由嗜热菌蛋白酶和Alcalase 2.4连续水解产生的水解物的ACE抑制IC50为34.2μg粉末/ml。对于从亚麻子制备ACE抑制肽，与单独使用Alcalase 2.4酶比较嗜热菌蛋白酶是更有效的酶，Alcalase 2.4产生的水解物的IC50为64.3μg粉末/ml。
实施例10油菜籽ACE抑制肽的超滤加工
将脱脂油菜籽粗粉(62.3g)研磨并使其通过40目筛子，随后用70％的乙醇(v/v)以1∶10的比例W/V)进行处理。过滤除去乙醇水溶液后，用Alcalase 2.4对所得的残余物进一步消化得到乙醇处理的油菜籽蛋白水解物。所得蛋白水解物用截留分子量(MWCO)超过10000、3000、1000的膜进行超滤来进一步纯化。利用Amicon Ultrafiltration Cell Model 8200(Amicon Division，W.R.Grace&Co.，Beverly，美国)，通过对所述膜渗余物侧的溶液施加35PSI压力的氩气来进行超滤。利用10000MWCO膜将所述肽水解物初步分离为渗余物和渗透物部分。随后将10000膜分离的渗透物部分在3000MWCO膜上进行超滤，得到3000MWCO渗余物和3000MWCO渗透物。通过在1000MWCO膜上对所述3000MWCO渗透物进一步分离产生1000MWCO渗透物和1000MWCO渗余物。进行第二组试验，其中在没有进行10000MWCO膜预处理下，将全部的蛋白水解物在3000MWCO和1000MWCO膜上进行超滤。为进行ACE抑制IC50检测，收集渗透物和渗余物并冻干。与对应的渗余物部分比较，所有的含肽渗透物具有较高的ACE抑制活性。发现在1000MWCO膜上对蛋白水解物直接超滤所获得的渗透物的ACE抑制活性(IC50＝25.7μg粉末/ml)最高(表4)。通过直接用3000MWCO膜超滤或在10000MWCO膜超滤后进行3000MWCO膜超滤获得的肽部分也有较高的ACE抑制活性(IC50＝30.0-31.4μg粉末/ml)。由于3000MWCO渗透物产率高于1000MWCO膜获得的产率，因此进行1000MWCO的步骤益处不大。由于膜的流量随孔径的降低而降低，因此利用3000MWCO膜可获得最佳的产率。
实施例11亚麻子ACE抑制肽的超滤处理
如实施例10所述对实施例7和9中制备的液体水解物通过截留分子量(MWCO)超过10000和100000的膜进行超滤。分别进行超滤，并收集和冻干两者的渗透物和残余物用于ACE抑制IC50测定。如上述实施例，所有含肽的渗余物的ACE抑制活性高于渗余物中发现的活性(表5)。该亚麻子水解物的粘度高于油菜籽蛋白水解物的粘度，因此用3000和1000MWCO的膜进行超滤是不可行的。当用10K和100K MWCO膜进行操作时，由于在所述膜表面形成膜，因此进行超滤时遇到了困难。可通过A)搅拌和加热所述的溶液至高于40℃的温度；B)将pH调整至pH 3-4；或C)A与B的组合来避免形成所述膜。与所述原始亚麻子水解物的ACE抑制IC50值(64.2μg粉末/ml)比较，由于使用大孔径的100K MWCO膜，大肽可通过所述膜进入渗透物中，因此这些超滤步骤没有获得显著的改进。在乙醇处理的水解物的情况下，与原始的51.4μg粉末/ml值比较，所述渗透物具有30.0和35.7μg粉末/ml的改进IC50值，表明可借助通过10K或100K MWCO膜来改善从乙醇洗涤的脱脂粗粉制备的ACE抑制肽成分的活性。
实施例12通过反相色谱对从油菜籽蛋白水解物制备的高生物活性ACE抑制肽的纯化和鉴定
将如实施例6中制备的脱脂油菜籽粗粉Alcalase 2.4水解物以100mg/ml浓度溶于1％(v/v)的乙酸水溶液中用于制备色谱。将由三根PrepPak40mm Cartridges(Bondapack C-18 15-20μm，40×100mm，Waters)和保护柱(40×10mm)组成的分段柱与PrepLC 4000系统(Waters)配接。利用Millennium色谱管理软件2.15版(Waters Inc，MA.美国)进行设备控制、数据采集和分析。通过溶剂传输系统来自动注射所述样品(20ml)。利用2487吸光度检测仪(2487 Absorbance Detector)在280nm处监测吸光度谱。利用Waters成分收集器(Waters Fraction Collector)自动收集各成分。用两种溶剂体系来洗脱所述柱(50ml·min-1)：A：含有1％乙酸的水和B：甲醇(100％)(表6)。
对所有收集的成分进行ACE抑制活性的评价。通过制备色谱对全部32.6g的油菜籽粗粉Acalase水解物进行分离，得到2.8g(8.5％)活性最高的肽组分，其ACE抑制IC50为2.0μg粉末/ml。
通过Unicorn系统(Pharmacia Biotech，瑞典)控制的配接有
Figure G200380107565XD00171
explorer 10XT系统的SephasilTM Peptide C18 ST 10/250柱对从制备C-18得到的活性成分作进一步纯化。用两种溶剂体系：A：20mm磷酸二氢钠缓冲液(0.05％TFA)和B：20mm磷酸二氢钠(含0.05％TFA的80％乙腈)，以5ml/min的流速对所述柱进行洗脱，在5倍柱容积(CV)的5％B无梯度洗脱后，以15CV从5％B-20％B进行梯度洗脱。注射体积为500ml的200mg/ml活性最高的制备色谱成分的溶液。在214nm处检测吸光度，并收集所得成分。共收集到21组成分，其中活性最高的成分为F13和F18。在重复注射后，获得了1.30g F13和0.85g F18，其ACE抑制活性IC50值分别为38.6和312.9μg粉末/ml。由于在所述色谱分离中使用了不挥发的缓冲液，这些IC50值高于原料的值。
在SephasilTM Peptide C18 ST 10/250柱(粒度：12μm，PharmaciaBiotech，瑞典)上，利用两种溶剂体系：A水(含0.1％TFA)和B乙腈(含0.1％TFA)对每一种F13和F18进行再次色谱分离，以7个CV的10％B-30％B梯度溶液和5ml/分钟的流速对这些活性组分进行脱盐和进一步纯化。从F13的色谱得到的主要的强力成分的峰鉴定为F13-11，从F18色谱得到的则为F18-5。F13-11的产出为18.32mg，ACE抑制IC50为0.44μg/ml；而F18-5的产出为4.89mg，IC50值为0.37μg/ml。
在SephasilTM Peptide C18 12 ST 4.6/250柱(Pharmacia Biotech，瑞典)上，利用两种溶剂体系：A水(含0.1％TFA)和B乙腈(含0.1％TFA)在10个CV的5％B-40％B梯度和1.5ml/分钟的流速下对组分F13-11和F18-5进一步纯化(图3)。注射体积为30ml 25mg/ml的溶液。在214nm监测吸光度并收集各成分。
通过常压化学电离(APCi)质谱，利用配备有APCi探针、Z-喷射界面、分离模块和光电二极管阵列检测仪(Waters Inc.MA，美国)的Quattro LC液相色谱/质谱仪(Micromass，英国)对从ST 4.6/250柱得到的纯化的单峰成分F13-11a和F18-5a中的肽进行鉴定。利用MassLynx软件(Micromass，英国)进行设备控制和数据分析。在Symmetry C18柱上(2.0×150mm；5mm)色谱分离肽样品(10ml)。利用两种溶剂体系：(A)0.1％甲酸(FA)水溶液和(B)0.1％FA的乙腈溶液来洗脱所述样品(0.3ml·min-1)，首先用5-60％的乙腈梯度溶液进行10分钟，在60％乙腈处维持2分钟，随后返回至5％乙腈维持1分钟。随后对此以0.3ml·min-1恒定流速进行4分钟的无梯度洗脱。以1.5秒的扫描时间记录50-500m/z的阳离子和阴离子强度。分析仪的真空度为2.2e-5托(torr)。生物活性最高的两种肽鉴定为缬氨酸-丝氨酸-缬氨酸和苯丙氨酸-亮氨酸(表7)。以往没有报道这两种氨基酸序列中的任何一种具有ACE抑制活性。
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表1Alcalase 2.4消化的植物水解物的ACE抑制IC 50
  原料   乙醇提取   IC50(μg粉末/ml)   蛋白含量(％)
  油菜籽粗粉   是   41.4   60.4
  油菜籽粗粉   非   68.6   41.7
  亚麻粗粉   是   51.4   45.5
  亚麻粗粉   非   64.3   39.9
  豌豆粉   是   87.1   63.5
  豌豆粉   非   131.4   59.3
  原料   乙醇提取   IC50(μg粉末/ml)   蛋白含量(％)
  大豆粗粉   是   126.3   63.8
  大豆粗粉   非   118.1   55.3
  燕麦粉   是   1198.6   8.3
  燕麦粉   非   1044.3   14.2
表2不同蛋白水解酶对油菜籽粗粉的水解
  通用名   商品名   pH   T(℃)   来源
  Umamizyme   Umamizyme   8   45   Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.日本
  蛋白酶A   蛋白酶A“Amano”2G   7   50   Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.日本
  蛋白酶P   蛋白酶P“Amano”6   10   60   Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.日本
  肽酶R   肽酶R   7   45   Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.日本
  蛋白酶M   蛋白酶M“Amano”   4.5   50   Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.日本
  蛋白酶S   蛋白酶S“Amano”   8   70   Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.日本
  ProleatherFG-F   Proleather FG-F   10   60   Amano Pharmaceutical C.o.，Ltd.日本
  Alcalase 2.4   Alcalase 2.4L   8   60   Novo Nordisk，NorthAmerica，Inc.，NorthCarolina.
  通用名   商品名   pH   T(℃)   来源
  碱性蛋白酶   ENZECO碱性蛋白酶L-FG   10   50   Enzyme DevelopmentCorporation，纽约
  中性蛋白酶   ENZECO中性蛋白酶NBP-L   7   40   Enzyme DevelopmentCorporation，纽约
  胃蛋白酶   猪胃粘膜(PorcineStomach Mucosa)   2   37   Sigma，St.Louis，MO，美国.
  胰腺蛋白酶   牛胰腺(BovinePancreas)   8   37   Worthington BiochemicalCorporation，NJ，美国
  胰凝乳蛋白酶   牛胰腺(BovinePancreas)   8   25   Worthington BiochemicalCorporation，NJ，美国
  嗜热菌蛋白酶   嗜热菌蛋白酶   8   55   Sigma，St.Louis，MO，美国
表3乙醇处理的油菜籽粗粉水解物的ACE抑制IC50和蛋白含量
  酶   IC50(μg粉末/ml)   蛋白(％)   产率(％)
  蛋白酶S   64.3   28.7   19.3
  蛋白酶M   40.0   56.4   32.8
  Alcalase 2.4   68.6   60.4   38.6
  Alcalase 2.4L+碱性蛋白酶   40.0   54.6   45.4
表4.超滤处理的油菜籽水解物的ACE抑制IC50、蛋白含量和产率
  IC50(μg粉末/ml)   蛋白含量(％)   产率(％)
  逐步操作
  10,000渗透物   37.1   59.3   73.5
  IC50(μg粉末/ml)   蛋白含量(％)   产率(％)
  渗余物   54.3   54.0   20.4
  3,000渗透物   30.0   56.3   70.5
  渗余物   50.0   66.2   28.6
  1,000渗透物   30.0   46.9   43.5
  渗余物   31.4   68.5   47.0
  独立操作
  10,000渗透物   37.1   59.3   73.5
  渗余物   54.3   54.0   20.4
  3,000渗透物   31.4   58.9   73.3
  渗余物   52.9   57.0   25.2
  1,000渗透物   25.7   50.3   56.0
  渗余物   52.9   68.0   35.7
表5.超滤后的脱脂亚麻粗粉Alcalase 2.4L水解物产率、蛋白含量和ACE抑制IC50
  IC50(μg粉末/ml)   蛋白含量(％)   产率(％)
  脱脂亚麻子水解物
  100K渗透物   48.6   44.5   53.6
  100K渗余物   54.3   32.1   39.3
  10K渗透物   48.6   44.8   50.9
  10K渗余物   61.4   31.6   39.0
  EtOH处理脱脂亚麻子水解物
  IC50(μg粉末/ml)   蛋白含量(％)   产率(％)
  100K渗透物   30.0   52.3   45.6
  100K渗余物   78.6   37.9   48.8
  10K渗透物   35.7   53.5   54.8
  10K渗余物   45.7   35.1   38.1
表6.PrepLC 4000梯度谱
  时间(分钟)   ％A  ％B   流速(ml/分钟)
  0   100  0   50
  10   100  0   50
  188   55  45   50
  198   100  0   50
  208   100  0   50
  211   100  0   0
表7.从脱脂油菜籽alcalase 2.4水解物中鉴定两种活性最强的ACE抑制肽
  F<sub>13-11</sub>   F<sub>18-5</sub>
  序列   Val-Ser-Val   Phe-Leu
  测定MW   303.21   278.16
  计算MW   303.18   278.16
  IC<sub>50</sub>(μg/ml)   0.44   0.37

Claims (39)

1.制备含血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的水解物的方法，包括：
(a)将基本不含油的种子粗粉或细粉与有机溶剂接触，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙酸乙酯或其混合物；
(b)从所述的有机溶剂中分离出步骤(a)的粗粉或细粉；及
(c)利用至少一种蛋白水解酶处理步骤(b)分离的粗粉或细粉来产生含ACE抑制肽的水解物。
2.如权利要求1所述的方法还包括从所述水解物中分离出所述处理的种子的粗粉或细粉。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述溶剂为乙醇。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述溶剂为含水有机溶剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述的溶剂为70∶30v/v的乙醇∶水。
6.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中将所述种子粗粉或细粉在一定温度下与所述溶剂接触一段时间，其中所述温度为20℃至所述溶剂的沸点，所述时间为1小时至24小时。
7.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中对所述含ACE抑制肽的水解物进行超滤。
8.如权利要求7所述的方法，其中用孔径从1000至100,000MWCO的超滤膜对所述水解物进行超滤。
9.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中将所述水解物干燥形成粉末。
10.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述种子粗粉或细粉来自选自亚麻、油菜籽、棉籽、向日葵、花生、芥菜、豆、小麦、燕麦、大麦、黑麦和荞麦的植物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述豆选自大豆、豌豆、扁豆和鹰嘴豆。
12.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶的浓度为0.25％至8.0％w/w。
13.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶的浓度为0.5％至4.0％w/w。
14.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶是蛋白酶。
15.如权利要求14所述方法，其中所述蛋白酶选自丝氨酸肽链内切酶和金属肽链内切酶。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶是蛋白酶。
17.如权利要求16所述方法，其中所述蛋白酶选自丝氨酸肽链内切酶和金属肽链内切酶
18.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶选自Alcalase 2.4L、碱性蛋白酶L-FG、中性蛋白酶NBP-L、Umamizyme、蛋白酶P Amano 6、肽酶R、蛋白酶M“Amano”、ProleatherFG-F和嗜热菌蛋白酶。
19.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶选自Alcalase 2.4L、碱性蛋白酶L-FG、中性蛋白酶NBP-L、Umamizyme、蛋白酶P Amano 6、肽酶R、蛋白酶M“Amano”、Proleather FG-F和嗜热菌蛋白酶。
20.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶为碱性蛋白酶，且通过加入碱将所述的反应混合物的pH调节至碱性，所述碱选自NaOH、KOH和NH4OH。
21.如权利要求20所述的方法，其中所加入的碱为KOH。
22.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述至少一种蛋白水解酶为酸性蛋白酶，且将所述的反应混合物的pH调节至酸性。
23.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中通过改变孵育时间来控制所述蛋白水解的程度。
24.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述种子粗粉为油菜籽粗粉，且所述水解物含有肽Val-Ser-Val。
25.如权利要求16所述的方法，其中所述种子粗粉为油菜籽粗粉，且所述水解物含有肽Val-Ser-Val。
26.如权利要求19所述的方法，其中所述种子粗粉为油菜籽粗粉，且所述水解物含有肽Val-Ser-Val。
27.如权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中所述种子粗粉为亚麻粗粉或大豆粗粉，且所述蛋白水解酶为金属肽链内切酶。
28.如权利要求16所述的方法，其中所述种子粗粉为亚麻粗粉或大豆粗粉，且所述蛋白水解酶为金属肽链内切酶。
29.通过权利要求1-28中任一权利要求所述的方法制备的含ACE抑制肽的水解物。
30.如权利要求29所述的水解物，其中所述水解物的ACE抑制IC50低于200μg粉末/ml。
31.如权利要求29或30所述的水解物，其包括肽Val-Ser-Val。
32.通过干燥权利要求29-31中任一权利要求所述的水解物制备的粉末。
33.如权利要求32所述的粉末，其包括肽Val-Ser-Val。
34.含有权利要求29-31中任一权利要求所述的水解物或权利要求32或33所述的粉末的可食用产品。
35.如权利要求34所述的产品，其中所述产品为食品或饮料。
36.如权利要求34所述的产品，其中所述产品为食品补充剂。
37.如权利要求34-36中任一权利要求所述的产品，其包括肽Val-Ser-Val。
38.权利要求29-31中任一权利要求所述的水解物、或权利要求32或33所述的粉末、或权利要求34-37中任一权利要求所述的产品在制备抑制哺乳动物中ACE活性的药物中的用途。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述抑制哺乳动物ACE活性的药物用于降低所述哺乳动物中已升高的血压。
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Yoshiharu ETO, Tomomi ITO, Shigeko NISHIOKA,.Angiotensin I Converting Enzyme-inhibitory Dipeptides inanAlkaline Protease Hydrolysate of Whey Protein.Journal of Japanese society of nutrition and food science51 6.1998,51(6),355页摘要. *

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