CN102757479B - 高活性降血压肽及其制备方法 - Google Patents
高活性降血压肽及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102757479B CN102757479B CN201210142379.0A CN201210142379A CN102757479B CN 102757479 B CN102757479 B CN 102757479B CN 201210142379 A CN201210142379 A CN 201210142379A CN 102757479 B CN102757479 B CN 102757479B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gel chromatography
- carried out
- blood pressure
- pressure lowering
- processing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 10
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 102000004270 Peptidyl-Dipeptidase A Human genes 0.000 claims abstract 8
- 241000758789 Juglans Species 0.000 claims description 45
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 claims description 45
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 45
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 claims description 45
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 27
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 25
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 23
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 22
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 11
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims description 11
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 claims description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 41
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- LHTGRUZSZOIAKM-SOUVJXGZSA-N Tyr-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O LHTGRUZSZOIAKM-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 101000984728 Chiropsoides quadrigatus Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide Proteins 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 238000001698 laser desorption ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及高活性降血压肽及其制备方法。其中，该高活性降血压肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明的高活性降血压肽，成本低，血管紧张素转化酶抑制活性高，能够有效地抑制血管紧张素转化酶的活性，从而能够有效地应用于治疗高血压药物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及保健性功能食品及药品制备领域。具体地，本发明涉及高活性降血压肽及其制备方法。
背景技术
高血压是一种常见的心脑血管疾病，它的发病率高，常伴有心脏、血管、肺以及肾脏功能器官的改变，能引发中风、冠心病等多种疾病。目前，临床上治疗高血压多采用含有人工合成的降血压肽的药品，但人们发现，这种降血压肽在临床应用过程中会产生不同程度的副作用。因此，寻找天然的、更安全的降血压肽意义重大。
然而，目前制备天然降血压肽的方法仍有待改进。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
核桃作为油料作物，榨油剩余的饼粕，多数被遗弃不能被充分利用。核桃蛋白饼粕中的核桃蛋白含量极高，并且核桃蛋白是大脑最好的营养物质，有着“抗氧化之王”的美称。利用核桃粕筛选高活性的ACE（血管紧张素转化酶）抑制肽既可以良好利用核桃加工的剩余产物，又可以得到高活性的降血压肽。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备天然、高活性的降血压肽的方法及其产品。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种高活性降血压肽。根据本发明的实施例，该高活性降血压肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。根据本发明的具体示例，本发明的高活性降血压肽的序列为（C端—N端）：酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸（Tyr–Glu-Pro，YEP）。发明人惊奇地发现，本发明的高活性降血压肽，其血管紧张素转化酶抑制活性（在本文中有时也称为“ACE抑制活性”）高，能够有效地抑制血管紧张素转化酶的活性，从而能够有效地应用于治疗高血压药物的制备，并且该高活性降血压肽的生产成本低，具有巨大的实用价值和经济效益。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备上述高活性降血压肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用碱提酸沉法从脱脂核桃粉中提取核桃蛋白；利用蛋白酶对核桃蛋白进行水解，以便获得水解产物；以及对水解产物依次进行超滤处理、第一凝胶色谱处理、第二凝胶色谱处理和反相高效液相色谱处理，以便获得高活性降血压肽。发明人惊奇地发现，利用该方法能够有效地制备具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的高活性降血压肽，并且该高活性降血压肽纯度高，能够有效地抑制血管紧张素转化酶的活性，进一步通过抑制血管紧张素转化酶的活性能够控制血压，从而能够有效地应用于治疗高血压药物的制备。此外，需要说明的是，利用本发明的制备高活性降血压肽的方法及其产品，现阶段均未见报道。
根据本发明的实施例，在本发明的制备高活性降血压肽的方法中，利用碱提酸沉法从脱脂核桃粉中提取核桃蛋白可以进一步包括：将脱脂核桃粉与水按照重量比1：10的比例进行混合，并使所得到的混合物在pH 8.0、温度65摄氏度下进行水解5小时，以便获得碱提产物；将碱提产物进行第一离心，并收集第一离心上清液；将第一离心上清液在pH 4.5下进行酸沉，以便获得酸沉产物；将酸沉产物进行第二离心，并收集第二离心沉淀物；以及将第二离心沉淀物进行水洗至中性，以便获得核桃蛋白。
根据本发明的实施例，在本发明的制备高活性降血压肽的方法中，利用碱提酸沉法从脱脂核桃粉中提取核桃蛋白进一步包括将核桃蛋白进行真空冷冻干燥。由此，在真空低温的环境下能够挥干溶剂，维持样品即核桃蛋白的活性。
根据本发明的实施例，在本发明的制备高活性降血压肽的方法中，蛋白酶的种类不受特别限制，只要能够使核桃蛋白有效水解，从而能够获得实验所需的多肽即可。根据本法民的一些具体示例，蛋白酶可以为选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶的至少一种，优选胃蛋白酶或碱性蛋白酶，更优选胃蛋白酶。其中，在本文中所使用的表达方式“蛋白酶可以为选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶的至少一种”是指，对核桃蛋白进行水解时，可以仅采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶的任意一种作为蛋白酶，也可以是采用三者的任意组合作为蛋白酶，既可以同时使用三种蛋白酶，也可以依次使用三种蛋白酶。
根据本发明的实施例，使用蛋白酶进行水解处理的条件，并不受特别限制。只要能够实现蛋白酶对所得到的核桃蛋白进行水解即可。根据本发明的实施例，在本发明的制备高活性降血压肽的方法中，蛋白酶为木瓜蛋白酶，其中，利用木瓜蛋白酶对核桃蛋白进行水解的料液比为25g/L，加酶量为3（质量/体积）%，pH值为6，水解温度为50℃，水解时间为4h。根据本发明的实施例，在本发明的制备高活性降血压肽的方法中，蛋白酶为胃蛋白酶，利用胃蛋白酶对核桃蛋白进行水解的料液比为25g/L，加酶量为4（质量/体积）%，pH值为2，水解温度为55℃，水解时间为4h。根据本发明的实施例，在本发明的制备高活性降血压肽的方法中，蛋白酶为碱性蛋白酶，利用碱性蛋白酶对核桃蛋白进行水解的料液比为25g/L，加酶量为7（质量/体积）%，pH值为10，水解温度为60℃，水解时间为2h。其中，在本文中所采用的术语“料液比”是指核桃蛋白与去离子水的质量体积比，如“利用胃蛋白酶对核桃蛋白进行水解的料液比为25g/L”中的料液比是指核桃蛋白与去离子水的质量体积比为25g/L。本发明的发明人惊奇的发现，通过采用前面所述的水解条件，利用相应的蛋白酶能够非常有效地获得本发明的高活性降血压肽。
根据本发明的实施例，在得到水解产物后超滤处理、第一凝胶色谱处理、第二凝胶色谱处理和反相高效液相色谱处理的条件并不受特别限制。根据本发明的实施例，在本发明的制备高活性降血压肽的方法中，对所述水解产物依次进行超滤处理、第一凝胶色谱处理、第二凝胶色谱处理和反相高效液相色谱处理进一步包括：
利用截留分子量不超过30000，优选不超过10000的超滤膜对所述水解产物进行超滤处理，以便得到滤液；
将所述滤液进行第一凝胶色谱处理并对所得到的各组分进行血管紧张素转化酶抑制活性检测，以便得到血管紧张素转化酶抑制活性最高的组分作为第一凝胶色谱产物，根据本发明的实施例，优选所述第一凝胶色谱处理采用SephadexG25 Medium柱，流动相为10mM pH 7.0的Tris-HCl，流速为1ml/min；
将所述第一凝胶色谱产物进行第二凝胶色谱处理并对所得到的各组分进行血管紧张素转化酶抑制活性检测，以便得到血管紧张素转化酶抑制活性最高的组分作为第二凝胶色谱产物，根据本发明的实施例，优选所述第二凝胶色谱处理采用SuperdexTM Peptide 10/300GL柱，流动相为20mM pH 7.0的PBS，流速为0.5ml/min；以及
将所述第二凝胶色谱产物进行反相高效液相色谱处理并对所得到的各组分进行血管紧张素转化酶抑制活性检测，以便得到血管紧张素转化酶抑制活性最高的组分作为所述高活性降血压肽，根据本发明的实施例，优选所述反相高效液相色谱处理采用Zorbax SB-C18柱，流动相A为0.06% TFA的水，流动相B为0.05% TFA的乙腈，流速为0.8ml/min。由此，申请人惊奇地发现，通过利用前面所述的条件进行超滤处理、第一凝胶色谱处理、第二凝胶色谱处理和反相高效液相色谱处理，能够有效地获得高活性降血压肽。
此外，需要说明的是，本发明的高活性降血压肽，现阶段尚未见报道，其是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作，从核桃粕中提取制备的新的、天然、安全的降血压肽，这为更安全、有效的高血压治疗药物的制备提供了新希望。而本领域的技术人员可以理解的是，还可以根据本发明提供的高活性降血压肽的氨基酸序列，即SEQ ID NO：1所示的：氨酸-谷氨酸-脯氨酸（Tyr–Glu–Pro，YEP），利用肽自动合成仪通过合成方法人工合成该高活性降血压肽。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的制备高活性降血压肽过程中的Sephadex G25 Medium柱层析色谱图，其中A显示了胃蛋白酶水解产物的Sephadex G25 Medium柱层析色谱图，B显示了碱性蛋白酶水解产物的SephadexG25 Medium柱层析色谱图；
图2显示了根据本发明一个实施例的制备高活性降血压肽过程中的SuperdexTM Peptide 10/300 GL凝胶过滤色谱图；
图3显示了根据本发明一个实施例的制备高活性降血压肽过程中的ZorbaxSB-C18柱反相高效液相色谱图；以及
图4是显示了根据本发明一个实施例的制备获得的高活性降血压肽的质谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
一般方法：
在本发明的实施例中，所采用的工艺路线由以下步骤构成：
1.利用碱提酸沉法从脱脂核桃粉中提取核桃蛋白：将脱脂核桃粉与水按1：10比例溶解，在pH 8.0，水解温度65℃的条件下水解5h后，终止水解反应，离心取上清液，在等电点4.5条件下进行酸沉，离心取沉淀，水洗沉淀至中性，然后将其迅速真空冷冻干燥保存，并通过考马斯亮蓝法测定其蛋白含量为86.32%。
2.利用蛋白酶对上述获得的核桃蛋白进行水解，以便获得水解产物，其中各蛋白酶的水解条件如下：
1）木瓜蛋白酶：料液比为25g/L，加酶量3%（m/v），pH 6，温度50℃，水解时间4h。
2）胃蛋白酶：料液比为25g/L，加酶量4%（m/v），pH 2，温度55℃，水解时间4h。
3）碱性蛋白酶：料液比为25g/L，加酶量7%（m/v），pH 10，温度60℃，水解时间2h。
3.超滤处理（通过采用不同的超滤膜，得到不同分子量的活性滤液）：将所得到的水解产物在4℃条件下经不同分子量大小的超滤膜（MWCO 30000、10000、5000）进行超滤，获得具有不同分子量的滤液，并测定各部分滤液的体外ACE（血管紧张素转化酶）抑制活性。然后，将滤液采用真空冷冻干燥保存。
4.ACE（血管紧张素转化酶）抑制活性测定：
色谱柱：C 18柱（4.6×250mm）；检测波长：228nm；流动相：甲醇：水=30：70（体积比，含体积分数0.1%的三氟乙酸）；流速：1mL/min。
将一定量的样品溶于0.1mol/L、pH 8.0、含0.3mol/L氯化钾的硼酸盐缓冲液(BBS)中，配置梯度浓度的样品溶液。取40μL样品溶液和20μL0.1U/mLACE的BBS溶液置于37℃恒温水浴中保温10min，加入100μL 5mmol/L HHL的BBS作为底物，37℃条件下反应1h后加入50μL 1mol/L盐酸中止反应，冷却至室温，取20μL反应产物进样，通过HPLC洗脱图谱定量马尿酸生成量，以生成马尿酸的量判断样品的ACE抑制率。
计算公式为：
其中：
A1为空白对照组中马尿酸的峰面积/(mAU·s)。
A2为加入样品组组中马尿酸的峰面积/(mAU·s)。
5.第一凝胶色谱分离处理：将具有高ACE抑制活性的冻干粉溶解在5ml10mM Tris-HCl（pH 7.0）中，并经脱气及0.22μm膜过滤处理，然后经CXG-1电脑层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）进行层析纯化。
流动相为：10mM Tris-HCl（pH 7.0）。色谱柱条件：Sephadex G25 Medium柱（1.6cm×60cm；Pharmacia，USA），流速为1ml/min，整个设备系统在4℃下进行。洗脱峰在280nm波长处进行检测并收集，将ACE抑制活性最高的组分（检测方法如前所示）收集液迅速进行真空冷冻干燥。
6.第二凝胶色谱分离处理：将通过第一凝胶色谱处理所得到的高ACE抑制活性的冻干粉用20mM PBS（pH 7.0）缓冲液溶解到1ml，并经脱气及过膜处理，然后经AKTA系统凝胶过滤纯化。
流动相为：20mM PBS（pH 7.0）。色谱柱条件：SuperdexTM Peptide 10/300GL柱（10mm×300mm），流速为0.5ml/min。洗脱峰在280nm波长处进行检测并收集，将ACE抑制活性最高的收集液（检测方法如前所示）迅速进行冷冻干燥。
7.反相高效液相色谱分离：将通过第二凝胶色谱处理所得到的具有最高ACE抑制活性的收集液的冻干粉，溶解于流动相样品溶解于流动相A中，并经脱气过膜处理，然后经反向高校液相色谱柱纯化。
流动相A：0.06%TFA的水；流动相B：0.05%TFA的乙腈
色谱柱条件：Zorbax SB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流速为0.8ml/min。洗脱峰在280nm出进行检测并收集，其ACE抑制活性最高的收集液（即根据本发明实施例的高活性降血压肽，其中ACE抑制活性检测方法如前所示）迅速进行冷冻干燥。
8.质谱分析：在分离纯化得到抑制剂（高活性降血压肽）之后，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行检测其分子量。
9.氨基酸序列测定：在纯化抑制剂（高活性降血压肽）后，通过PPSQ-31A全自动蛋白/多肽序列仪（Shimadzu Corporation，日本）测定，其氨基酸序列。
实施例1：
首先，将脱脂核桃粉与水按1：10比例溶解，在pH 8.0，水解温度65℃的条件下水解5h后，终止水解反应，离心取上清液，在等电点4.5条件下进行酸沉，离心取沉淀，水洗沉淀至中性，然后将其迅速真空冷冻干燥保存，并通过考马斯亮蓝法测定其蛋白含量为86.32%。
接着，利用蛋白酶分别进行水解，水解条件：
1）木瓜蛋白酶：料液比为25g/L，加酶量3%（m/v），pH 6，温度50℃，水解时间4h。
2）胃蛋白酶：料液比为25g/L，加酶量4%（m/v），pH 2，温度55℃，水解时间4h。
3）碱性蛋白酶：料液比为25g/L，加酶量7%（m/v），pH 10，温度60℃，水解时间2h。
接下来，将水解产物在4℃下经过不同分子量大小的超滤膜（MWCO30000、10000、5000）进行超滤，并将所得滤液迅速真空冷冻干燥。然后，将各组分冻干粉配置成1mg/ml浓度的溶液，以测定不同分子量范围的各组分的ACE（血管紧张素转化酶）抑制活性（ACE抑制活性检测方法如一般方法中所述），结果见下表1。
表1超滤所得不同分子量范围的各组分的ACE抑制活性
实施例2：
将实施例1中获得的具有高ACE抑制活性的分子量低于5000的胃蛋白酶和碱性蛋白酶的冻干粉，溶解在5ml 10mM Tris-HCl（pH 7.0）中，并经脱气及过膜处理，通过Sephadex G25 Medium柱分离纯化（即第一凝胶色谱处理），洗脱峰在280nm处检测并收集测定各组分的ACE抑制活性（ACE抑制活性检测方法如一般方法中所述），其中色谱图见图1，活性检测结果见下表2，并将收集液迅速真空冷冻干燥。
表2第一凝胶色谱处理所得不同组分的ACE抑制活性的IC50
图1显示了制备高活性降血压肽过程中，第一凝胶色谱处理的色谱图，其中A显示了胃蛋白酶水解产物的Sephadex G25 Medium柱层析色谱图，B显示了碱性蛋白酶水解产物的Sephadex G25 Medium柱层析色谱图。如图1A和B所示，横坐标均表示各组分的分离时间，纵坐标均表示各组分在280nm处吸光度值。
由表2可知，胃蛋白酶水解产物组分PP3的ACE抑制活性最高，碱性蛋白酶水解产物组分PP3的ACE抑制活性并不限制，因此，采用胃蛋白酶水解产物组分PP3进行后续实验。
接着，将具有高活性的胃蛋白酶水解产物组分PP3，进行凝胶色谱层析（即第二凝胶色谱处理）以便将其进行进一步分离纯化（分离结果见图2），并测定所得各组分的ACE抑制活性（检测方法如一般方法中所述），结果见下表3。
表3第二凝胶色谱处理所得不同组分的ACE抑制活性的IC50
| 组分 | PP3-1 | PP3-2 | PP3-3 |
| IC50（μg/ml） | 8.64 | 2.12 | 0.39 |
图2显示了制备高活性降血压肽过程中，第二凝胶色谱处理的色谱图。如图2所示，横坐标表示各组分的分离时间，纵坐标表示各组分在280nm处的吸光度值。
由表2可知，第二凝胶色谱处理所得不同组分中PP3-3的ACE抑制活性最高，因此，收集高活性主峰PP3-3，并采用组分PP3-3进行后续实验。
然后，将PP3-3组分溶解于流动相A中，利用反相高效液相色谱纯化PP3-3，以便得到纯度较高的组分，即得到高活性降血压肽，并将所得到的高活性降血压肽迅速真空冷冻干燥。其中，反相高效液相色谱处理的结果见图3。图3显示了制备高活性降血压肽过程中，反相高效液相处理的色谱图。如图3所示，横坐标表示各组分的分离时间，纵坐标表示各组分在280nm处的吸光度值。
然后，将纯化后的高活性降血压肽依次进行质谱分析及氨基酸测序，其中，该高活性降血压肽的质谱图如图4所示，其分子量测定值为408.60；经氨基酸测序可知，纯化后的高活性降血压肽（ACE抑制肽）具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，即：酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸Tyr-Glu-Pro（YEP），其理论分子量为407.43D，所检测的分子量与质谱分析结果基本相符。此外，经ACE抑制活性测定可知，本实施例获得的高活性降血压肽的ACE抑制率为0.29μmol/L，表明本发明的制备高活性降血压肽的方法切实有效，并且获得的天然降血压肽的ACE抑制活性显著。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种制备由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的高活性降血压肽的方法，其特征在于，包括：
利用碱提酸沉法从脱脂核桃粉中提取核桃蛋白；
利用蛋白酶对所述核桃蛋白进行水解，以便获得水解产物；以及
对所述水解产物依次进行超滤处理、第一凝胶色谱处理、第二凝胶色谱处理和反相高效液相色谱处理，以便获得所述高活性降血压肽，
其中，
利用碱提酸沉法从脱脂核桃粉中提取核桃蛋白包括：
将所述脱脂核桃粉与水按照重量比1：10的比例进行混合，并使所得到的混合物在pH8.0、温度65摄氏度下进行水解5小时，以便获得碱提产物；
将所述碱提产物进行第一离心，并收集第一离心上清液；
将所述第一离心上清液在pH4.5下进行酸沉，以便获得酸沉产物；
将所述酸沉产物进行第二离心，并收集第二离心沉淀物；以及
将所述第二离心沉淀物进行水洗至中性，以便获得所述核桃蛋白，
利用碱提酸沉法从脱脂核桃粉中提取核桃蛋白进一步包括将所述核桃蛋白进行真空冷冻干燥，
所述蛋白酶为选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶的至少一种，
其中，当所述蛋白酶为木瓜蛋白酶时，利用所述木瓜蛋白酶对所述核桃蛋白进行水解的料液比为25g/L，加酶量为3%（质量/体积），pH值为6，水解温度为50℃，水解时间为4h，
当所述蛋白酶为胃蛋白酶时，利用所述胃蛋白酶对所述核桃蛋白进行水解的料液比为25g/L，加酶量为4%（质量/体积），pH值为2，水解温度为55℃，水解时间为4h，
当所述蛋白酶为碱性蛋白酶时，利用所述碱性蛋白酶对所述核桃蛋白进行水解的料液比为25g/L，加酶量为7%（质量/体积），pH值为10，水解温度为60℃，水解时间为2h，
对所述水解产物依次进行超滤处理、第一凝胶色谱处理、第二凝胶色谱处理和反相高效液相色谱处理包括：
利用截留分子量不超过30000的超滤膜对所述水解产物进行超滤处理，以便得到滤液；
将所述滤液进行第一凝胶色谱处理并对所得到的各组分进行血管紧张素转化酶抑制活性检测，以便得到血管紧张素转化酶抑制活性最高的组分作为第一凝胶色谱产物；
将所述第一凝胶色谱产物进行第二凝胶色谱处理并对所得到的各组分进行血管紧张素转化酶抑制活性检测，以便得到血管紧张素转化酶抑制活性最高的组分作为第二凝胶色谱产物；以及
将所述第二凝胶色谱产物进行反相高效液相色谱处理并对所得到的各组分进行血管紧张素转化酶抑制活性检测，以便得到血管紧张素转化酶抑制活性最高的组分作为所述高活性降血压肽，
其中，所述第一凝胶色谱处理采用Sephadex G-25Medium柱，流动相为10mM pH7.0的Tris-HCl，流速为1ml/min，
所述第二凝胶色谱处理采用SuperdexTM Peptide10/300GL柱，流动相为20mM pH7.0的PBS，流速为0.5ml/min，
所述反相高效液相色谱处理采用Zorbax SB-C18柱，流动相A为0.06%TFA的水，流动相B为0.05%TFA的乙腈，流速为0.8ml/min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210142379.0A CN102757479B (zh) | 2012-05-09 | 2012-05-09 | 高活性降血压肽及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210142379.0A CN102757479B (zh) | 2012-05-09 | 2012-05-09 | 高活性降血压肽及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102757479A CN102757479A (zh) | 2012-10-31 |
| CN102757479B true CN102757479B (zh) | 2014-04-30 |
Family
ID=47052158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210142379.0A Expired - Fee Related CN102757479B (zh) | 2012-05-09 | 2012-05-09 | 高活性降血压肽及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102757479B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105693817B (zh) | 2014-11-27 | 2020-06-05 | 西北大学 | 一类三肽化合物及其制备方法与应用 |
| CN112795611B (zh) * | 2021-01-25 | 2023-04-28 | 昆明生物制造研究院有限公司 | 一种不可溶性蛋白制备核桃蛋白多肽的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1341032C (en) * | 1987-01-23 | 2000-06-20 | John L. Krstenansky | Anticoagulant peptides |
| US5955314A (en) * | 1996-11-08 | 1999-09-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Regulator of cell signaling |
| CN101228918A (zh) * | 2007-01-24 | 2008-07-30 | 西北农林科技大学 | 一种核桃多肽粉的制作方法 |
-
2012
- 2012-05-09 CN CN201210142379.0A patent/CN102757479B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Jerry W. Slootstra等.Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries.《Molecular Diversity》.1996,第2卷(第1期),第87-96页. |
| Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries;Jerry W. Slootstra等;《Molecular Diversity》;19961231;第2卷(第1期);第87-96页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102757479A (zh) | 2012-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113215212B (zh) | 一种具有抗氧化和ace抑制功能的大豆蛋白肽及其制备方法 | |
| CN100586958C (zh) | 高纯度载脂蛋白a-i的制备方法 | |
| CN103539831B (zh) | 山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途 | |
| CN101696233B (zh) | 蛋清蛋白血管紧张素转化酶抑制肽及其制备 | |
| CN105218640B (zh) | 一种蚕蛹蛋白源血管紧张素转换酶抑制多肽及其制备方法和应用 | |
| CN103539833B (zh) | 高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途 | |
| CN103204904B (zh) | 一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽及其制备方法和用途 | |
| CN110372778A (zh) | 一种ace抑制肽、制备方法及用途 | |
| CN101768209B (zh) | 具有高体内活性的降血压肽及其制备和纯化方法 | |
| CN109810185A (zh) | 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 | |
| CN102757479B (zh) | 高活性降血压肽及其制备方法 | |
| CN108794570A (zh) | 一种含苯丙氨酸的黄嘌呤氧化酶抑制剂及其用途 | |
| CN110105431B (zh) | 一种芝麻多肽及其提取方法和在制备抗氧化和/或降血压药物中的应用 | |
| CN108395475A (zh) | 一种基于亲和层析的水蛭素分离纯化方法 | |
| CN104693272A (zh) | 牦牛乳乳清蛋白具有抗氧化活性的三肽及其应用和组合物 | |
| CN103740797A (zh) | 一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法 | |
| CN110105430B (zh) | 一种具有血管紧张素转化酶抑制活性的银杏果蛋白肽及其制备方法 | |
| CN104059126A (zh) | 一种降血压肽p16及其制备方法和应用 | |
| CN105223296B (zh) | 一类多肽的纯化方法 | |
| CN101456898B (zh) | 一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法 | |
| CN113072621B (zh) | 一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用 | |
| CN103467593B (zh) | 一种胸腺法新的纯化方法 | |
| CN101628930A (zh) | 一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖介质分离多肽的方法 | |
| WO2021017793A1 (zh) | 一种化学合成酸性多肽的制备方法 | |
| CN108129561A (zh) | 一种ace抑制肽 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140430 |