CN105175569B

CN105175569B - 从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法

Info

Publication number: CN105175569B
Application number: CN201510707853.3A
Authority: CN
Inventors: 邹登峰; 张小玲; 肖胜军; 马硕; 陈素; 陈素一
Original assignee: Guilin Medical University
Current assignee: Guilin Medical University
Priority date: 2015-10-27
Filing date: 2015-10-27
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2035-10-27
Also published as: CN105175569A

Abstract

本发明提供了从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，包括以下步骤：1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；4)将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理10～60s，然后经截留分子量为10000的透析袋透析，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析，取透过液浓缩，再加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。本发明得到的金花茶多糖具有较好的免疫活性。

Description

从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法

技术领域

本发明属于生物提取技术领域，具体涉及从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法。

背景技术

金花茶(Camellia chrysantha(Hu)Tuyama)属山茶科山茶属金花茶组植物，被誉为“茶族皇后”和“植物界大熊猫”。金花茶叶作为广西壮族民间传统的一种中草药，具有降血糖、降血脂、抑制肿瘤生长、提高机体免疫能力等多种生理功能，其中，金花茶多糖被认为是重要的功效成分之一。《金花茶多糖抗小鼠免疫性肝损伤作用的研究》(发表于华西药学杂志，2014,9(5)：525～527)公开了金花茶多糖的提取方法为：将干燥的金花茶叶粗粉1kg加入10L石油醚回流脱脂提取2次，每次提取1.5h,挥尽药渣中的石油醚后，沸水提取2次，每次2h，合并提取液，浓缩至150ml，用氯仿-正丁醇(3:1)多次萃取，得到除去蛋白质的上清液，加95％乙醇沉淀过夜，抽滤，弃去上清液，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得金花茶粗多糖。经DE52型树脂层析柱洗脱，真空干燥得粉末状金花茶多糖，采用苯酚-硫酸法显色、紫外-可见分光计测定并计算纯度为69.16％。该文献还进一步公开了卡介苗联合脂多糖诱导小鼠出现免疫性肝损伤，当小鼠体内细胞接受到免疫攻击时，表现为内脏发生损伤，如肝脾肿大造成的指数升高以及免疫低下所致的胸腺缩小，这表明BCG联合LPS具有对靶器官特异攻击性。经金花茶多糖治疗后，小鼠脏器损伤程度明显减轻，与HE染色病理学检查的结果一致，这表明金花茶多糖通过恢复机体脏器活性而增强免疫力，从而抑制肝细胞的免疫毒性。上述文献虽然公开了金花茶多糖具有一定的免疫活性，但是免疫活性不高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，该方法提取得到的金花茶多糖的免疫调节效果比现有的金花茶多糖显著提高。

本发明提供的技术方案是从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，包括以下步骤：

1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；

2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；

3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，再加入蛋白酶酶解，得到酶解液；

4)将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理10～60s，然后经截留分子量为10000的透析袋透析24～72h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析24～72h，取透过液浓缩，再加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；

5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，然后加蒸馏水溶解，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。

步骤1)中，加水提取是指往金花茶叶中加入其重量20～30倍的水，回流提取2～3次，每次提取1～3h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液。

步骤2)中，将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏。

步骤2)中，所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90～95v％的乙醇至醇含量为80～85v％。

步骤3)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2～4倍，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2～4倍。

步骤3)中，蛋白酶的用量为金花茶叶干重的0.3～3％，酶解温度为40～60℃，酶解时间为1～3h。蛋白酶可以将提取物中的大分子蛋白质酶解为多肽和氨基酸。

步骤4)中，将酶解液置于频率为1000～5000kHz超声波下处理10～60s，可以将分子量极大的多糖(果胶)的部分糖链断开，降低分子量，降低粘度，提高水溶性，增强免疫活性。超声波处理时间为10～60s是为了确保仅断裂分子量大于50万的多糖，且多糖分子的断裂程度较小，不破坏活性单元，降低分子量，提高水溶性，并增强免疫活性。

超声波处理后的酶解液先经截留分子量为10000的透析袋进行第一次透析，小分子色素、多肽和氨基酸和蛋白酶将透过透析袋滤除，大大提高保留液的纯度。再将保留液经截留分子量为500000的透析袋透析24～72h，得到分子量在10000至500000的金花茶多糖的流出液，所述透过液(流出液)浓缩是指浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏。所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90～95v％的乙醇至醇含量为80～85v％。

步骤5)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2～4倍，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2～4倍。

本发明采用超高频率超声波将分子量极大的多糖分子(分子量在500000以上)中的部分糖苷键断裂，降低其分子量，降低粘度，提高水溶性，大大增强了终产物的免疫活性。经检测，终产物的纯度为98.6％以上。

具体实施方式

以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。

实施例1

1)将金花茶干叶粉碎，加入其重量20倍的水，回流提取2次，每次提取1h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；

2)将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，加入90v％的乙醇至醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2倍，再加入金花茶叶干重0.3％的蛋白酶，在40℃下酶解时间为1～3h，酶灭活，得到酶解液；

4)将酶解液置于频率为1000kHz超声波下处理10s，然后经截留分子量为10000的透析袋透析24h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析24h，取透过液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，加入90v％的乙醇至醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2倍，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98.6％。

实施例2

1)将金花茶干叶粉碎，加入其重量30倍的水，回流提取3次，每次提取3h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；

2)将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.3的浸膏，加入95v％的乙醇至混合液中醇含量为85v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的4倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，再加入金花茶叶干重3％的蛋白酶，在60℃下酶解时间为3h，酶灭活，得到酶解液；

4)将酶解液置于频率为5000kHz超声波下处理60s，然后经截留分子量为10000的透析袋透析72h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析72h，取透过液浓缩至60℃下相对密度为1.3的浸膏，加入95v％的乙醇至醇含量为85v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的4倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98.8％。

实施例3

1)将金花茶叶粉碎，加入其重量25倍的水，回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；

2)将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.2的浸膏，加入90v％的乙醇至混合液中醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的3倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的3倍，再加入金花茶叶干重1.5％的蛋白酶，在50℃下酶解时间为2h，酶灭活，得到酶解液；

4)将酶解液置于频率为3000kHz超声波下处理40s，然后经截留分子量为10000的透析袋透析48h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析48h，取透过液浓缩至60℃下相对密度为1.2的浸膏，加入90v％的乙醇至醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的3倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的3倍，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98.7％。

实施例4

1)将金花茶叶粉碎，加入其重量20倍的水，回流提取3次，每次提取1h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液得到水提液；

2)将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.3的浸膏，加入90v％的乙醇至混合液中醇含量为85v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

3)将步骤2)的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的4倍，再加入金花茶叶干重0.3％的蛋白酶，在60℃下酶解时间为1h，酶灭活，得到酶解液；

4)将酶解液置于频率为1000kHz超声波下处理60s，然后经截留分子量为10000的透析袋透析24h，取保留液经截留分子量为500000的透析袋透析72h，取透过液浓缩至60℃下相对密度为1.1的浸膏，加入95v％的乙醇至醇含量为80v％，静置沉淀，抽滤，取沉淀物备用；

5)将步骤4)所述的沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的4倍，然后加蒸馏水溶解，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2倍，活性炭脱色，过滤，干燥，即为金花茶多糖。经检测，纯度为98.8％。

实验例

1、金花茶多糖对大鼠免疫性肝损伤的影响

选取70只昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄各半,随机分为7组，分别为空白组、模型组、阳性对照组和实验组1～4，实验动物饮用自来水，置室温20～25℃，湿度60～75％的实验室环境里适应1周后开始实验。实验第一天除空白组外，其余各组大鼠均腹腔注射BCG(卡介苗)8mg(约5×10⁷个活菌)。第2天起，除空白组外，各组大鼠开始给药，模型组灌胃给药生理盐水，用量为0.2ml/kg；阳性对照组灌胃背景技术的金花茶多糖，用量为0.2g/kg；实验组1～4分别灌胃给药实施例1～4的药物，用量为0.1g/kg。连续给药12d，末次给药末次给药16h后，空白组尾静脉注射生理盐水，其余各组小鼠腹腔注射LPS生理盐水溶液30μg/kg体重，8h后眼球采血。计算肝脏、胸腺和脾脏指数，并采用HE染色进行肝组织病理学检查，采用Elisa法检测肝组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及微粒体一氧化氮(NO)的含量。

表1

注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

由表1可知，模型组小鼠血浆中的肝脏和脾脏系数显著上升，胸腺指数降低。实验组小鼠的肝脏系数、脾脏系数降低，胸腺指数增加，与模型组相比，有显著性差异。模型组小鼠肝组织中的TNF-α、IL-6及NO水平明显增加，与空白组相比有显著差异，说明造模成功。实验组小鼠的肝组织中TNF-α、IL-6及NO的水平降低，与模型组比较有显著差异，可见实验组的多糖提取物对免疫性肝损伤小鼠的肝脏具有一定的保护作用。实验组与阳性对照组相比，肝脏指数、脾脏指数显著降低，胸腺指数显著增加，且TNF-α、IL-6及NO水平明显降低，说明本发明的多糖比背景技术的多糖对免疫性肝损伤小鼠的肝脏具有更好的保护作用。

2、金花茶多糖对小鼠吞噬细胞及指数的影响

取体重为20g±2g的昆明种小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，分别为空白组、模型组(生理盐水按0.2ml/kg体重)、实验组1～4(依次给药实施例1～4的金花茶多糖，按0.1g/kg体重给药)和阳性对照组(背景技术的金花茶多糖按0.2g/kg体重给药)。灌胃给药，每天1次，连续给药7d。给药第2天及第5天除正常组外，其余各组小腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，造免疫抑制小鼠模型。给药第5d，除正常组外，各组小鼠腹腔注射2％淀粉生理盐水溶液1.5ml，末次给药24h后，各组小鼠腹腔注射2％(CRBC：NS,V/V)的CRBC悬浮液1ml,2h后颈椎脱臼处死，轻揉腹部，抽取腹腔液0.5ml,计算吞噬百分率及吞噬指数。

表2

组别	吞噬百分数	吞噬指数
			空白组	34.6±3.91	0.57±0.13
模型组	20.22±3.12**	0.32±0.09*
			阳性对照组	35.53±4.24△	0.59±0.15△△
实验组1	56.82±5.33△△	0.79±0.18△△
			实验组2	58.13±3.29△	0.80±0.16△△
实验组3	59.42±5.34△△	0.81±0.20△
			实验组4	57.16±6.10△	0.79±0.07△△

由表2可知，模型组吞噬百分数及吞噬指数显著低于空白组,说明免疫抑制小鼠模型成功。其中实验组和模型组之间有显著差异，表明金花茶多糖能明显提高Cy所致免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分数及吞噬指数。实验组与阳性对照组相比，吞噬百分数与吞噬指数显著提高，可知，本发明的金花茶多糖较背景技术的金花茶多糖对免疫抑制小鼠具有更好的非特异性免疫功能。

3、金花茶多糖对小鼠血清溶血素水平的影响

取体重20g±2g昆明种小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，每组10只，分别为空白组、模型组(生理盐水按0.2ml/kg体重)、阳性对照组(背景技术的金花茶多糖按0.2g/kg体重给药)和实验组1～4(依次给药实施例1～4的金花茶多糖，按0.1g/kg体重给药)。灌胃给药，每天1次，连续给药7d。给药第2天及第5天除正常组外，其余各组小腹腔注射环磷酰胺80mg/kg，造免疫抑制小鼠模型。于初次给药的第7d各组小鼠腹腔注射20％绵羊红细胞(SRBC)0.2ml，免疫后第4d，去眼球取血，分离血清，将血清用生理盐水稀释500倍后供测定。

反应管内依次加入经稀释的小鼠血清1ml，5％SRBC 0.5ml,10％补体1ml，置37℃恒温水浴中保温30min，然后移至冰浴中终止反应，1500r/min离心5min，取上清液1ml，加都氏试剂3ml，摇匀放置10min，于540nm波长测定样品吸光度值，以不加血清二用生理盐水代替，但同样加入绵羊红细胞及补体的作为样品空白对照管，测定吸光度值。

取5％SRBC 0.25ml，加都氏试剂至4ml，摇匀放置10min于540nm波长比色读取吸光度，即为SRBC半数溶血时的吸光度值(HC₅₀)。

表3

组别	半数溶血值(HC₅₀)
		正常组	18.62±4.35
模型组	10.55±2.32*
		阳性对照组	19.23±4.16△
实验组1	32.87±5.53△△
		实验组2	33.12±5.10△△
实验组3	34.01±4.33△
		实验组4	33.10±6.03△

由表3可知，实验组的金花茶多糖可促进免疫抑制小鼠的血清溶血素生成，在促进溶血素生成上，与模型组存在显著差异，说明金花茶多糖能显著对抗CY所致小鼠血清溶血素形成的抑制作用。实验组与阳性对照组相比，实验组的金花茶多糖对免疫反应后期阶段抗体分泌细胞形成具有更好的增强作用。

Claims

1.从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将金花茶叶加水提取，得到水提液；

2)将水提液浓缩后，加入乙醇沉淀，取沉淀物备用；

2.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤1)中，加水提取是指往金花茶叶中加入其重量20～30倍的水，回流提取2～3次，每次提取1～3h，合并提取液，过滤，滤液即为水提液。

3.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤2)中，将水提液浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏。

4.根据权利要求1或3所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤2)中，所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90～95v％的乙醇至醇含量为80～85v％。

5.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤3)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2～4倍，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2～4倍。

6.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤3)中，蛋白酶的用量为金花茶叶干重的0.3～3％，酶解温度为40～60℃，酶解时间为1～3h。

7.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤4)中，所述透过液浓缩是指浓缩至60℃下相对密度为1.1～1.3的浸膏。

8.根据权利要求1或7所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤4)中，所述加入乙醇沉淀是指往浓缩液中加入90～95v％的乙醇至醇含量为80～85v％。

9.根据权利要求1所述的从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法，其特征在于：步骤5)中，无水乙醇、丙酮的用量均为沉淀物重量的2～4倍，蒸馏水的用量为洗涤后的沉淀重量的2～4倍。