CN107698659B - 经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ‑葡萄糖苷酶抑制肽，其特征在于：其氨基酸序列为色氨酸‑丝氨酸，结构式为：

本发明要解决的技术问题是提供一种天然的辅助降血糖效果好的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ‑葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法。

Description

经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽及其制 备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法。

背景技术

糖尿病已经成为与心脑血管疾病、癌症、慢性呼吸系统疾病并称的四大威胁人类健康的慢性病之一。通常糖尿病患者通过摄入胰岛素的方法来降低胰岛素抵抗的影响。但是患者长期服用胰岛素会导致胰岛素分泌受损和β-细胞的损失(Clark,1998)。糖尿病作为一种慢性疾病对患者的正常生活造成极大的不便，患者会产生疲劳感并且嗜睡，患病严重的成年人甚至会丧失劳动能力。糖尿病人治疗的唯一方法是服用降糖类药物，但是目前开发的降糖药物主要是以化学合成或生化试剂为主，并且这些药物并不能完全治愈糖尿病。因此对副作用小的天然的降糖药物的研究迫在眉睫。降糖药物主要分为胰岛素及其类似药物、促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、蛋白质糖基化抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素样生长因子和醛糖还原酶抑制剂。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类有效的糖尿病治疗药物，可竞争性抑制小肠内各种α-葡萄糖苷酶活性，减缓α-葡萄糖苷酶对碳水化合的消化作用，减慢淀粉分解成葡萄糖的速度及肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。目前市售的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物主要有阿卡波糖(acrbose)、伏格列波糖(voglibose)和米格列醇(midlitol)，但是这类药物作为处方药长期服用通常会产生一些副作用，如胃胀气、肠绞痛、腹胀或腹泻等。这些药物都是非水解糖类的类似物，对胰腺中的α-淀粉酶抑制能力较强而对小肠上皮的α-葡萄糖苷酶抑制能力较弱，从而使糖类物质在小肠内吸收障碍而停留在小肠，导致被肠道细菌酵解产生较多的气体，造成人体胃肠道不适。

因此，研发对小肠上皮的α-葡萄糖苷酶抑制能力较强而对胰腺分泌的α-淀粉酶抑制能力较弱的药物，一方面减少α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物的副作用，另一方面又控制了餐后血糖水平，是一种理想降糖类药物的研发方向。

山杏是传统的药用植物，山杏仁是优质的植物蛋白源，它的氨基酸组成接近世界粮农组织FAO的标准，主要由易消化的代谢蛋白组成，具有典型的植物蛋白的物化特性。脱苦处理之后的山杏仁蛋白安全无毒，可以开发多种有益生理健康的生物活性和医用价值。山杏仁蛋白源生物活性肽的研究有着广阔的前景，近年来，国内外学者对其进行了深入的研究。山杏仁蛋白作为优质的易消化的植物蛋白，也是生物活性肽的良好来源。它具有降血糖、降血脂、降血压、提高免疫力、抗癌以及抑菌等生物活性，但是山杏仁蛋白源的α-葡萄糖苷酶抑制肽的分离纯化和活性研究在国内外尚属于空白领域。本发明是在发明人在通过系统地分析山杏仁蛋白及其肽的抗氧化能力，筛选出高纯度高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽，并研究山杏仁多肽的体内降血糖能力中得到的一种经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽。发明人在研究的过程中，经过先对山杏仁蛋白的提取及其提取工艺，对山杏仁蛋白氨基酸组成分析研究后，再利用蛋白酶酶解山杏仁蛋白得到活性肽，研究得到经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种ɑ-葡萄糖苷酶抑制活性效果好的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽，其氨基酸序列为色氨酸-丝氨酸，结构式为：

采用本发明的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽,其实际分子量为291.31g/mol。通过测定的E的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀值为0.013±0.06mg/mL；以分子量为依据，以μmol/L为单位，计算得到肽E的IC₅₀值为44.63±0.03μmol/L。

本发明还提供另外一种技术方案：经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤，

一、利用等电点沉淀法提取山杏仁蛋白；

二、利用蛋白酶M酶解制备山杏仁蛋白酶解物多肽；

三、将经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化，得山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽。

进一步，所述步骤二中，利用蛋白酶M酶解制备山杏仁蛋白酶解物多肽的方法为：蛋白酶M对步骤一中得到的山杏仁蛋白进行酶解，酶解后灭酶10min，冷却后离心取上清液，得酶解液，即为山杏仁蛋白酶解物多肽。

进一步，所述步骤二中，蛋白酶M的酶解条件为pH为7.0，温度50℃，底物浓度为50mg/mL，酶添加量与底物的质量比为0.02mg/mg，酶解时间6h。

进一步，所述的步骤三中，对经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化的方法为：

a、超滤酶解液后，真空冷冻干燥，得到山杏仁多肽冻干粉；

b、凝胶层析分离；

c、反相高效液相色谱分离；

d、分子筛分离；

e、反相高效液相色谱纯化，得到ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽。

进一步，所述步骤a中，超滤酶解液后，收集分子量＜5kDa的酶解液，真空冷冻干燥。

进一步，所述步骤一中，等电点沉淀法中，

1)取脱脂山杏仁粕粉，按照液料比加入去离子水，配制成山杏仁蛋白溶液；

2)超声使样品蛋白溶出，调节反应溶液的pH、温度，搅拌提取；

3)提取后，取浸提液离心，收集上清液；

4)用1mol/L HCl调节上清液pH至山杏仁蛋白的等电点，离心，弃去上清液，收集沉淀；

5)用去离子水使沉淀复溶，调节溶液pH值，冷冻干燥，得山杏仁蛋白。

进一步，所述步骤一的2)中，提取温度为37℃，提取时间为60min，pH为9.0，所述的步骤一的1)中，液料比为14mL/g。

进一步，所述的步骤一的4)中，山杏仁蛋白的等电点为pI 4.1。

附图说明

图1为不同酶酶解山杏仁蛋白所得酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

图2为蛋白酶M酶解液0～5kDa组分Sephadex G-25凝胶层析色谱图。

图3为蛋白酶M酶解液分离产物P2组分反相高效液相色谱图。

图4为蛋白酶M酶解液分离得到P2P2组分分子筛色谱图。

图5为蛋白酶M酶解液分离产物e分离峰的高效液相色谱纯化色谱图。

图6为蛋白酶M酶解肽(E)质谱分析图。

图7为Trp-Ser反相高效液相色谱图(模拟消化前)。

图8为Trp-Ser反相高效液相色谱图(模拟消化后)。

具体实施方式

本发明经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽，具体实施方式为：

其制备方法为：

一、利用等电点沉淀法提取山杏仁蛋白；

1)取脱脂山杏仁粕粉(过60目筛)，按照液料比为14mL/g加入去离子水，配制成山杏仁蛋白溶液；

2)在细胞破碎仪下超声10min使样品蛋白部分溶出，调节反应溶液的pH为9.0、温度为37℃，以50r/min匀速搅拌提取60min提取山杏仁蛋白；用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节溶液pH，使溶液pH维持在9.0；

3)提取后，4000r/min，4℃条件下离心20min，收集上清液；

4)用1mol/L HCl调节上清液pH至山杏仁蛋白的等电点pI 4.1，并在5000r/min，4℃下离心15min，弃去上清液，收集沉淀；

5)用去离子水使沉淀复溶，调节溶液pH值至9.0，迅速冷冻干燥，得山杏仁蛋白，并且在-20℃下贮藏以备用。

二、利用蛋白酶M酶解山杏仁蛋白制备山杏仁蛋白酶解物多肽；

①利用蛋白酶M(阿玛诺天野酶制剂商贸有限公司)对步骤一中得到的山杏仁蛋白进行酶解，酶解条件为pH为7.0，温度50℃，底物浓度为50mg/mL，酶添加量与底物的质量比为0.02mg/mg，酶解时间6h；

蛋白酶M“天野”SD，可适用于调味料、低苦味蛋白分解物以及酿造等食品工业，除酸性/中性蛋白酶之外，另含有肽酶，特别在中性环境下作用效果明显。产品为淡黄褐色至淡褐色粉末状，蛋白酶活力≥5.5U/g。

②酶解后灭酶10min，冷却后离心取上清液，得酶解液，即为山杏仁蛋白酶解物多肽。

据试验研究：

时间的单因素试验：取10g山杏仁蛋白粉，加入200mL去离子水中配制成山杏仁蛋白溶液。向山杏仁蛋白溶液中加入150mg蛋白酶M，酶解过程中保持整个pH稳定在7.0，温度保持在50℃，分别记录酶解时间为0min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h和24h时1mol/L NaOH的消耗总量。

加酶量的单因素实验：1g山杏仁蛋白粉溶于20mL去离子水中配制成山杏仁蛋白溶液，分别加入5mg、10mg、15mg、20mg和25mg蛋白酶M，保持反应体系pH7.0、温度50℃，酶解时间为6h，分别计算各条件下山杏仁蛋白溶液的水解度。

经过正交试验可确定,蛋白酶M的酶解最佳条件为pH中性，温度50℃，底物浓度为50mg/mL，酶添加量为0.02(酶添加量与底物质量比，mg/mg)，酶解时间为6～8h。蛋白酶M酶解的正交实验得出，最优的酶解条件为：温度50℃，pH7.0，时间6h。水解度为31.59％。

三、将经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化，得山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽，具体步骤为：

a、超滤酶解液后，收集分子量＜5kDa的酶解液，真空冷冻干燥，得到山杏仁多肽冻干粉；

将步骤二中的酶解液经过水相0.45μm微孔滤膜过滤后，选用分子量5kDa的Pellicon Biomax滤膜在Millipore Labscale TFF系统(4℃，6000g)上进行分子量截留，收集滤液与残留液，最终得到分子量大小范围为0～5kDa。将超滤得到的酶解液迅速真空冷冻干燥，得到山杏仁多肽冻干粉，在-20℃下贮藏备用。

b、凝胶层析分离；

葡聚糖凝胶前处理：去离子水经过0.22μm水系微孔滤膜过滤，并超声脱气2h，备用。将25g葡聚糖凝胶Sephadex G-25Medium颗粒溶于400mL去离子水中，在室温下溶胀至凝胶体积不再增大，随后用去离子水反复洗涤至无杂质，在4℃下贮存备用。

葡聚糖凝胶柱填充：层析柱规格(1.6cm×60cm)，使用前用去离子水清洗干净。固定层析柱，缓缓加入去离子水，待液面在柱高的四分之一左右，关闭出口端，将葡聚糖凝胶缓缓加入层析柱中，整个过程要不断搅拌柱中胶体防止凝胶沉降分层，待凝胶沉积达到1cm以上时，打开层析柱的出样口，继续倾倒葡聚糖凝胶直至距离层析柱顶端5cm处，最后3～5个柱体积的去离子水平衡层析柱，直至葡聚糖凝胶液面不再下降。整个操作过程要缓慢持续，防止气泡的产生。

进样、洗脱与收集：将样品溶于中性Tris-HCl溶液(10mmol/L pH7.0，其中含有150mmol/L NaCl，过0.22μm有机相微孔滤膜并脱气)，配成溶度为100mg/mL的样品溶液。其中，流动相为Tris-HCl溶液，流速：1mL/min，自动收集器设定每5min收集一管分离液。

收集各组分冷冻干燥，冻干粉并分别测定各组分的α-葡萄糖苷酶的抑制率，选取抑制能力较高的组分，进一步利用高效液相色谱法进行分离。

c、反相高效液相色谱分离；

分离出的高活性的冻干粉溶解在0.6mL 0.06％的三氟乙酸TFA的水溶液中，在1200rpm下离心10min，取上清液，经过超声脱气10min，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤处理，然后经过

avant 25系统分离，色谱柱为Zorbax SB-C18反相高效液相色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。流动相A(0.06％三氟乙酸的水溶液)为平衡缓冲液，流动相B(0.05％三氟乙酸的乙腈溶液)为洗脱缓冲液。分离纯化的洗脱梯度为流动相B由0～50％至少5个柱体积(CV，column volumes)，流动相B由50％～100％至少0.2CV。进样量为500μL，流速0.8mL/min，在280nm处检测并收集各组分。测定各组分α-葡萄糖苷酶的抑制率，将抑制能力高的组分真空冷冻干燥，于－20℃下贮存备用。

d、分子筛分离；

分离出的高活性的冻干粉溶解在1mL 20mmol/L PBS缓冲溶液(pH7.0)中，在1200rpm下离心10min，取上清液，超声脱气10min后用0.22μm有机相微孔滤膜过滤，然后经过

avant 25系统分离。分子筛的柱子为Superdex^TM Peptide 10/300GL(10mm×300mm)。平衡缓冲液为20mmol/L PBS缓冲溶液(pH7.0)，流速0.5mL/min，进样量为100μL，洗脱梯度为等梯度2个CV，洗脱峰在280nm处检测并收集。

e、反相高效液相色谱继续纯化，得到ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽。

分离得到的高活性的山杏仁多肽冻干粉，用反相高效液相色谱继续纯化，进一步得到高纯度高活性的ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽。

五、试验研究

1)三种酶的山杏仁蛋白酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制肽的抑制效果研究

选取抗氧化能力较强的蛋白酶M、Prote AX和Alcalase三种酶的山杏仁蛋白酶解产物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定。将上述三种酶的酶解液冻干粉分别配制成不同浓度：0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL，并分别测定其α-葡萄糖苷酶抑制率。以山杏仁多肽的浓度为横坐标，以其α-葡萄糖苷酶抑制率为纵坐标作图，如图1所示，可以看出三种酶酶解产物均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制率，随着山杏仁多肽浓度的升高各种酶解产物的α-葡萄糖苷酶抑制能力均有不同程度的增大，其中Alcalase蛋白酶的酶解产物效果较突出，浓度在10mg/mL时，酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制率达到33.95％；蛋白酶M的酶解产物较其他两组效果较弱，但是在浓度为10mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率也能达到15.98％。

2)高纯度的蛋白酶M酶解液的分离纯化的分子量条件研究蛋白酶M酶解所得到的酶解液，采用Millipore Labscale TFF系统，经过30kDa、10kDa、5kDa三种Pellicon Biomax滤膜超滤，得到大于30kDa、10kDa～30kD、5kDa～10kD、0kDa～5kD四种组分，分别测定其α-葡萄糖苷酶抑制率，并以α-葡萄糖苷酶抑制率的IC₅₀值作为比较指标。不同分子量(0～5kDa，5～10kDa and 10～30kDa)的蛋白酶Prote AX酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制活性如表1所示：

不同分子量的蛋白酶M酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制活性如表1所示：

表1不同分子量的蛋白酶M酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制活性

分子量(kDa)	IC<sub>50</sub>/(mg/mL)
		>30	20.34±0.03
10～30	18.26±0.01
		5～10	1.76±0.05
0～5	0.38±0.02

由表1数据可知，分子量范围为0～5kDa的蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白酶解液，与另外三种分子量范围的酶解液比较，有最高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此收集分子量＜5kDa的酶解液组分进行分离纯化。

首先用G-25葡聚糖凝胶对蛋白酶M酶解液0～5kDa组分分离，由蛋白酶M酶解液0～5kDa组分Sephadex G-25凝胶层析色谱图可知，如图2所示，在280nm处得到3个主要吸收峰(P1、P2和P3)，由表2蛋白酶M酶解液0～5kDa组分分离峰的α-葡萄糖苷酶抑制活性可知，其中吸收峰P2有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC₅₀＝0.045±0.003mg/mL)。

表2蛋白酶M酶解液0～5kDa组分分离峰的α-葡萄糖苷酶抑制活性

组分	IC<sub>50</sub>/(mg/mL)
		P1	0.111±0.001
P2	0.045±0.003
		P3	0.089±0.006

收集凝胶层析的洗脱峰P2，进一步用反相高效液相色谱C18柱分离，得到更高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽溶液。由图3所示的蛋白酶M酶解液分离产物P2组分反相高效液相色谱图可以看出，P2经反相高效液相色谱分离，在280nm处得到7个色谱峰(P2P1、P2P2、P2P3、P2P4、P2P5、P2P6、P2P7)，其α-葡萄糖苷酶抑制活性结果见表3所示，

表3蛋白酶M酶解液分离产物P2组分分离峰的α-葡萄糖苷酶抑制活性

组分	IC<sub>50</sub>/(mg/mL)
		P2P1	0.032±0.002
P2P2	0.019±0.001
		P2P3	0.029±0.003
P2P4	0.023±0.006
		P2P5	0.056±0.002
P2P6	0.043±0.001
		P2P7	0.078±0.002

由表2可见，洗脱峰P2P2的活性最高，经过分子筛SuperdexTM Peptide 10/300GL柱分离后，所得色谱图如图4所示，选取主峰e进行二次反相高效液相色谱的纯化，如图5所示，最终得到高纯度高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽E(IC₅₀＝0.013±0.06mg/mL)。

六、对本发明获得的α-葡萄糖苷酶抑制肽的质谱及氨基酸序列分析

经蛋白酶M酶解获得的高活性山杏仁蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽E的质谱结果如图6所示，测定其分子量为：290.1g/mol。经过N-端氨基酸序列分析，肽E的氨基酸序列为色氨酸-丝氨酸(Trp-Ser)，其结构式为：

其实际分子量为291.31g/mol。通过测定的E的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC₅₀值为0.013±0.06mg/mL；以分子量为依据，以μmol/L为单位，计算得到肽E的IC₅₀值为44.63±0.03μmol/L。

七：对本发明获得的α-葡萄糖苷酶抑制肽模拟消化稳定性分析

选取胃蛋白酶、胰蛋白酶对4种新获得的α-葡萄糖苷酶抑制肽进行模拟消化环境的稳定性测定，采用反相高效液相色谱测定消化前后各抑制肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性、峰面积和保留时间。测定结果如图7、图8所示：图7和图8分别表示消化前后肽A:Trp-His的色谱图，其各项指标的具体测定结果见表4：

表4

Trp-Ser	IC<sub>50</sub>/(μmol/L)	峰面积/(μV·s)	保留时间/min
				消化前	44.63±0.03	3967345	12.69
消化后	24.71±0.02	3961694	12.52

由以上数据可以得出，肽E Trp-Ser经过胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟胃肠液消化前后的峰面积，保留时间和α-葡萄糖苷酶抑制活性只是略有不同，结果表明，本发明经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽，肽E Trp-Ser经过模拟体内消化，仍能保持很好的稳定性和活性。

本发明经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽中Trp-Ser氨基酸的氨基酸序列表为：

<110>重庆三峡学院

<120>经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法

<160>1

<210>1

<211>2

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽

<400>1

Trp-Ser。

对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

<110> 重庆三峡学院

<120>经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法

<160>1

<210>1

<211>2

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽

<400>1

Trp-Ser

Claims (6)

1.经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

一、利用等电点沉淀法提取山杏仁蛋白；

二、利用蛋白酶M酶解山杏仁蛋白制备山杏仁蛋白酶解物多肽；

三、将经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化，得山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽，所述山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的序列为色氨酸-丝氨酸；

所述步骤二中，利用蛋白酶M酶解制备山杏仁蛋白酶解物多肽的方法为：蛋白酶M对步骤一中得到的山杏仁蛋白进行酶解，酶解后灭酶10min，冷却后离心取上清液，得酶解液，即为山杏仁蛋白酶解物多肽；

蛋白酶M的酶解条件为pH为7.0，温度50℃，底物浓度为50mg/mL，酶添加量与底物的质量比为0.02mg/mg，酶解时间6h；

山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸序列为色氨酸-丝氨酸，结构式为：

2.根据权利要求1所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤三中，对经蛋白酶M酶解制备的山杏仁蛋白酶解物多肽分离纯化的方法为：

a、超滤酶解液后，真空冷冻干燥，得到山杏仁多肽冻干粉；

b、凝胶层析分离；

c、反相高效液相色谱分离；

d、分子筛分离；

e、反相高效液相色谱纯化，得到ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽。

3.根据权利要求2所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，超滤酶解液后，收集分子量＜5kDa的酶解液，真空冷冻干燥。

4.根据权利要求3所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，等电点沉淀法中，

1)取脱脂山杏仁粕粉，按照液料比加入去离子水，配制成山杏仁蛋白溶液；

2)超声使样品蛋白溶出，调节反应溶液的pH、温度，搅拌提取；

3)提取后，取浸提液离心，收集上清液；

4)用1mol/L HCl调节上清液pH至山杏仁蛋白的等电点，离心，弃去上清液，收集沉淀；

5)用去离子水使沉淀复溶，调节溶液pH值，冷冻干燥，得山杏仁蛋白。

5.根据权利要求4所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于：所述步骤一的2)中，提取温度为37℃，提取时间为60min，pH为9.0，所述的步骤一的1)中，液料比为14mL/g。

6.根据权利要求5所述的经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤一的4)中，山杏仁蛋白的等电点为pI 4.1。

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