JP3088491B2

JP3088491B2 - ペプチド混合物の製造方法

Info

Publication number: JP3088491B2
Application number: JP03152274A
Authority: JP
Inventors: 博文本井; 俊明児玉
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1991-05-29
Filing date: 1991-05-29
Publication date: 2000-09-18
Anticipated expiration: 2015-09-18
Also published as: JPH04349893A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アンジオテンシン変
換酵素の活性を阻害し得るペプチド混合物の製造方法お
よび当該方法により得られたペプチド混合物を含有する
アンジオテンシン変換酵素阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】血圧上昇をもたらす代表的な生体内因子
としてレニン・アンジオテンシン系が、また血圧降下に
働く代表的な生体内因子としてカリクレイン・キニン系
が知られているが、アンジオテンシン変換酵素（以後
「ＡＣＥ」という）はこのいずれの系にも大きく関与し
ている。

【０００３】その機構を簡単に説明する。まず、レニン
・アンジオテンシン系では、血中に分泌された腎臓の酵
素レニンが血中のアンジオテンシノーゲンに作用してデ
カペプチドであるアンジオテンシンIを生成する。この
アンジオテンシンIは血圧上昇作用を示さないが、これ
にＡＣＥが作用するとオクタペプチドであるアンジオテ
ンシンIIを生成する。このアンジオテンシンIIは末梢血
管を収縮させるとともに、副腎皮質に作用してアルドス
テロンの産出を促し、アルドステロンは腎臓に作用して
ナトリウムの再吸収・体液量増加を招いて心拍出量の増
大をもたらし、そのいずれもが血圧を大きく上昇させ
る。

【０００４】一方、カリクレイン・キニン系では血中の
前駆体蛋白質であるキニノーゲンに血中酵素のカリクレ
インが作用してキニンを遊離産出するが、このキニンは
末梢血管を拡張させるとともにホスホリパーゼＡ₂を活
性化してプロスタグランジンの合成を促進して血圧を降
下させる。ところがこのカリクレイン・キニン系にＡＣ
Ｅが働くと、ＡＣＥは末梢血管の拡張作用およびホスホ
リパーゼＡ₂の活性化作用を有する上記キニンを分解・
不活性化してしまうために、血圧の降下が生じなくな
る。

【０００５】したがって、ＡＣＥの上記のような働きを
阻害する物質（ＡＣＥ阻害剤）が存在すると、血圧上昇
物質であるアンジオテンシンIIの生成が抑制され、且つ
血圧降下物質として働くキニンの分解が防止されて、血
圧の上昇抑制および血圧降下が可能になる。

【０００６】かかる点から、近年、天然蛋白質を原料と
して使用して、または化学合成によってＡＣＥ阻害作用
を有するペプチドに関する研究が色々行われている。こ
れまでに報告された天然蛋白質由来のＡＣＥ阻害ペプチ
ドの例としては、マムシ由来のブラジキニン・ポテンシ
エーターＢおよびブラジキニン・ポテンシエーターＣ
［Ｈ．Ｋato and Ｔ．Ｓuzuki，Biochemistry，１０,ｐ
９７２（１９７１）］、牛乳カゼイン由来のペプチド
（特公昭６０−２３０８５号公報、特開昭５９−４４３
２３号公報、特開平２−２０２６３号公報）等を挙げる
ことができる。

【０００７】しかしながら、天然蛋白質を原料として用
いる上記した従来技術は、いずれも単一のペプチドの入
手を目的としているために、クロマトグラフィーやその
他の繁雑で高価な精製手段を必要とし、その製造コスト
を高いものにしていた。しかもそのような従来技術で
は、目的とするＡＣＥ阻害ペプチドの収率が低く、少量
しか得られず大量生産が不可能であった。

【０００８】また、化学合成により得られたＡＣＥ阻害
ペプチドの場合は、それが直ちにヒトや動物に対して安
全に使用できるという保証がなく、その安全性の検査や
確認に多大の労力や経費を必要とした。

【０００９】

【発明の内容】上記の点から、本発明者らは、安全性の
高いＡＣＥ阻害ペプチドを簡単な操作で安価に大量生産
できる方法を求めて研究を行ってきた。その結果、小麦
蛋白質を酸性プロテアーゼで加水分解して得られる生成
物、あるいは小麦蛋白質を酸性プロテアーゼで加水分解
した後更に中性またはアルカリ性プロテアーゼで加水分
解して得られる生成物を、アルコールで抽出処理する
と、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合物が高収率で
得られること、そしてそのペプチド混合物は、そのまま
ＡＣＥ阻害剤としての使用が可能であることを見出して
本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は、 (ａ)小麦蛋白質を水性媒体中で酸性プロテアーゼで加水
分解する工程、あるいは小麦蛋白質を水性媒体中で酸性
プロテアーゼで加水分解した後更に中性またはアルカリ
性プロテアーゼで加水分解する工程； (ｂ)工程(ａ)の加水分解生成物から不溶物を除去して液
体分を回収する工程; (ｃ)工程(ｂ)で回収した液体分から水性媒体を除去して
濃縮物を回収する工程；および (ｄ)工程(ｃ)で回収した濃縮物をアルコールで抽出処理
して、ペプチド混合物をアルコール可溶性画分として分
取する工程；を包含することを特徴とするペプチド混合物の製造方法
である。そして、本発明は、上記方法により製造された
ペプチド混合物を有効成分として含有するＡＣＥ阻害剤
をも包含する。

【００１１】本発明の製造方法において使用する小麦蛋
白質は、グルテンから主としてなっており、場合により
アルブミン、グロブリン等の小麦中に含有することが知
られている他の蛋白質を含有していてもよい。

【００１２】そして、本発明では、上記の加水分解工程
(ａ)において、小麦蛋白質を水等の水性媒体中に分散ま
たは溶解させた状態で、まず酸性プロテアーゼを使用し
て加水分解を行う。この場合、使用するプロテアーゼの
種類等により適宜調節する必要があるが、通常、水性媒
体中における小麦蛋白質の濃度を約１.０〜１０.０重量
％程度にして酸性プロテアーゼで加水分解するのがよ
い。

【００１３】酸性プロテアーゼとしては、通常、ｐＨ約
１.５〜５.０の酸性領域で作用するプロテアーゼを使用
するのがよく、そのような酸性プロテアーゼの例として
は、ペプシン；麹菌由来の酸性プロテアーゼ、ペニシリ
ウム起源のアスパルティックプロティナーゼ等の微生物
起源の酸性プロテアーゼ；ヒイロタケ起源のアスパルテ
ィックプロテイナーゼ等を挙げることができる。そのう
ちでも、ペプシンおよび麹菌由来の酸性プロテアーゼが
ＡＣＥ阻害活性を有するペプチド混合物を高収率で得る
ことができ好ましい。

【００１４】酸性プロテアーゼは、１種類のみを使用し
ても、または酸性プロテアーゼ同士が互いに悪影響を及
ぼさないかぎりは複数種を併用してもよい。複数の酸性
プロテアーゼを使用する場合は、複数の酸性プロテアー
ゼを同時に存在下させて加水分解を行っても、または１
種類ずつ逐次に用いて加水分解を行ってもよい。また、
酸性プロテアーゼはフリーの状態で使用しても、固定化
して使用してもよく、いずれの場合も乾燥した小麦蛋白
質１００ｇ当たり酸性プロテアーゼを合計で約５,００
０〜２５０,０００unitsの割合で用いるのがよい。

【００１５】この酸性プロテアーゼによる加水分解処理
は、通常、加水分解度が約３０〜６０％の状態になるま
で行うとよい。例えば、酸性プロテアーゼとしてペプシ
ンや麹菌由来の酸性プロテアーゼを用いて小麦蛋白質を
加水分解する場合は、小麦蛋白質を含有する水性媒体液
のｐＨを約１.５〜５.０にして、温度約３０〜７０℃で
約２〜２５時間加水分解を行うと、加水分解度が約３０
〜６０％の状態になるので、その時点で酸性プロテアー
ゼを失活させて加水分解を停止させる。酸性プロテアー
ゼの失活は、通常、液のｐＨを酸性プロテアーゼの活性
ｐＨよりも高くする方法（例えば中性またはアルカリ性
に調節する）および／または高温（通常約７０〜９０
℃）に加熱する方法等により行うとよい。

【００１６】ここで、本明細書中における上記および下
記の加水分解度は、いずれも０.７５Ｍトリクロロ酢酸
(ＴＣＡ)への溶解率で示したものであり、次式で表され
る。加水分解度(％)＝{(０.７５ＭＴＣＡ溶解蛋白量)／
(全蛋白量）}×１００

【００１７】本発明においては、上記によって酸性プロ
テアーゼで加水分解処理して得た生成物をそのまま上記
した次の工程(ｂ)に供することができる。しかしなが
ら、酸性プロテアーゼで加水分解処理して得た液のｐＨ
を調節して、更に中性またはアルカリ性プロテアーゼで
加水分解を行ってから次の工程(ｂ)に供するのが好まし
い。

【００１８】中性またはアルカリ性プロテアーゼで更に
加水分解を行う場合は、通常、ｐＨ約６〜１０の中性ま
たはアルカリ性領域で作用するプロテアーゼを使用する
のがよく、そのようなプロテアーゼの例としては、サー
モライシン、トリプシン、キモトリプシン、プロナー
ゼ、サチライシン、エスペラーゼ等を挙げることができ
る。そのうちでも、サーモライシンやサチライシンを使
用すると、目的物であるペプチド混合物を高収率で得る
ことができ好ましい。

【００１９】中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテ
アーゼは、１種類のみを使用しても、またはプロテアー
ゼ同士が互いに悪影響を及ぼさないかぎりは複数種を併
用してもよい。複数のプロテアーゼを使用する場合は、
それらを同時に存在させて加水分解を行っても、または
１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行ってもよい。ま
た、中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼ
は、フリーの状態で使用しても、固定化して使用しても
よく、いずれの場合も乾燥した小麦蛋白質１００ｇ当た
り中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを約
１０,０００〜５００,０００unitsの割合で用いるのが
よい。

【００２０】この中性またはアルカリ性プロテアーゼに
よる加水分解処理は加水分解度が約６０〜９０％の状態
になるまで反応を行い、その時点で中性またはアルカリ
性プロテアーゼを失活させるのがよい。例えば、サーモ
ライシンを使用して加水分解する場合は、液のｐＨを約
７.０〜８.０にして、温度約３０〜７０℃で約２〜２５
時間加水分解を行い、加水分解度約６０〜９０％の状態
になった時点でサーモライシンを失活させるとよい。中
性またはアルカリ性プロテアーゼの失活は、液のｐＨを
酸性に調節する方法および／または液を高温（通常約８
０〜１００℃）に加熱する方法等により行うとよい。

【００２１】ここで、本明細書中のプロテアーゼ活性
（unit）はすべて下記の方法により測定したものであ
る。プロテアーゼ活性の測定法基質として米国メルク社製のハマーステインカゼイン１
％溶液を用い、アンソン−萩原変法［赤堀四郎編 “酵
素研究法"第２巻、第２３７頁（昭和３６年１月１０
日、朝倉書店発行）］により測定した。反応は３０℃で
３０分間行い、１分間に１μｇのチロシン相当量を遊離
するのに要する酵素量を１unitとした。

【００２２】次に、上記の工程(ａ)で生成した加水分解
生成物から、工程(ｂ)において、不溶物を分離除去して
液体分を回収する。不溶物の除去に当たっては、遠心分
離、濾過、デカンテーション等の通常の固液分離方法の
いずれが採用できる。不溶物を除去した後の液体分は、
そのまま次の工程(ｃ)に供しても、または活性炭、ケイ
ソウ土等の吸着剤を使用してそこに含まれる不純物を吸
着除去してから工程(ｃ)に供してもよい。より純度の高
いペプチド混合物を得るためには、活性炭やケイソウ土
等の吸着剤による吸着処理を施すのがよい。

【００２３】次いで、工程(ｃ)において、上記工程(ｂ)
で回収した液体分から水性媒体を除去して濃縮物を形成
させる。ここで、本発明でいう濃縮物とは、濃縮液体お
よび濃縮固体のいずれをも包含する。液体分から濃縮液
体を形成させる方法としては、フラッシュ式、遠心薄膜
式等の減圧濃縮法等を、また液体分から濃縮固体を形成
させる方法としては、噴霧下またはその他の状態での凍
結乾燥や加熱乾燥等を挙げることができる。（減圧）濃
縮を行う場合は、得られる濃縮液体中の水分含量が約４
０〜７５％になる状態まで行うのがよい。加熱乾燥を行
う場合は、生成物の熱による変性が生じないような温度
（通常約７０〜８０℃）を採用するのがよく、また乾燥
処理は、得られる固体分中の水分含量が約５〜１５重量
％になる状態まで行うのがよい。

【００２４】そして、上記工程(ｃ)で得た濃縮物を、工
程(ｄ)において、アルコールで抽出処理して、目的とす
るペプチド混合物をアルコール可溶性画分として分取す
る。アルコールとしては、エタノール、メタノール、プ
ロパノール等を使用することができるが、抽出率、安全
性、入手のしやすさ等の点からエタノールが好ましい。
アルコールによる抽出処理は、通常、濃度約７０〜１０
０％の高濃度アルコールを使用して行うと効率がよい。
アルコールによる抽出処理は、一段で行っても多段で行
ってもよく、特に、次のような多段抽出処理を行うと、
ＡＣＥ阻害活性を有するペプチド混合物を高収率で得る
ことができ望ましい。

【００２５】すなわち、工程(ｃ)で得た濃縮物を濃度約
７０〜８０％のアルコール（特にエタノール）を使用し
て第１段目の抽出処理を行って、その際に生じた不溶物
を除去した後、そこで得られたアルコール溶液に濃度約
９５〜１００％のアルコール（特にエタノール）を加え
て液の最終アルコール濃度を約８５〜９５％に調節して
第２段目の抽出処理を行い、第２段目の抽出処理で生じ
た不溶物を分離除去して、目的とするペプチド混合物を
含有するアルコール溶液を回収する方法が好ましい。

【００２６】上記のアルコールによる抽出処理は、通
常、約１０〜３０℃の温度で、撹拌下に約０.５〜２０
時間行うのがよい。そして、上記により得たアルコール
抽出溶液から蒸発、凍結乾燥等の適当な手段によってア
ルコールを除去すると、目的とするＡＣＥ阻害活性を有
するペプチド混合物を固形物として回収することができ
る。

【００２７】上記で回収されたペプチド混合物は、サイ
ズ排除高速液体クロマトグラフィーを使用してその分子
量分布を測定した場合に、その分子量が約１００００以
下の範囲に分布し、その主体成分（約６０〜８０％）が
分子量約２００〜２０００の範囲にあるペプチド混合物
である。このペプチド混合物は、混合物の形態のままで
高いＡＣＥ阻害活性を有しており、精製処理等を更に施
すことなく、そのままＡＣＥ阻害剤として有効に使用す
ることができる。

【００２８】また、上記ペプチド混合物中には、特に高
いＡＣＥ阻害活性を有するいくつかのペプチド画分が含
まれることが本発明者らの更なる研究により判明した。
したがって、必要に応じてそのような高いＡＣＥ阻害活
性を有するペプチド画分をペプチド混合物から分取し
て、それをＡＣＥ阻害剤として使用することもできる。

【００２９】本発明のＡＣＥ阻害剤は、人間および種々
の動物に投与することができ、それによって人間や動物
の血圧降下および上昇抑制を達成することができる。本
発明のＡＣＥ阻害剤の好適な投与量は、投与される人間
や動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種々
の条件によって異なる。そして、本発明のＡＣＥ阻害剤
は経口投与および非経口投与のいずれによっても投与可
能である。

【００３０】本発明のＡＣＥ阻害剤は、単独で投与して
も、また製薬工業において通常使用されている固体担体
や液状担体と一緒に投与してもよい。また、本発明のＡ
ＣＥ阻害剤は、他の薬剤と混合または組合わせて使用す
ることができる。その際の投与形態は、錠剤、丸剤、顆
粒剤、カプセル、散剤、水溶液、注射剤等の任意の形態
が可能である。更に、本発明のＡＣＥ阻害剤は、食品や
飼料中に添加して、またはそれらと一緒に投与すること
もできる。

【００３１】

【実施例】以下に、本発明を例を挙げて具体的に説明す
るが本発明はそれらによって限定されない。《実施例１》小麦グルテン２６７ｇに１規定のクエン
酸溶液３２ｍｌおよび水道水１７００ｍｌを加えて撹拌
して、ｐＨ４.０の小麦グルテンの水性分散液を調製し
た。これに麹菌由来の酸性プロテアーゼ（天野製薬工業
社製；プロテアーゼ「アマノ」Ｍ）０.４ｇ（２０,００
０units）を添加して４５℃に５時間保って、加水分解
反応させた。その後、水酸化ナトリウムを加えて液のｐ
Ｈを７．５に調整し、８５℃に１０分間加熱して酸性プ
ロテアーゼを失活させた。次いで、水道水２０００ｍｌ
を加えて液のｐＨを７.５に調整し、これに中性プロテ
アーゼ（大和化成社製；サーモアーゼ）４ｇ（３２０,
０００units）を添加して、６５℃で５時間加水分解反
応させた。その後９０℃に２０分間加熱して中性プロテ
アーゼを失活させた。

【００３２】上記の加水分解生成物から不溶物を遠心分
離により除去して液体分を回収した後、活性炭８ｇおよ
びケイソウ土６０ｇを液に加えて室温で１時間撹拌し
た。次いで、固形物を濾過により分離除去して液体分を
回収した後、液体分を凍結乾燥して乾燥固体（乾燥固体
Ａ）１５０ｇを得た。

【００３３】上記で得た乾燥固体Ａの１５０ｇに７５％
エタノール７５０ｍｌを添加して室温下で１時間撹拌し
た。次いで、遠心分離して沈殿（沈殿物Ａ：乾燥重量６
０ｇ）と上澄み液に分画した。上澄み液に９９．５％エ
タノール７５０ｍｌを加えて室温下で１時間撹拌した
後、そのまま一晩放置して、沈殿を生成させた。

【００３４】デカンテーションによって沈殿（沈殿物
Ｂ：乾燥重量５０ｇ）と上澄み液に分画した。次に、上
澄み液からエタノールを蒸発除去して、固体残留物を
得、それを凍結乾燥して、目的とするペプチド混合物か
らなる乾燥固体(乾燥固体Ｂ)４０ｇを得た。

【００３５】上記で得たペプチド混合物（乾燥固体Ｂ）
の１ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、サイズ排除高速液体
クロマトグラフィー［使用カラム：旭化成工業(株)製の
Asahipak ３２０］に供し、次に４０％アセトニトリル
水溶液中の０.１％トリフルオロ酢酸溶液を使用して１.
０ｍｌ／分の流速で溶離させ、溶離してくる液の２２０
ｎｍにおける紫外吸収を測定して、その測定された吸光
度を、分子量既知のRibonuclease Ａ(分子量１３７０
０)、Aprotinin（分子量６５００）、Bradykinin（分子
量１０６０）およびIle−Ala−Pro（分子量３００）か
ら作成した検量線に当てはめて分子量分布を測定した。
その結果、そのクロマトグラムは図１に示すとおりであ
り、その分子量は約１００００以下の範囲に分布し、下
記の表１に示す分布状態になっており、その主体部分
（約７０％）の分子量は約２００〜２０００の範囲であ
った。

【００３６】

【表１】

【００３７】また、上記で得たペプチド混合物（乾燥固
体Ｂ）のＡＣＥ阻害活性を、下記の方法により測定し
た。また、参考のために、上記で生成した乾燥固体Ａ、
沈殿物Ａおよび沈殿物ＢのＡＣＥ阻害活性を同様にして
測定した。

【００３８】ＡＣＥ阻害活性の測定法試料液５０μｌを試験管にとり、これにＡＣＥ液（米国
シグマ社製のうさぎ肺由来のＡＣＥの１unitを水５mｌ
に溶解させたもの）２０μｌを加える。３７℃に５分間
保った後、基質（５ｍＭ Hip-His-Leu：ｐＨ８.３）を
加えて３７℃で３０分反応させ、次いで０.３Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液１ｍｌを加えて反応を停止させる。蛍
光試薬オルト−フタルアルデヒド液１００μｌを加えて
室温で１０分間反応させる。次に３Ｎ塩酸２００ｍｌ加
え、蒸留水で５０倍に希釈する。約３０分後に分光蛍光
光度計で励起波長３００ｎｍ、蛍光波長４９０ｎｍにお
ける蛍光強度(Ｆ_A)を測定する。試料液の代わりに蒸留
水５０μｌを同様に処理して蛍光強度(Ｆ_B)を測定す
る。阻害活性は（Ｆ_B−Ｆ_A）／Ｆ_Bにより求められる。試
料液の濃度を変えて、阻害活性を上記と同様に測定し、
活性を５０％阻害する濃度を求めてこれをＩＣ₅₀として
表した。

【００３９】その結果、上記各成分のＡＣＥ阻害活性
（ＩＣ₅₀）は下記の表２に示すとおりであった。

【００４０】

【表２】

【００４１】上記表２の結果から、本発明の方法で得
られたペプチド混合物（乾燥固体Ｂ）は、分画前のプロ
テアーゼ加水分解物（乾燥固体Ａ）、沈殿物Ａおよび沈
殿物Ｂに比べて、少量の使用でＩＣ₅₀を達成することが
でき、ＡＣＥ阻害活性が高いことがわかる。

【００４２】また、本発明の方法で得られた上記ペプ
チド混合物１ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解して、逆相系の
高速液体クロマトグラフィー［直径４.６ｍｍ、長さ２
５０ｍｍの東ソー（株）製のＴＳＫ−ＧＥＬＯＤＳ１
２０Ｔ］に供した。次いで、０.１％トリフルオロ酢酸
水溶液（Ａ液）および０.１％のトリフルオロ酢酸水溶
液中の６０％アセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して、
Ｂ液の濃度を０％から５０％まで４５分間かけて直線的
に増加する濃度勾配にて１.０ｍｌ／分の流速で溶出さ
せた。その時の波長２２０ｎｍにおけるフローチャート
は図２に示すとおりであり、複数のペプチドに由来する
複数のピークが見られた。

【００４３】図２のフローチャートにおけるピークＮ
ｏ.１〜ピークＮｏ.１６の各々を分取して、その各々に
ついて上記と同様にしてＡＣＥ阻害活性（ＩＣ₅₀）を測
定したところ、ほぼ下記の表３に示す結果を得た。

【００４４】

【表３】

【００４５】表３の結果から、本発明の方法で得られ
たペプチド混合物中には、ＡＣＥ阻害活性のより高いい
くつかのペプチド類が含まれることがわかる。したがっ
て、本発明においては、本発明の方法で得られたペプチ
ド混合物のうち、図２に示すようなフローチャートにお
いて、ＡＣＥ阻害活性のより高い画分の１つまたは複数
を分取して、その各々を単独でまたは混合してＡＣＥ阻
害剤として使用することもできる。

【００４６】《実施例２》１０週令の高血圧自然発症
ラット（ＳＨＲ）を、各群５匹づつ２群準備した。第１
群のラットには、実施例１で得た本発明のペプチド混合
物（乾燥固体Ｂ）を、各ラットの腹腔内に体重１ｋｇ当
り１０００ｍｇの割合で投与した。投与前および投与後
１.５時間、３時間および５時間後の最高血圧の変化を
尾動脈圧測定装置（理研開発社製のＰＳ−１００型）を
使用して非観血的に測定して、５匹のラットの平均値を
採った。一方、比較のため、第２群のラットには、生理
食塩水を第１群におけるのと同量投与して、その投与前
および投与後の血圧変化を同様にして測定して、５匹の
ラットの平均値を採った。その結果を、下記の表４に示
す。

【００４７】

【表４】

【００４８】表４の結果から、本発明の方法で得られ
たペプチド混合物を投与した第１群のラットは、ペプチ
ド混合物を投与しない第２群のラットに比べて、ペプチ
ド混合物の投与１.５時間後から５時間後まで有意に血
圧の低下作用が見られることがわかる。

【００４９】《実施例３》小麦グルテン２６７ｇに
０.０２５規定の塩酸溶液３７００ｍｌを加えて撹拌し
て、ｐＨ１.８の小麦グルテンの水性分散液を調製し
た。これに豚胃由来のペプシン（天野製薬工業社製）
０.４ｇ（１２,０００units）を添加して４０℃に１５
時間保って、加水分解反応させた。その後、水酸化ナト
リウムを加えて液のｐＨを４.０に調整し、これに麹菌
由来の酸性プロテアーゼ（天野製薬工業社製；プロテア
ーゼ「アマノ」Ｍ）０.８ｇ（４０,０００units）を添
加して４５℃に５時間保って、加水分解反応させた。そ
の後、水酸化ナトリウムを加えて液のｐＨを６.０に調
整し、８５℃に２０分間加熱してプロテアーゼを失活さ
せた。

【００５０】上記の加水分解生成物から不溶物を遠心分
離により除去して液体分を回収した後、活性炭８ｇおよ
びケイソウ土６０ｇを液に加えて室温で１時間撹拌し
た。次いで、固形物を濾過により分離除去して液体分を
回収した後、液体分を蒸発濃縮して濃縮分５００ｍｌを
得た。

【００５１】上記で得た濃縮分５００ｍｌに９９.５％
エタノール１２００ｍｌを添加して室温下で３０分間撹
拌した。次いで、遠心分離して沈殿と上澄み液に分画し
た。上澄み液に９９.５％エタノール１０００ｍｌを加
えて室温下で１時間撹拌した後、遠心分離して沈殿と上
澄み液に分画した。

【００５２】次に、上澄み液からエタノールを蒸発除去
して、固体残留物を得、それを凍結乾燥して、目的とす
るペプチド混合物からなる乾燥固体２５ｇを得た。

【００５３】上記で得たペプチド混合物の乾燥固体１ｍ
ｇを使用して、実施例１におけるのと同様にしてその分
子量分布を測定した。その結果、そのクロマトグラムは
図３に示すとおりであり、その分子量は約１００００以
下の範囲に分布し、下記の表５に示す分布状態になって
おり、その主体部分（約６３％）の分子量は約２００〜
２０００の範囲であった。

【００５４】

【表５】

【００５５】上記で得たペプチド混合物のＡＣＥ阻害活
性を実施例１と同様に測定したところ、そのＡＣＥ阻害
活性（ＩＣ₅₀）は２００μｇ／ｍｌであった。このこと
から、この実施例３で得られた本発明のペプチド混合物
も、少量の使用でＩＣ₅₀を達成することができ、高いＡ
ＣＥ阻害活性を有していることがわかる。

【００５６】

【発明の効果】本発明により得られるペプチド混合物
は、ＡＣＥ阻害作用を有し、少量の投与でＡＣＥの活性
を阻害して血圧降下および血圧上昇抑制を達成すること
ができる。更に、本発明により得られるペプチド混合物
は、クロマトグラフィーやその他の繁雑で高価な精製手
段を必要としないため、その製造に手間や費用がかから
ず、しかも収率が高く、工業的に安価かつ大量に供給可
能である。しかも、本発明により得られるペプチド混合
物は、小麦蛋白質に由来するため高い安全性を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１で得られたペプチド混合物の
分子量分布を示す図である。

【図２】本発明の実施例１で得られたペプチド混合物を
逆相系の高速液体クロマトグラフィーに供し、その吸着
成分を特定の溶離液により溶離した時の溶離成分の吸光
度を測定したフローチャートである。

【図３】本発明の実施例３で得られたペプチド混合物の
分子量分布を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/06 A61K 38/00 A61K 38/55 C07K 14/415 C12N 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】 (ａ)小麦蛋白質を水性媒体中で酸性プロ
テアーゼで加水分解する工程、あるいは小麦蛋白質を水
性媒体中で酸性プロテアーゼで加水分解した後更に中性
またはアルカリ性プロテアーゼで加水分解する工程； (ｂ)工程(ａ)の加水分解生成物から不溶物を除去して液
体分を回収する工程; (ｃ)工程(ｂ)で回収した液体分から水性媒体を除去して
濃縮物を回収する工程；および (ｄ)工程(ｃ)で回収した濃縮物をアルコールで抽出処理
して、ペプチド混合物をアルコール可溶性画分として分
取する工程；を包含することを特徴とするペプチド混合物の製造方
法。
【請求項２】請求項１の方法により製造されたペプチ
ド混合物を有効成分として含有するアンジオテンシン変
換酵素阻害剤。