CN103539831B - 山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途，其中该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽具有SEQ？ID？NO：1所示的氨基酸序列。本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽α-葡萄糖苷酶抑制活性非常高，能够有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，进而能够有效地用于降血糖，以及治疗高血糖、糖尿病药物的制备，并且该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的生产成本低，具有巨大的实用价值和经济效益。

Description

山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及保健性功能食品及药品制备领域。具体地，本发明涉及山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途。

背景技术

糖尿病已经被列为第三大致死性疾病，严重威胁着人类的健康。如何治疗糖尿病已经成为世界范围内的重点研究课题。目前糖尿病患者主要以Ⅱ型糖尿病居多，治疗Ⅱ型糖尿病的药物也有很多种，其中主要有胰岛素促泌剂，双胍类，胰岛素分泌模式调节剂以及α-葡萄糖苷酶抑制剂等。其中，阿卡波糖这类人工合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂在临床上会伴随一些副作用的发生，因此开发更多天然的、安全的α-葡萄糖苷酶抑制剂对Ⅱ型糖尿病的治疗有着重大的意义。

然而，目前制备天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法仍有待改进。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

山杏Armaniacasibirica在我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、甘肃、河北、山西等省区均有分布。山杏仁营养丰富，富含蛋白质、脂肪、矿物质和维生素，其蛋白质、氨基酸总量、必需氨基酸含量均较高，有很高的经济价值和药用价值。而山杏仁蛋白质还具有抗肿瘤、降血压、降血糖、降胆固醇等功效。发明人发现，利用山杏仁粕粉筛选高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽既可以良好利用山杏仁加工的剩余产物，又可以得到高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽。

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种制备天然、高活性的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法及其产品。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。根据本发明的实施例，该α-葡萄糖苷酶抑制肽具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。根据本发明的具体示例，本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的序列为（C端—N端）：苏氨酸-色氨酸（Thr–Trp，TW）。发明人惊奇地发现，本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，其α-葡萄糖苷酶抑制活性非常高，能够有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，进而能够有效地用于降血糖，以及治疗高血糖、糖尿病药物的制备，并且该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的生产成本低，具有巨大的实用价值和经济效益。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备上述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质；利用碱性蛋白酶对所述蛋白质进行水解，以便获得水解产物；以及对所述水解产物依次进行超滤处理、凝胶色谱处理、第一反相高效液相色谱处理和第二反相高效液相色谱处理，以便获得所述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。发明人惊奇地发现，利用该方法能够有效地制备具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，并且该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽纯度高，能够有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，进一步通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性能够控制血压，从而能够有效地应用于治疗高血压药物的制备。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽在制备药物或功能食品中的用途，所述药物或功能食品用于降血糖。

此外，需要说明的是，本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法，现阶段尚未见报道，其是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作，从山杏仁粕粉中提取获得的新的、天然、安全的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，这为更安全、有效的降血糖药物的制备提供了新希望。而本领域的技术人员可以理解的是，还可以根据本发明提供的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸序列，即SEQIDNO：1所示的：苏氨酸-色氨酸（Thr–Trp，TW），利用肽自动合成仪通过合成方法人工合成该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽过程中的SephadexG25Medium柱层析色谱图；

图2显示了根据本发明一个实施例，制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽过程中的第一反相高效液相色谱图；

图3显示了根据本发明一个实施例，制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽过程中的第二反相高效液相色谱处理的色谱图，其中，

图3A显示了经过第一反相高效液相色谱处理的高α-葡萄糖苷酶抑制活性组分P3的第二反相高效液相色谱图，

图3B显示了经过第一反相高效液相色谱处理的高α-葡萄糖苷酶抑制活性组分P4的第二反相高效液相色谱图；

图4显示了实施例1中筛选获得的两种山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的质谱图，其中，

图4A显示了第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的质谱图，

图4B显示了第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的质谱图；

图5显示了实施例1中筛选获得的第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的体外模拟消化实验结果，其中，

图5A显示了体外模拟消化前，第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图，

图5B显示了体外模拟消化后，第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图；

图6显示了实施例1中筛选获得的第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的体外模拟消化实验结果，其中，

图6A显示了体外模拟消化前，第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图，

图6B显示了体外模拟消化后，第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。根据本发明的实施例，该α-葡萄糖苷酶抑制肽具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。根据本发明的具体示例，本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的序列为（C端—N端）：苏氨酸-色氨酸（Thr–Trp，TW）。发明人惊奇地发现，本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，其α-葡萄糖苷酶抑制活性非常高，能够有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，进而能够有效地用于降血糖，以及治疗高血糖、糖尿病药物的制备，并且该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的生产成本低，具有巨大的实用价值和经济效益。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备上述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：

首先，利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质。其中，根据本发明的实施例，在本发明的制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法中，利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质包括蛋白质：将所述脱脂山杏仁粕粉与水按照1g：14ml的比例进行混合，并使所得混合物在pH9.0、温度37摄氏度的条件下进行水解60min，以便获得碱提产物；将所述碱提产物进行第一离心，并收集第一离心上清液；将所述第一离心上清液在等电点pH4.1条件下进行酸沉，以便获得酸沉产物；将所述酸沉产物进行第二离心，并收集第二离心沉淀物；以及将所述第二离心沉淀物进行水洗至中性，以便获得所述蛋白质。由此，能够从脱脂山杏仁粕粉中高效地提取获得蛋白质

根据本发明的另一些实施例，在本发明的制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法中，利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质可以进一步包括将所述蛋白质进行真空冷冻干燥蛋白质蛋白质。由此，在真空低温的环境下能够挥干溶剂，维持蛋白质的活性。

接着，利用碱性蛋白酶对所述蛋白质进行水解，以便获得水解产物。其中，根据本发明的实施例，在本发明的制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法中，可以采用的碱性蛋白酶的种类以及对蛋白质进行水解的条件均不受特别限制，只要能够使上述提取获得的蛋白质有效水解，且有利于后续筛选获得目的多肽即可。根据本发明的一些优选实施例，在本发明的制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法中，所述碱性蛋白酶为Alcalase，利用碱性蛋白酶Alcalase对所述蛋白质进行水解的料液比为50g/L，加酶量为2%（m/m），pH值为9.0，水解温度为50℃，水解时间为6h。本发明的发明人惊奇的发现，利用碱性蛋白酶Alcalase，通过上述水解条件，能够高效地制备获得本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。其中，在本文中所采用的术语“料液比”是指蛋白质与去离子水的质量体积比，如“利用碱性蛋白酶Alcalase对所述蛋白质进行水解的料液比为50g/L”中的料液比是指蛋白质与去离子水的质量体积比为50g/L。

在得到水解产物之后，还需要对水解产物进行后续处理，以便从中筛选获得山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。根据本发明的实施例，对所述水解产物依次进行超滤处理、凝胶色谱处理、第一反相高效液相色谱处理和第二反相高效液相色谱处理，以便获得所述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

根据本发明的一些实施例，进行超滤处理、凝胶色谱处理、第一反相高效液相色谱处理和第二反相高效液相色谱处理的条件并不受特别限制，只要能够从水解产物中有效筛选获得本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽即可。根据本发明的一些具体示例，在本发明的制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法中，对所述水解产物依次进行超滤处理、凝胶色谱处理、第一反相高效液相色谱处理和第二反相高效液相色谱处理包括：

首先，利用截留分子量为5000的超滤膜对所述水解产物进行超滤处理，以便得到滤液。

接着，将所述滤液进行凝胶色谱处理并对所得到的各组分进行α-葡萄糖苷酶抑制活性检测，以便将α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的组分作为凝胶色谱产物。根据本发明的实施例，所述凝胶色谱处理采用SephadexG-25Medium柱，流动相为10mMpH7.0的Tris-HCl，流速为1ml/min。

接下来，将所述凝胶色谱产物进行第一反相高效液相色谱处理并对所得到的各组分进行α-葡萄糖苷酶抑制活性检测，以便将α-葡萄糖苷酶抑制活性较高的组分作为第一反相高效液相色谱处理产物。

然后，将所述第一反相高效液相色谱处理产物进行第二反相高效液相色谱处理，以便对所述第一反相高效液相色谱处理产物进行纯化，获得所述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

根据本发明的一些实施例，所述第一反相高效液相色谱处理和所述第二反相高效液相色谱处理均采用ZorbaxSB-C18柱，流动相A为0.06%TFA的水，流动相B为0.05%TFA的乙腈，流速为0.8ml/min。由此，能够从水解产物中有效地筛选获得高纯度的本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

根据本发明的另一些实施例，可以进一步包括对所述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，依次进行质谱分析和氨基酸序列测定。由此，能够确定有效地获得具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

发明人惊奇地发现，利用本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法，能够有效地制备具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，并且该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽纯度高，能够有效地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，进一步通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性能够有效控制血糖水平，从而能够有效地用于治疗糖尿病药物的制备。

根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽在制备药物或功能食品中的用途，所述药物或功能食品用于降血糖。

本领域技术人员可以理解，将前述α-葡萄糖苷酶抑制活性非常高的本发明的α-葡萄糖苷酶抑制肽，添加任意药学上可接受的赋形剂，即可制备获得降血糖药物，而添加任意食品学上可接受的添加剂，即可制备获得能够降血糖的功能食品。因而，本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽能够有效用于制备降血糖的药物或功能食品。其中，所述赋形剂的种类不受特别限制，只要能够使药物形成容易进行给药的剂型（例如胶囊剂、丸剂、片剂、颗粒剂、口服液体、内服膏剂、气雾剂或喷雾剂）即可。根据本发明的一些实施例，所述赋形剂为选自粘合剂、填料、涂膜聚合物、增塑剂、助流剂、崩解剂和润滑剂的至少一种。需要说明的是，在本文中所使用的术语“功能食品”应作广义理解，即能够达到特定功能的食品，其可以是任何可被食用的形式，即除了常规的食品形式外，本发明的功能食品还可以为任何形式的保健品、饮品等。

需要再次强调的是，本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作，从山杏仁粕粉中提取获得的新的、天然、安全的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽，其为更安全、有效的降血糖药物的制备提供了新希望。该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法和用途现阶段尚未见报道。

此外，本领域的技术人员可以理解的是，还可以根据本发明提供的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸序列，即SEQIDNO：1所示的：苏氨酸-色氨酸（Thr–Trp，TW），利用肽自动合成仪通过合成方法人工合成该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一般方法：

在本发明的实施例中，所采用的工艺路线由以下步骤构成：

1.利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质：将脱脂山杏仁粕粉与水按1:14（g/mL）比例溶解，在pH9.0，水解温度37℃的条件下水解60min后，终止水解反应，离心取上清液，在等电点pH4.1条件下进行酸沉，离心取沉淀，水洗沉淀至中性，然后将其迅速真空冷冻干燥保存，并通过考马斯亮蓝法测定其蛋白含量。

2.利用碱性蛋白酶Alcalase对上述获得的蛋白质进行水解，以便获得水解产物，其中水解条件为：底物浓度（即料液比）50g/L，加酶量2%（m/m），pH9.0，温度50℃，水解时间6h。

3.超滤处理（通过采用不同的超滤膜，得到不同分子量的活性滤液）：将所得到的水解产物在4℃条件下经不同分子量大小的超滤膜（MWCO30000、10000、5000）进行超滤处理，获得具有不同分子量的滤液，并测定各部分滤液的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性。然后，将滤液采用真空冷冻干燥保存。

4.α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：

以磷酸缓冲液作为对照，向一定浓度的待测样品中加入50_μL25mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液、50μL0.9133mg/mL的PNPG溶液及120μL0.5M（pH6.7）的磷酸缓冲溶液，混匀后于37℃下保温60min，再加入0.67M的Na₂CO₃溶液终止反应，并于405nm下测定反应液的吸光值，然后按照以下公式计算待测样品的α-葡萄糖苷酶抑制率：

其中，A_对照为对照组吸光度值，A_样品为样品组吸光度值。

5.凝胶色谱处理：将上述获得的具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的冻干粉溶解在5ml10mMTris-HCl（pH7.0）中，并经脱气及过膜处理，然后经CXG-1电脑层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）进行层析分离。

流动相为：10mMTris-HCl（pH7.0）。

色谱柱条件：SephadexG25Medium柱（1.6cm×60cm；Pharmacia，USA），流速为1ml/min，整个设备系统在4℃下进行。洗脱峰在280nm波长处进行检测并收集，将α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的组分（检测方法如前所示）收集液迅速进行真空冷冻干燥。

6.第一反相高效液相色谱处理：将通过凝胶色谱处理所得到的高α-葡萄糖苷酶抑制活性的冻干粉溶解于流动相A中，并经脱气过膜处理，然后经反向高效液相色谱柱纯化。流动相A：0.06%TFA的水；流动相B：0.05%TFA的乙腈。

色谱柱条件：ZorbaxSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流速为0.8ml/min。梯度洗脱，流动相B（0-50%）洗脱26min，流动相A（50-100%）洗脱4min，洗脱峰在280nm处进行检测并收集，将α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的组分收集液（检测方法如前所示）迅速进行冷冻干燥。

7.第二反相高效液相色谱处理：将通过第一反相高效液相色谱处理所得到的高α-葡萄糖苷酶抑制活性的冻干粉溶解于流动相A中，并经脱气过膜处理，然后再次经反向高效液相色谱柱纯化。

流动相A：0.06%TFA的水；流动相B：0.05%TFA的乙腈。

色谱柱条件：ZorbaxSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流速为0.8ml/min。梯度洗脱，流动相B（0-50%）洗脱26min，流动相A（50-100%）洗脱4min，洗脱峰在280nm处进行检测并收集，将α-葡萄糖苷酶抑制活性较高的组分收集液（检测方法如前所示）迅速分别进行冷冻干燥。

8.质谱分析：在分离纯化得到山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽之后，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测其分子量。

9.氨基酸序列测定：在纯化山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽后，通过PPSQ-31A全自动蛋白/多肽序列仪（ShimadzuCorporation，日本）测定其氨基酸序列，进一步确定该山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸序列。

10.体外模拟消化实验：α-葡萄糖苷酶抑制肽配置成一定浓度，取15mL与0.2mL模拟胃液混合，用1mol/LHCl调至pH为2.0，于37℃下消化，6h后加入1mL模拟肠液用1mol/LNaHCO₃调节pH至7.8，于37℃继续消化6h，反应结束后调pH为中性，用截留分子量1000的超滤管离心（3000rpm，20min，4℃）除酶，所得滤液保存冻干并测定其α-葡萄糖苷酶抑制率以及消化前后峰面积对比。

实施例1：

根据本发明的制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法，按照以下步骤，制备山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽：

1.蛋白质提取

将脱脂山杏仁粕粉与水按1:14（g/mL）比例溶解，在pH9.0，水解温度37℃的条件下水解60min后，终止水解反应，离心取上清液，在等电点pH4.1条件下进行酸沉，离心取沉淀，水洗沉淀至中性，然后将其迅速真空冷冻干燥保存，并通过考马斯亮蓝法测定其蛋白含量为89.93%。

2.蛋白质水解

利用碱性蛋白酶Alcalase对上述获得的蛋白质进行水解，以便获得水解产物，其中水解条件为：底物浓度（即料液比）50g/L，加酶量2%（m/m），pH9.0，温度50℃，水解时间6h。

3.超滤处理

将所得到的水解产物在4℃条件下经不同分子量大小的超滤膜（MWCO30000、10000、5000）进行超滤处理，并将所得滤液迅速真空冷冻干燥。然后，将各组分冻干粉配置成不同浓度的溶液，并按照一般方法中所述的α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法，分别确定各组分的不同浓度溶液的α-葡萄糖苷酶抑制率，并基于各组分的多个抑制率结果，分别确定不同分子量范围的各组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀值，结果见下表1。

表1不同分子量范围多肽组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀值

分子量	＞30k	10k-30k	5k-10k	＜5k
					IC50(mg/mL)	9.24	5.21	0.602	0.421

4.凝胶色谱处理

将具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的分子量低于5000Da的Alcalase酶解滤液冻干粉，溶解在5mL10mMTris-HCl（pH7.0）中，并经脱气及过膜处理，通过SephadexG-25Medium柱分离纯化，洗脱峰在280nm处检测并收集测定各组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性（方法如步骤3所述），然后将α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的组分收集液迅速进行真空冷冻干燥。其中，凝胶色谱处理的具体方法见“一般方法”。α-葡萄糖苷酶抑制活性检测结果见下表2，色谱图见图1。如图1所示，横坐标表示各组分的分离时间，纵坐标表示各组分在280nm处的吸光度值。

表2凝胶色谱处理获得的各组分的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀值

组分

P1

P2

P3

IC50(mg/mL)

0.291

0.0158

0.137

5.第一、第二反相高效液相色谱处理

将上述获得的α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的组分P2的冻干粉进行第一反相高效液相色谱处理，然后收集各组分并测定其α-葡萄糖苷酶抑制活性（方法如步骤3所述）。其中，α-葡萄糖苷酶抑制活性检测结果见下表3，色谱图见图2。如图2所示，横坐标表示各组分分离时间，纵坐标表示各组分在280nm处的吸光度值。

表3第一反相高效液相色谱处理各组分α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC₅₀值

组分	P3	P4	P5	P6	P7
						IC50(mg/mL)	0.0071	0.0085	0.0094	0.0102	0.0133

将上述获得的高活性组分P3与P4分别进行第二反相高效液相色谱处理，即溶解于流动相A再次利用反相高效液相色谱纯化，收集经过纯化的组分迅速真空冷冻干燥，以便得到两种纯度较高的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。其中，第一、第二反相高效液相色谱处理的条件相同，具体见“一般方法”。第二反相高效液相色谱见图3，其中图3A显示了经过第一反相高效液相色谱处理的高α-葡萄糖苷酶抑制活性组分P3的第二反相高效液相色谱图，图3B显示了经过第一反相高效液相色谱处理的高α-葡萄糖苷酶抑制活性组分P4的第二反相高效液相色谱图。如图3所示，横坐标均表示各组分分离时间，纵坐标均表示各组分在280nm处的吸光度值。

此外，在本文中，将从经过第一反相高效液相色谱处理的高α-葡萄糖苷酶抑制活性组分P3纯化获得的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽称为“第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽”，将从经过第一反相高效液相色谱处理的高α-葡萄糖苷酶抑制活性组分P4纯化获得的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽称为“第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽”。

6.质谱分析及氨基酸测序

将两种山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽依次进行质谱分析及氨基酸测序。其中，上述获得的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的质谱图如图4所示，其中图4A显示了第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的质谱图，图4B显示了第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的质谱图，在图4中横坐标均表示质荷比，纵坐标均表示离子强度。由图4可知，第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的分子量测定值为276.4，第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的分子量测定值为306.4。经氨基酸测序可知，第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，即：色氨酸-丙氨酸（Trp–Ala，WA），其理论分子量为275.31；第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽具有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，即：苏氨酸-色氨酸（Thr–Trp，TW），其理论分子量为305.34。由此可知，所检测的分子量与质谱分析结果基本相符。

其中，具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽即为本发明的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

7.体外模拟消化实验

将上述获得的两种α-葡萄糖苷酶抑制肽配置成0.2mg/ml的溶液，取15mL与0.2mL的模拟胃液（通过将0.075g胃蛋白酶溶于10ml0.1mol/L的HCl溶液中，配置获得该“模拟胃液”）混合，用1mol/LHCl调至pH为2.0，于37℃下进行消化，6h后加入1mL模拟肠液（通过将0.05g胰蛋白酶与0.3g牛胆碱溶于35ml0.1mol/LNaHCO₃溶液中，配置获得该“模拟肠液”）用1mol/LNaHCO₃调节pH至7.8，于37℃继续消化6h，反应结束后调pH为中性，用截留分子量1000的超滤管离心（3000rpm，20min，4℃）除酶，所得滤液保存冻干并测定比较其α-葡萄糖苷酶抑制率以及消化前后的反相高效液相色谱峰面积。其中，消化前后的反相高效液相色谱处理条件均为：流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流动相A平衡15min，流动相A（100%-0），流动相B（0-100%）梯度洗脱30min，流速1ml/min。

其中，图5和图6显示了分别上述两种山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的体外模拟消化实验结果。图5A显示了体外模拟消化前，第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图，图5B显示了体外模拟消化后，第一山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图，图6A显示了体外模拟消化前，第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图，图6B显示了体外模拟消化后，第二山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的反相高效液相色谱图。上述各图中，横坐标均表示各组出峰时间，纵坐标均表示各组分在214nm处的吸光度值。

结果，发明人发现，两种α-葡萄糖苷酶抑制肽的活性和反相高效液相色谱的峰面积基本没有改变。由此，表明上述获得的两种α-葡萄糖苷酶抑制肽均不易被人体胃肠道系统消化而失活。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种制备由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽的方法，其特征在于，包括：

利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质；

利用碱性蛋白酶对所述蛋白质进行水解，以便获得水解产物；以及

对所述水解产物依次进行超滤处理、凝胶色谱处理、第一反相高效液相色谱处理和第二反相高效液相色谱处理，以便获得所述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质包括：

将所述脱脂山杏仁粕粉与水按照重量比1g：14ml的比例进行混合，并使所得混合物在pH9.0、温度37摄氏度的条件下进行水解60min，以便获得碱提产物；

将所述碱提产物进行第一离心，并收集第一离心上清液；

将所述第一离心上清液在等电点pH4.1条件下进行酸沉，以便获得酸沉产物；

将所述酸沉产物进行第二离心，并收集第二离心沉淀物；以及

将所述第二离心沉淀物进行水洗至中性，以便获得所述蛋白质。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用等电点沉淀法从脱脂山杏仁粕粉中提取蛋白质进一步包括将所述蛋白质进行真空冷冻干燥。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶为Alcalase，利用碱性蛋白酶Alcalase对所述蛋白质进行水解的料液比为50g/L，加酶量为2％(m/m)，pH值为9.0，水解温度为50℃，水解时间为6h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述水解产物依次进行超滤处理、凝胶色谱处理、第一反相高效液相色谱处理和第二反相高效液相色谱处理包括：

利用截留分子量为5000的超滤膜对所述水解产物进行超滤处理，以便得到滤液；

将所述滤液进行凝胶色谱处理并对所得到的各组分进行α-葡萄糖苷酶抑制活性检测，以便将α-葡萄糖苷酶抑制活性最高的组分作为凝胶色谱产物；

将所述凝胶色谱产物进行第一反相高效液相色谱处理并对所得到的各组分进行α-葡萄糖苷酶抑制活性检测，以便将α-葡萄糖苷酶抑制活性较高的组分作为第一反相高效液相色谱处理产物；以及

将所述第一反相高效液相色谱处理产物进行第二反相高效液相色谱处理，以便对所述第一反相高效液相色谱处理产物进行纯化，获得所述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述凝胶色谱处理采用SephadexG-25Medium柱，流动相为10mMpH7.0的Tris-HCl，流速为1ml/min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一反相高效液相色谱处理和所述第二反相高效液相色谱处理均是采用ZorbaxSB-C18柱进行梯度洗脱，其中，所述梯度洗脱均为：流动相B(0-50％)洗脱26min，流动相A(50-100％)洗脱4min，洗脱峰在280nm处进行检测并收集；流动相A为0.06％TFA的水，流动相B为0.05％TFA的乙腈；流速为0.8ml/min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对所述山杏α-葡萄糖苷酶抑制肽依次进行质谱分析和氨基酸序列测定。