CN113214412A - 一种刺五加果多糖、多糖的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种刺五加果多糖、多糖的提取方法及其应用,本发明涉及一种多糖、多糖的提取方法及其应用。本发明解决了现有刺五加果实体部位的浪费较为严重的问题。本发明刺五加果多糖分子量为97462;方法:先将刺五加干果粉碎,粗提得到粗多糖ASP;然后采用Sveage法脱蛋白、阴阳离子树脂柱联用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G‑200柱层析纯化得到刺五加果多糖;刺五加果多糖在抑制肺癌A549细胞的应用。本发明的刺五果加多糖是从刺五加果中提取得到的,是一种分子量较小的均一分子量多糖。本发明的刺五果加多糖可成时间剂量依赖性抑制A549细胞增殖,对A549的细胞迁移能力有一定的抑制效果,刺五果加多糖具有较高的抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖、多糖的提取方法及其应用。
背景技术
刺五加有着广泛的研究前景与经济价值,刺五加多糖已被证明出具有多种药理活性,且已广泛应用于临床治疗中。但目前对刺五加多糖及其药理作用的研究多集中于根、茎、叶部位,关于刺五加果实部位的成分开发及其活性研究相对较少,因此也造成了刺五加果实体部位的浪费较为严重。刺五加果实是一种黑色浆果,泡水引用,也可制成果酒、果糕等产品,在日常保健养生中起到了重要作用。多糖是刺五加果实中含量最高的一类成分,提取制备成本较低,有广阔的研究前景与经济价值。肺癌作为威胁人类健康最大的恶性肿瘤之一,其发病率与致死率均高居首位,但目前的主要治疗手段如放射治疗、化学治疗等方法会对人体的其它器官造成严重损害,容易促使其它疾病的产生。目前,尚未有关于刺五加果多糖活性方面报道。
发明内容
本发明为了解决现有刺五加果实体部位的浪费较为严重的问题,而提供了一种刺五加果多糖、多糖的提取方法及其应用。
本发明刺五加果多糖ASPF的分子量为97462,刺五加果多糖ASPF为杂多糖,由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成,其中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
上述刺五加果多糖ASPF的半乳糖醛酸中的糖醛酸含量为22.9%。
上述刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行:
一、将刺五加干果粉碎,过60目筛,将过筛后的粉末用8~12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次,一次3h,合并提取液,烘干;
二、烘干后,按重量份数比为1:10~15的比例加入蒸馏水寖提两次,一次2h,合并水提液,浓缩至原来体积的1/5~1/3;
三、步骤二浓缩后,按照重量份数比为1:10~15的比例向浓缩液中加入浓度为80%的无水乙醇,静置过夜,然后在4000r/min条件下离心4~6min,收集沉淀,再用甲醇洗涤两次,晾干,得到粗多糖ASP;
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液,粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖;
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离,分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化,即得到刺五加果多糖。
上述刺五加果多糖在抑制肿瘤细胞的应用。
本发明的刺五果加多糖是从刺五加果中提取得到的,是一种分子量较小的均一分子量多糖,糖含量89.8%;利用本发明的方法,所得到的刺五果加多糖的提取率为8.459%,相比现有的刺五加根、茎中多糖的提取率,其结果有着较明显的提高。另外,本发明的纯化方法能够脱去多糖中的蛋白及小分子类成分,并得到一均一分子量多糖。经过试验证明,本发明的刺五果加多糖可成时间剂量依赖性抑制A549细胞增殖,在作用时间48h时,其IC50值为424.39μg/mL。能够增强Caspase-3,8,9酶活性并降低Bcl-2/Bax的mRNA表达水平,对A549的细胞迁移能力也存在一定的抑制效果,刺五果加多糖具有较高的抗肿瘤活性。本发明的刺五加多糖本其对肺癌细胞的抑制率有着较为明显的提高。本发明的刺五加果多糖有较高的药用价值。
附图说明
图1是实施例1刺五加果多糖(ASPF)纯化前和纯化后的效果图;
图2是实施例1中DEAE-52柱层析的效果图;
图3是实施例1中CCK-8法检测结果图;
图4是实施例1中凝胶渗透色谱法进行纯度检测的结果图;
图5是实施例1中Sephadex G-200柱层析的结果图;
图6是实施例1中抗肿瘤活性追踪结果的结果图;
图7是具体实施方式二中ASPF纯度鉴定结果图;
图8是具体实施方式二中ASPF的IR扫描图谱;
图9是具体实施方式二中ASPF核磁1H谱图;
图10是具体实施方式二中单糖标准品保留时间结果图;
图11是具体实施方式二中ASPF水解物保留时间结果图;
图12是实施例1中ASPF作用下的人肺癌A549细胞存活率结果图;
图13是实施例1中肿瘤细胞的克隆影响;
图14是实施例1中肿瘤细胞的克隆影响柱形图;
图15是实施例1中ASPF的细胞毒性的结果图;
图16是实施例1中ASPF对A549细胞迁移影响;
图17是实施例1中A549细胞凋亡形态变化的倒置显微镜图片;
图18是实施例1中A549细胞Caspase-3,8,9酶活性的影响图片;
图19是实施例1ASPF对Bcl-2/Bax的mRNA表达量影响图。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式该刺五加果多糖ASPF的分子量为97462,刺五加果多糖ASPF为杂多糖,由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成,其中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:所述的刺五加果多糖按照以下步骤制备:
一、将刺五加干果粉碎,过60目筛,将过筛后的粉末用8~12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次,一次3h,合并提取液,烘干;
二、烘干后,按重量份数比为1:10~15的比例加入蒸馏水寖提两次,一次2h,合并水提液,浓缩至原来体积的1/5~1/3;
三、步骤二浓缩后,按照重量份数比为1:10~15的比例向浓缩液中加入浓度为80%的无水乙醇,静置过夜,然后在4000r/min条件下离心4~6min,收集沉淀,再用甲醇洗涤两次,晾干,得到粗多糖ASP;
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液,粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖;
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离,分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化得到刺五加果多糖ASPF。
本实施方式的刺五加果多糖(ASPF)外表呈白色,外表蓬松,质地轻,易溶于水,不溶于甲醇、丙酮等有机试剂。苯酚-硫酸法检测ASPF的糖含量为89.8%,Bradford法未检测到蛋白含量,硫酸-咔唑法检测其糖醛酸含量为22.9%,为一种酸性多糖。
本实施方式的刺五加果多糖ASPF采用紫外光谱扫描,紫外图谱在220nm处有一强吸收峰,为多糖的特征吸收峰,其它位置处(260-280nm为核酸、蛋白的特征吸收区)处均无吸收峰,表明已不存在蛋白、核酸等成分。
采用凝胶渗透色谱法鉴定本实施方式刺五加果多糖ASPF的纯度,如图7所示,图中发现色谱图中峰形单一且对称,表明该多糖分子量排布均一,表明除去ASPN多糖,得到一均一分子量多糖ASPF。
本实施方式刺五加果多糖ASPF相对分子量测定:通过对不同分子量葡聚糖标准品的GPC数据分析,经计算得到回归方程为log MW=-0.2736tR+6.7599,R2=0.9993。将保留时间tR代入得到ASPF的重均相对分子量MW为97462。
本实施方式中的ASPF的IR扫描图谱(图8)中存在多糖的特征吸收峰。3392.79cm-1处的强宽峰为羟基的特征吸收峰,2935.66cm-1处有吸收峰,表明有C-H的伸缩振动,两个位于1710cm-1、1620.21cm-1处的拉伸峰表明有C=O与COO-的存在[26],这说明ASPF中有酯化基团或酸性基团。1417.67cm-1为糖醇羟基-C-OH的面内弯曲振动峰,1101cm-1附近的峰值确认了C-O-C的存在,证明ASPF中的糖基为吡喃糖环构型,772.62cm-1处的典型峰表明其具有α-糖苷的构型。
一般情况下,α型吡喃糖C1位置质子的化学位移通常超过5.0ppm,而β型糖的质子化学位移则小于5.0ppm,因此可以通过1H-NMR谱数据对此加以区分,图9中所示,氢谱中的δH4.5~5.0通常为β-型吡喃糖的异头碳上质子的化学位移,因此可推断ASPF的端基碳为β构型,在δH4.20,δH4.15处的信号可推断为β-葡萄糖基吡喃糖信号。δH4.56、δH4.39分别为半乳糖、葡萄糖端基氢信号,符合HPLC的单糖测定结果,δH3.20~4.20多为多糖中连氧碳上的氢信号。
本实施方式刺五加果多糖ASPF单糖组成分析:
以单糖标准品与ASPF水解物进行保留时间比对,见图10和图11,其中单糖各组分的保留时间如表1所示;如图所示,刺五加果多糖ASPF为杂多糖,ASPF由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖六种单糖组成(通过糖苷键组成),选择肌醇作为内标物,最终通过内标校正因子法确定其组成单糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
表1
本实施方式的刺五加果多糖ASPF,其为杂多糖,分子量偏低,但其组成单糖种类较多,主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成,而本发明中刺五加果多糖中,半乳糖醛酸的含量极高,通过糖醛酸含量的测定结果显示其中糖醛酸含量高达22.9%,另外在IR光谱中也提示有羧基的存在,说明ASPF是一种酸性多糖。而现有技术中,从刺五加根茎中分离得到的多糖极少有糖醛酸的存在,在1H-NMR中也显示出几种单糖的特征信号,通过IR光谱可知ASPF存在吡喃糖环。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一不同的是:所述刺五加果多糖ASPF的半乳糖醛酸中的糖醛酸含量为22.9%。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四:本实施方式刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行:
一、将刺五加干果粉碎,过60目筛,将过筛后的粉末用8~12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次,一次3h,合并提取液,烘干;
二、烘干后,按重量份数比为1:10~15的比例加入蒸馏水寖提两次,一次2h,合并水提液,浓缩至原来体积的1/5~1/3;
三、步骤二浓缩后,按照重量份数比为1:10~15的比例向浓缩液中加入浓度为80%的无水乙醇,静置过夜,然后在4000r/min条件下离心4~6min,收集沉淀,再用甲醇洗涤两次,于80℃条件下烘干,得到粗多糖ASP;
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液,粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖;
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离,分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化,即得到刺五加果多糖。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤四中Sveage法脱蛋白的方法是:首先将氯仿和正丁醇按照体积比为4:1的比例配置成Sevage溶液,将粗多糖水溶液和Sevage溶液按照体积比为4:1的比例混合,震荡30min,在转速7000r/min离心10min,留上清去沉淀,重复操作3次,收集上清多糖溶液,真空旋干后冷冻干燥。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
本实施方式真空旋干后用适量水溶解,冷冻干燥,Bradford法检测蛋白含量,计算脱蛋白率。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤五中阴阳离子树脂柱联用:将20g的总多糖用蒸馏水配制成5%的样品水溶液,3000r/min离心10min,取上清液依次经过AmberliteFPA90-Cl-(5×50cm,i.d.)和AmberliteIRC-84(5×50cm,i.d.)阴阳离子交换联用树脂柱,即先用蒸馏水洗脱,将流速控制为10mL/min,采用苯酚-硫酸法跟踪检测,至无糖组分流出时,再依次采用0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl洗脱,直至无糖分流出后,用2mol/LNaCl冲柱,将0.5mol/L NaCl洗脱下来的成分,用3.0x103Da的透析袋透析72h后,冻干得到多糖。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤五中DEAE-52离子交换柱层析:
1)、DEAE-52纤维素预处理:取DEAE-52纤维素,用15倍体积的ddH2O浸泡24h,待其充分溶胀后,真空抽滤去除水分;使用0.05mol/L NaOH浸泡1h,水洗至中性,再采用0.1mol/L HCl浸泡30min,水洗至中性,最后用0.1mol/L NaOH处理30min,水洗至中性,将填料与水按1:2比例混合,充分搅拌除去气泡,准备装柱,选用柱型3.5×50cm;
2)、装柱:将玻璃柱垂直固定于铁架台,检查装置气密性,将填料匀浆搅拌均匀,倒入柱床;装填完成后选择超纯水为流动相,1mL/min流速下洗脱,隔夜静置;
3)、上样:取0.8g阴阳离子树脂柱联用的方法分离后的多糖,溶于超纯水中得到配制为浓度为5%的糖液,再按照与糖液重量份数比为1:0.05的比例加入活性炭粉末脱色,70℃水浴条件下静置2h后抽滤除去活性炭,将脱色后的糖液缓慢倒入柱中,连接蠕动泵,准备洗脱;
4)、洗脱:控制洗脱流速为1mL/min,依次以ddH2O、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱,自动收集器收集110管洗脱液,每个样品管是5mL,采用苯酚-硫酸法对每管中的糖含量进行检测,绘制洗脱曲线,合并管号为78~100的洗脱液,于截留分子量3.0×103Da透析袋中透析72h,冷冻干燥。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式四不同的是:步骤五中葡聚糖凝胶G-200柱层析:
1)、Sephadex G-200凝胶预处理:将凝胶用10倍体积超纯水浸泡48h,使凝胶充分膨胀,清洗两次后搅拌均匀,制备成凝胶匀浆;
2)、装柱:湿法装柱,将玻璃柱垂直固定于铁架台,检查装置气密性,将填料匀浆搅拌均匀,倒入柱床;装填完成后选择超纯水为流动相,1mL/min流速下洗脱,隔夜静置;
3)、上样:取200mg DEAE-52离子交换柱中得到的馏分,配制成5%溶液,缓慢倒入柱中,连接蠕动泵,准备洗脱;
4)、洗脱:控制流速为15mL/L,采用超纯水进行洗脱,每5min接取一管,收集90个样品管,绘制洗脱曲线,合并管号为15~50的样品。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施九:具体实施方式一所述的刺五加果多糖在抑制肿瘤细胞的应用。
本实施方式中所述抑制的肿瘤细胞为肺癌A549细胞。
实施例1本实施例刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行:
一、将3kg的刺五加干果粉碎,过60目筛,将过筛后的粉末用8~12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次,一次3h,合并提取液,烘干;
二、烘干后,按重量份数比为1:10~15的比例加入蒸馏水寖提两次,一次2h,合并水提液,浓缩至原来体积的1/5~1/3;
三、步骤二浓缩后,按照重量份数比为1:10~15的比例向浓缩液中加入浓度为80%的无水乙醇,静置过夜,然后在4000r/min条件下离心4~6min,收集沉淀,再用甲醇洗涤两次,晾干,得到粗多糖ASP;
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液,粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖;
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离,然后依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化,即得到刺五加果多糖。
上述步骤四中Sveage法脱蛋白的方法是:首先氯仿和正丁醇按照体积比为4:1的比例配置Sevage溶液,将步骤三的粗多糖ASP的样品溶液和Sevage溶液按照体积比为4:1的比例混合,震荡30min,7000r/min离心10min,留上清去沉淀,重复操作3次,收集上清多糖溶液,真空旋干后冷冻干燥,其中,真空旋干后用适量水溶解,冷冻干燥,Bradford法检测蛋白含量,计算脱蛋白率;另外,通过对脱蛋白前后的糖含量与蛋白含量的检测发现其脱蛋白率为78.45±1.21%,多糖损失率在16.75%左右。通过采用CCK-8法检测肺癌细胞存活率变化,可以看出除去蛋白的多糖随着其纯度的上升而对A549细胞显示出更高的抑制作用。
上述步骤五中阴阳离子树脂柱联用:将20g步骤四的总多糖的样品用蒸馏水配制成5%的样品水溶液,3000r/min离心10min,取上清液依次经过AmberliteFPA90-Cl-(5×50cm,i.d.)和AmberliteIRC-84(5×50cm,i.d.)阴阳离子交换联用树脂柱,即先用蒸馏水洗脱,将流速控制为10mL/min,采用苯酚-硫酸法跟踪检测,至无糖组分流出时,再依次采用0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl洗脱,直至无糖分流出后,用2mol/L NaCl冲柱,将0.5mol/LNaCl洗脱下来的成分,用3.0x103Da的透析袋透析72h后,冻干得到9.28g多糖。
上述步骤五中DEAE-52离子交换柱层析:
1、DEAE-52纤维素预处理:取适量DEAE-52纤维素,用15倍体积的ddH2O浸泡24h,待其充分溶胀后,真空抽滤去除水分;使用0.05mol/L NaOH浸泡1h,水洗至中性,再采用0.1mol/L HCl浸泡30min,水洗至中性,最后用0.1mol/L NaOH处理30min,水洗至中性,将填料与水按1:2比例混合,充分搅拌除去气泡,准备装柱,选用柱型3.5×50cm;
2、装柱:将玻璃柱垂直固定于铁架台,检查装置气密性,将填料匀浆搅拌均匀,倒入柱床(边倒边搅拌,防止气泡产生);装填完成后选择超纯水为流动相,1mL/min流速下洗脱,隔夜静置(使填料面稳定);
3、上样:取0.8g阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离得到的多糖,溶于超纯水中得到配制为5%多糖溶液,再按照与多糖溶液重量份数比为1:0.05的比例加入活性炭粉末脱色,70℃水浴条件下静置2h后抽滤除去活性炭,将脱色后的糖液缓慢倒入柱中,连接蠕动泵,准备洗脱;
4、洗脱:控制洗脱流速为1mL/min,依次以ddH2O、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱,自动收集器收集110管洗脱液,每个样品管是5mL,采用苯酚-硫酸法对每管中的糖含量进行检测,绘制洗脱曲线,合并管号为88~96的洗脱液,于截留分子量3.0×103Da透析袋中透析72h,冷冻干燥。
上述步骤五中葡聚糖凝胶G-200柱层析:
1、Sephadex G-200凝胶预处理:将适量凝胶用10倍体积超纯水浸泡48h,使凝胶充分膨胀,清洗两次后搅拌均匀,制备成凝胶匀浆。
2、装柱:湿法装柱,将玻璃柱垂直固定于铁架台,检查装置气密性,将填料匀浆搅拌均匀,倒入柱床(边倒边搅拌,防止气泡产生);装填完成后选择超纯水为流动相,1mL/min流速下洗脱,隔夜静置(使填料面稳定);
3、上样:取200mg步骤五中DEAE-52离子交换柱中得到的馏分,配制成5%溶液,缓慢倒入柱中,连接蠕动泵,准备洗脱;
4、洗脱:控制流速为15mL/L,采用超纯水进行洗脱,每5min接取一管,收集90个样品管,绘制洗脱曲线,根据检测结果合并管号为21~42的样品,冻干。
本实施例检测结果如下:
1、步骤三得到的粗多糖ASP如图1中A所示,经过Sveage法脱蛋白、阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离、离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化得到的刺五加果多糖(ASPF)如图1中B所示,本实施例的刺五加果多糖(ASPF)外表呈白色,外表蓬松,质地轻,易溶于水,不溶于甲醇、丙酮等有机试剂。苯酚-硫酸法检测ASPF的糖含量为89.8%,Bradford法未检测到蛋白含量,硫酸-咔唑法检测其糖醛酸含量为22.9%,为一种酸性多糖。
2、本实施例通过DEAE-52柱层析的检测结果如图2、3、4所示,从图2看出,本实施例通过阴阳离子树脂柱联用的方法基本已除尽Sevage法未脱去的残留蛋白与色素类成分,经过DEAE-52柱层析后,共洗出了三组馏分,分别命名为ASPB-1、ASPB-2、ASPB-3;图3是采用CCK-8法检测三组馏分对A549细胞存活率的影响,从图3可以看出,ASPB-3对其抑制效果最强,计算得到其IC50值为664.6μg/mL;图4是凝胶渗透色谱法对其纯度进行检测的结果图,如图所示,ASPB-3中存在两种分子量的多糖,通过对其相对分子量的估算。
3、Sephadex G-200柱层析:
葡聚糖凝胶柱层析可以根据其分子体积的不同而达到纯化的效果,在多糖、蛋白等生物大分子的纯化中有着广泛应用。检测结果如图5所示,从图5可以看出洗脱曲线与其凝胶渗透色谱图结果一致,共洗出两种多糖,合并相应管号,分别命名为ASPF与ASPN,以同样方法进行三次富集;对两种多糖的抗肿瘤活性追踪结果如图6所示,图中表示ASPF、表示ASPN,从图6可以看出,发现ASPF对A549细胞的作用效果最强,而ASPN的抑制作用相对较弱。因此后续实验将以ASPF结构表征及其抗肺癌机制的研究为主要内容。
4、刺五加多糖(ASPF)结构鉴定
4.1 ASPF紫外光谱扫描
紫外图谱在220nm处有一强吸收峰,为多糖的特征吸收峰,其它位置处(260-280nm为核酸、蛋白的特征吸收区)处均无吸收峰,表明已不存在蛋白、核酸等成分。
4.2 ASPF纯度鉴定
采用凝胶渗透色谱法鉴定刺五加果多糖ASPF的纯度,如图7所示,图中发现色谱图中峰形单一且对称,表明该多糖分子量排布均一,表明除去ASPN多糖,得到一均一分子量多糖ASPF。
4.3 ASPF相对分子量测定
通过对不同分子量葡聚糖标准品的GPC数据分析,经计算得到回归方程为log MW=-0.2736tR+6.7599,R2=0.9993。将保留时间tR代入得到ASPF的重均相对分子量MW为97462。
4.4ASPF红外光谱扫描
ASPF的IR扫描图谱(图8)中存在多糖的特征吸收峰。3392.79cm-1处的强宽峰为羟基的特征吸收峰,2935.66cm-1处有吸收峰,表明有C-H的伸缩振动,两个位于1710cm-1、1620.21cm-1处的拉伸峰表明有C=O与COO-的存在[26],这说明ASPF中有酯化基团或酸性基团。1417.67cm-1为糖醇羟基-C-OH的面内弯曲振动峰,1101cm-1附近的峰值确认了C-O-C的存在,证明ASPF中的糖基为吡喃糖环构型,772.62cm-1处的典型峰表明其具有α-糖苷的构型。
4.5 ASPF核磁1H谱
一般情况下,α型吡喃糖C1位置质子的化学位移通常超过5.0ppm,而β型糖的质子化学位移则小于5.0ppm,因此可以通过1H-NMR谱数据对此加以区分,图9中所示,氢谱中的δH4.5~5.0通常为β-型吡喃糖的异头碳上质子的化学位移,因此可推断ASPF的端基碳为β构型,在δH4.20,δH4.15处的信号可推断为β-葡萄糖基吡喃糖信号。δH4.56、δH4.39分别为半乳糖、葡萄糖端基氢信号,符合HPLC的单糖测定结果,δH3.20~4.20多为多糖中连氧碳上的氢信号。
4.6 ASPF单糖组成分析
以单糖标准品与ASPF水解物进行保留时间比对,见图10和图11,最终确定ASPF由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖六种单糖组成(通过糖苷键组成),选择肌醇作为内标物,最终通过内标校正因子法确定其组成单糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
5、ASPF对肺癌A549细胞增殖影响
5.1ASPF对A549细胞存活率影响
ASPF作用下的人肺癌A549细胞存活率如图12所示(Means±SD(n=3),one-wayANOVA,*p<0.05,表示处理组与对照组差异显著;**p<0.01,表示处理组与对照组差异极显著),当作用时间为24h48h时,在25μg/mL浓度时相比对照组出现显著性差异,200μg/mL起出现极显著性差异。ASPF对A549细胞抑制效果显著,且随剂量依赖性上升,经SPSS22.0数据分析后,其IC50值为424.39μg/mL,相比较纯化前有显著提高。
5.2ASPF对A549细胞克隆形成影响
肿瘤细胞的克隆影响如图13和图14所示,图中A为对照,B、C、D分别为200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL的ASPF,从图中可以看出,肿瘤细胞的克隆影响形成能力较强,因此克隆形成率试验是检测细胞增殖、侵袭的一种重要手段,通过结晶紫染色发现,对照组中细胞克隆能力较强,在给药200μg/mL时,其克隆形成率发生一定变化,其中间颜色空洞化,而随着给药浓度的上升,其空白区域不断增大,A549细胞克隆数在不断减少,说明ASPF对A549细胞的克隆形成有着显著抑制作用。
5.3ASPF的细胞毒性
ASPF的细胞毒性的结果如图15所示。细胞凋亡会使乳酸脱氢酶渗透入培养基中,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒是检测细胞毒性的常用方法,乳酸脱氢酶能够催化乳酸并产生NADH,通过测定NADH在340nm处的吸光度变化即可反映LDH活力,依次判断其对细胞毒性大小。试验中选择25-1600μg/mL ASPF给药处理,结果发现随着给药浓度的逐渐上升,LDH含量有着逐渐升高的趋势,但各组分均未出现显著性差异,为保证药物的无毒性,在研究细胞凋亡、迁移活性时选择200μg/mL、400μg/mL给药浓度。
6、ASPF对A549细胞迁移影响
细胞划痕试验是检测细胞迁移变化的一种重要试验手段,结果如图16所示,图中为ASPF处理48h后的细胞划痕,经过12h、24h后,对照组中的划痕基本已完全闭合,而剂量组中划痕闭合缓慢,且400μg/mL剂量组比200μg/mL闭合缓慢,说明ASPF能够有效抑制细胞迁移。
7、ASPF对肺癌A549细胞凋亡作用
7.1 A549细胞形态学观察
不同浓度ASPF作用下,A549细胞凋亡形态变化的倒置显微镜图片(200×)如图17所示(图中A为对照组;B,C,D,E分别为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL ASPF处理48h;F为阳性对照组(5μg/mL姜黄素处理48h),倒置显微镜下可观察到阴性对照组细胞贴壁生长状态良好,主要呈现梭形,紧密排列。阳性对照组姜黄素处理后细胞形态变圆,胞质破碎,出现了严重的空泡化现象。在用100μg/mLASPF处理后,细胞外周出现皱缩,200μg/mLASPF作用下,细胞之间的连接性消失,在400μg/mL给药浓度下,大部分细胞形态已经变圆,细胞液中有大量死细胞漂浮,到800μg/mL药物作用浓度时,细胞开始出现空泡化现象。
7.2 ASPF对A549细胞Caspase-3,8,9酶活性的影响
细胞凋亡途径主要分为外源性与内源性凋亡途径。ASPF对A549细胞Caspase酶活性影响如图18所示,图中A为Caspase 3活性;B为Caspase 8活性;C为Caspase 9活性ASPF对A549细胞Caspase酶活性影响。在通常情况下,细胞膜表面的死亡受体受到刺激后会促使线粒体释放细胞色素C,并增强Caspase 8的表达,同时与Caspase 9而形成复合体,激活Caspase 3的表达,从而启动激酶级联反应,共同促进细胞凋亡。另外,多项研究表明,Caspase3的激活为细胞不可逆凋亡的信号。
本研究采用Caspase活力测定试剂盒检测了在ASPF的作用下,Caspase-3,8,9活力的变化,发现对照组细胞基本无变化,因此以对照组为参比,计算剂量组中Caspase酶的活力变化。结果发现,在ASPF处理组中,Caspase酶活力均有不同程度的上升,与对照组相比存在显著性差异,其中以Caspase-3,8酶活力增强最为明显,且随剂量依赖式增长。
7.3ASPF对Bcl-2、Bax的mRNA表达量影响
同一家族的Bcl-2与Bax是两种重要的凋亡因子,能够通过改变线粒体内膜通透性而控制凋亡激活物产生。ASPF对Bcl-2/Bax的mRNA表达量影响如图19所示(图中Means±SD(n=3),one-way ANOVA,*p<0.05,表示处理组与对照组差异显著;**p<0.01,表示处理组与对照组差异极显著,A为RNA电泳检测图;B、C、D为mRNA相对表达量统计图),在ASPF处理48h后,促凋亡基因Bax的mRNA表达量显著上调,而抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达量显著下降,此外Bcl-2/Bax比值明显下降。因此,ASPF可能通过增强Bax的mRNA表达并下调Bcl-2表达而促进细胞色素c的释放,激活Caspase-9而产生凋亡小体,从而激活Caspase-3,最终达到促进癌细胞凋亡的效果。
Claims (8)
1.一种刺五加果多糖,其特征在于该刺五加果多糖ASPF的分子量为97462,刺五加果多糖ASPF为杂多糖,由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成,其中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
2.根据权利要求1所述的一种刺五加果多糖,其特征在于刺五加果多糖ASPF的半乳糖醛酸中的糖醛酸含量为22.9%。
3.权利要求1所述的刺五加果多糖的提取方法,其特征在于刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行:
一、将刺五加干果粉碎,过60目筛,将过筛后的粉末用8~12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次,一次3h,合并提取液,烘干;
二、烘干后,按重量份数比为1:10~15的比例加入蒸馏水寖提两次,一次2h,合并水提液,浓缩至原来体积的1/5~1/3;
三、步骤二浓缩后,按照重量份数比为1:10~15的比例向浓缩液中加入浓度为80%的无水乙醇,静置过夜,然后在4000r/min条件下离心4~6min,收集沉淀,再用甲醇洗涤两次,晾干,得到粗多糖ASP;
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液,粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖;
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离,分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化得到刺五加果多糖ASPF。
4.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法,其特征在于步骤四中Sveage法脱蛋白的方法是:首先将氯仿和正丁醇按照体积比为4:1的比例配置成Sevage溶液,将粗多糖水溶液和Sevage溶液按照体积比为4:1的比例混合,震荡30min,在转速7000r/min离心10min,留上清去沉淀,重复操作3次,收集上清多糖溶液,真空旋干后冷冻干燥。
5.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法,其特征在于步骤五中阴阳离子树脂柱联用:将20g的总多糖用蒸馏水配制成5%的样品水溶液,3000r/min离心10min,取上清液依次经过AmberliteFPA90-Cl-(5×50cm,i.d.)和AmberliteIRC-84(5×50cm,i.d.)阴阳离子交换联用树脂柱,即先用蒸馏水洗脱,将流速控制为10mL/min,采用苯酚-硫酸法跟踪检测,至无糖组分流出时,再依次采用0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl洗脱,直至无糖分流出后,用2mol/L NaCl冲柱,将0.5mol/L NaCl洗脱下来的成分,用3.0x103Da的透析袋透析72h后,冻干得到多糖。
6.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法,其特征在于步骤五中DEAE-52离子交换柱层析:
1)、DEAE-52纤维素预处理:取DEAE-52纤维素,用15倍体积的ddH2O浸泡24h,待其充分溶胀后,真空抽滤去除水分;使用0.05mol/L NaOH浸泡1h,水洗至中性,再采用0.1mol/L HCl浸泡30min,水洗至中性,最后用0.1mol/L NaOH处理30min,水洗至中性,将填料与水按1:2比例混合,充分搅拌除去气泡,准备装柱,选用柱型3.5×50cm;
2)、装柱:将玻璃柱垂直固定于铁架台,检查装置气密性,将填料匀浆搅拌均匀,倒入柱床;装填完成后选择超纯水为流动相,1mL/min流速下洗脱,隔夜静置;
3)、上样:取0.8g阴阳离子树脂柱联用的方法分离后的多糖,溶于超纯水中得到配制为浓度为5%的糖液,再按照与糖液重量份数比为1:0.05的比例加入活性炭粉末脱色,70℃水浴条件下静置2h后抽滤除去活性炭,将脱色后的糖液缓慢倒入柱中,连接蠕动泵,准备洗脱;
4)、洗脱:控制洗脱流速为1mL/min,依次以ddH2O、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱,自动收集器收集110管洗脱液,每个样品管是5mL,采用苯酚-硫酸法对每管中的糖含量进行检测,绘制洗脱曲线,合并管号为78~100的洗脱液,于截留分子量3.0×103Da透析袋中透析72h,冷冻干燥。
7.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法,其特征在于步骤五中葡聚糖凝胶G-200柱层析:
1)、Sephadex G-200凝胶预处理:将凝胶用10倍体积超纯水浸泡48h,使凝胶充分膨胀,清洗两次后搅拌均匀,制备成凝胶匀浆;
2)、装柱:湿法装柱,将玻璃柱垂直固定于铁架台,检查装置气密性,将填料匀浆搅拌均匀,倒入柱床;装填完成后选择超纯水为流动相,1mL/min流速下洗脱,隔夜静置;
3)、上样:取200mg DEAE-52离子交换柱中得到的馏分,配制成5%溶液,缓慢倒入柱中,连接蠕动泵,准备洗脱;
4)、洗脱:控制流速为15mL/L,采用超纯水进行洗脱,每5min接取一管,收集90个样品管,绘制洗脱曲线,合并管号为15~50的样品,冻干。
8.权利要求1所述的刺五加果多糖作为抑制肿瘤药物活性成分的应用。
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