CN113214412A - 一种刺五加果多糖、多糖的提取方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种刺五加果多糖、多糖的提取方法及其应用，本发明涉及一种多糖、多糖的提取方法及其应用。本发明解决了现有刺五加果实体部位的浪费较为严重的问题。本发明刺五加果多糖分子量为97462；方法：先将刺五加干果粉碎，粗提得到粗多糖ASP；然后采用Sveage法脱蛋白、阴阳离子树脂柱联用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G‑200柱层析纯化得到刺五加果多糖；刺五加果多糖在抑制肺癌A549细胞的应用。本发明的刺五果加多糖是从刺五加果中提取得到的，是一种分子量较小的均一分子量多糖。本发明的刺五果加多糖可成时间剂量依赖性抑制A549细胞增殖，对A549的细胞迁移能力有一定的抑制效果，刺五果加多糖具有较高的抗肿瘤活性。

Description

一种刺五加果多糖、多糖的提取方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种多糖、多糖的提取方法及其应用。
背景技术
刺五加有着广泛的研究前景与经济价值，刺五加多糖已被证明出具有多种药理活性，且已广泛应用于临床治疗中。但目前对刺五加多糖及其药理作用的研究多集中于根、茎、叶部位，关于刺五加果实部位的成分开发及其活性研究相对较少，因此也造成了刺五加果实体部位的浪费较为严重。刺五加果实是一种黑色浆果，泡水引用，也可制成果酒、果糕等产品，在日常保健养生中起到了重要作用。多糖是刺五加果实中含量最高的一类成分，提取制备成本较低，有广阔的研究前景与经济价值。肺癌作为威胁人类健康最大的恶性肿瘤之一，其发病率与致死率均高居首位，但目前的主要治疗手段如放射治疗、化学治疗等方法会对人体的其它器官造成严重损害，容易促使其它疾病的产生。目前，尚未有关于刺五加果多糖活性方面报道。
发明内容
本发明为了解决现有刺五加果实体部位的浪费较为严重的问题，而提供了一种刺五加果多糖、多糖的提取方法及其应用。
本发明刺五加果多糖ASPF的分子量为97462，刺五加果多糖ASPF为杂多糖，由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成，其中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
上述刺五加果多糖ASPF的半乳糖醛酸中的糖醛酸含量为22.9％。
上述刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行：
一、将刺五加干果粉碎，过60目筛，将过筛后的粉末用8～12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次，一次3h，合并提取液，烘干；
二、烘干后，按重量份数比为1:10～15的比例加入蒸馏水寖提两次，一次2h，合并水提液，浓缩至原来体积的1/5～1/3；
三、步骤二浓缩后，按照重量份数比为1:10～15的比例向浓缩液中加入浓度为80％的无水乙醇，静置过夜，然后在4000r/min条件下离心4～6min，收集沉淀，再用甲醇洗涤两次，晾干，得到粗多糖ASP；
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液，粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖；
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离，分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化，即得到刺五加果多糖。
上述刺五加果多糖在抑制肿瘤细胞的应用。
本发明的刺五果加多糖是从刺五加果中提取得到的，是一种分子量较小的均一分子量多糖，糖含量89.8％；利用本发明的方法，所得到的刺五果加多糖的提取率为8.459％，相比现有的刺五加根、茎中多糖的提取率，其结果有着较明显的提高。另外，本发明的纯化方法能够脱去多糖中的蛋白及小分子类成分，并得到一均一分子量多糖。经过试验证明，本发明的刺五果加多糖可成时间剂量依赖性抑制A549细胞增殖，在作用时间48h时，其IC50值为424.39μg/mL。能够增强Caspase-3,8,9酶活性并降低Bcl-2/Bax的mRNA表达水平，对A549的细胞迁移能力也存在一定的抑制效果，刺五果加多糖具有较高的抗肿瘤活性。本发明的刺五加多糖本其对肺癌细胞的抑制率有着较为明显的提高。本发明的刺五加果多糖有较高的药用价值。
附图说明
图1是实施例1刺五加果多糖(ASPF)纯化前和纯化后的效果图；
图2是实施例1中DEAE-52柱层析的效果图；
图3是实施例1中CCK-8法检测结果图；
图4是实施例1中凝胶渗透色谱法进行纯度检测的结果图；
图5是实施例1中Sephadex G-200柱层析的结果图；
图6是实施例1中抗肿瘤活性追踪结果的结果图；
图7是具体实施方式二中ASPF纯度鉴定结果图；
图8是具体实施方式二中ASPF的IR扫描图谱；
图9是具体实施方式二中ASPF核磁1H谱图；
图10是具体实施方式二中单糖标准品保留时间结果图；
图11是具体实施方式二中ASPF水解物保留时间结果图；
图12是实施例1中ASPF作用下的人肺癌A549细胞存活率结果图；
图13是实施例1中肿瘤细胞的克隆影响；
图14是实施例1中肿瘤细胞的克隆影响柱形图；
图15是实施例1中ASPF的细胞毒性的结果图；
图16是实施例1中ASPF对A549细胞迁移影响；
图17是实施例1中A549细胞凋亡形态变化的倒置显微镜图片；
图18是实施例1中A549细胞Caspase-3,8,9酶活性的影响图片；
图19是实施例1ASPF对Bcl-2/Bax的mRNA表达量影响图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式该刺五加果多糖ASPF的分子量为97462，刺五加果多糖ASPF为杂多糖，由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成，其中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的刺五加果多糖按照以下步骤制备：
一、将刺五加干果粉碎，过60目筛，将过筛后的粉末用8～12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次，一次3h，合并提取液，烘干；
二、烘干后，按重量份数比为1:10～15的比例加入蒸馏水寖提两次，一次2h，合并水提液，浓缩至原来体积的1/5～1/3；
三、步骤二浓缩后，按照重量份数比为1:10～15的比例向浓缩液中加入浓度为80％的无水乙醇，静置过夜，然后在4000r/min条件下离心4～6min，收集沉淀，再用甲醇洗涤两次，晾干，得到粗多糖ASP；
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液，粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖；
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离，分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化得到刺五加果多糖ASPF。
本实施方式的刺五加果多糖(ASPF)外表呈白色，外表蓬松，质地轻，易溶于水，不溶于甲醇、丙酮等有机试剂。苯酚-硫酸法检测ASPF的糖含量为89.8％，Bradford法未检测到蛋白含量，硫酸-咔唑法检测其糖醛酸含量为22.9％，为一种酸性多糖。
本实施方式的刺五加果多糖ASPF采用紫外光谱扫描，紫外图谱在220nm处有一强吸收峰，为多糖的特征吸收峰，其它位置处(260-280nm为核酸、蛋白的特征吸收区)处均无吸收峰，表明已不存在蛋白、核酸等成分。
采用凝胶渗透色谱法鉴定本实施方式刺五加果多糖ASPF的纯度，如图7所示，图中发现色谱图中峰形单一且对称，表明该多糖分子量排布均一，表明除去ASPN多糖，得到一均一分子量多糖ASPF。
本实施方式刺五加果多糖ASPF相对分子量测定：通过对不同分子量葡聚糖标准品的GPC数据分析，经计算得到回归方程为log MW＝-0.2736tR+6.7599，R2＝0.9993。将保留时间tR代入得到ASPF的重均相对分子量MW为97462。
本实施方式中的ASPF的IR扫描图谱(图8)中存在多糖的特征吸收峰。3392.79cm-1处的强宽峰为羟基的特征吸收峰，2935.66cm-1处有吸收峰，表明有C-H的伸缩振动，两个位于1710cm-1、1620.21cm-1处的拉伸峰表明有C＝O与COO-的存在[26]，这说明ASPF中有酯化基团或酸性基团。1417.67cm-1为糖醇羟基-C-OH的面内弯曲振动峰，1101cm-1附近的峰值确认了C-O-C的存在，证明ASPF中的糖基为吡喃糖环构型，772.62cm-1处的典型峰表明其具有α-糖苷的构型。
一般情况下，α型吡喃糖C1位置质子的化学位移通常超过5.0ppm，而β型糖的质子化学位移则小于5.0ppm，因此可以通过1H-NMR谱数据对此加以区分，图9中所示，氢谱中的δH4.5～5.0通常为β-型吡喃糖的异头碳上质子的化学位移，因此可推断ASPF的端基碳为β构型，在δH4.20，δH4.15处的信号可推断为β-葡萄糖基吡喃糖信号。δH4.56、δH4.39分别为半乳糖、葡萄糖端基氢信号，符合HPLC的单糖测定结果，δH3.20～4.20多为多糖中连氧碳上的氢信号。
本实施方式刺五加果多糖ASPF单糖组成分析：
以单糖标准品与ASPF水解物进行保留时间比对，见图10和图11，其中单糖各组分的保留时间如表1所示；如图所示，刺五加果多糖ASPF为杂多糖，ASPF由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖六种单糖组成(通过糖苷键组成)，选择肌醇作为内标物，最终通过内标校正因子法确定其组成单糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
表1
Figure BDA0003059762430000041
本实施方式的刺五加果多糖ASPF，其为杂多糖，分子量偏低，但其组成单糖种类较多，主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成，而本发明中刺五加果多糖中，半乳糖醛酸的含量极高，通过糖醛酸含量的测定结果显示其中糖醛酸含量高达22.9％，另外在IR光谱中也提示有羧基的存在，说明ASPF是一种酸性多糖。而现有技术中，从刺五加根茎中分离得到的多糖极少有糖醛酸的存在，在1H-NMR中也显示出几种单糖的特征信号，通过IR光谱可知ASPF存在吡喃糖环。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述刺五加果多糖ASPF的半乳糖醛酸中的糖醛酸含量为22.9％。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行：
一、将刺五加干果粉碎，过60目筛，将过筛后的粉末用8～12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次，一次3h，合并提取液，烘干；
二、烘干后，按重量份数比为1:10～15的比例加入蒸馏水寖提两次，一次2h，合并水提液，浓缩至原来体积的1/5～1/3；
三、步骤二浓缩后，按照重量份数比为1:10～15的比例向浓缩液中加入浓度为80％的无水乙醇，静置过夜，然后在4000r/min条件下离心4～6min，收集沉淀，再用甲醇洗涤两次，于80℃条件下烘干，得到粗多糖ASP；
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液，粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖；
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离，分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化，即得到刺五加果多糖。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤四中Sveage法脱蛋白的方法是：首先将氯仿和正丁醇按照体积比为4:1的比例配置成Sevage溶液，将粗多糖水溶液和Sevage溶液按照体积比为4：1的比例混合，震荡30min，在转速7000r/min离心10min，留上清去沉淀，重复操作3次，收集上清多糖溶液，真空旋干后冷冻干燥。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
本实施方式真空旋干后用适量水溶解，冷冻干燥，Bradford法检测蛋白含量，计算脱蛋白率。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤五中阴阳离子树脂柱联用：将20g的总多糖用蒸馏水配制成5％的样品水溶液，3000r/min离心10min，取上清液依次经过AmberliteFPA90-Cl-(5×50cm,i.d.)和AmberliteIRC-84(5×50cm,i.d.)阴阳离子交换联用树脂柱，即先用蒸馏水洗脱，将流速控制为10mL/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测，至无糖组分流出时，再依次采用0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl洗脱，直至无糖分流出后，用2mol/LNaCl冲柱，将0.5mol/L NaCl洗脱下来的成分，用3.0x103Da的透析袋透析72h后，冻干得到多糖。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤五中DEAE-52离子交换柱层析：
1)、DEAE-52纤维素预处理：取DEAE-52纤维素，用15倍体积的ddH2O浸泡24h，待其充分溶胀后，真空抽滤去除水分；使用0.05mol/L NaOH浸泡1h，水洗至中性，再采用0.1mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性，最后用0.1mol/L NaOH处理30min，水洗至中性，将填料与水按1:2比例混合，充分搅拌除去气泡，准备装柱，选用柱型3.5×50cm；
2)、装柱：将玻璃柱垂直固定于铁架台，检查装置气密性，将填料匀浆搅拌均匀，倒入柱床；装填完成后选择超纯水为流动相，1mL/min流速下洗脱，隔夜静置；
3)、上样：取0.8g阴阳离子树脂柱联用的方法分离后的多糖，溶于超纯水中得到配制为浓度为5％的糖液，再按照与糖液重量份数比为1:0.05的比例加入活性炭粉末脱色，70℃水浴条件下静置2h后抽滤除去活性炭，将脱色后的糖液缓慢倒入柱中，连接蠕动泵，准备洗脱；
4)、洗脱：控制洗脱流速为1mL/min，依次以ddH2O、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，自动收集器收集110管洗脱液，每个样品管是5mL，采用苯酚-硫酸法对每管中的糖含量进行检测，绘制洗脱曲线，合并管号为78～100的洗脱液，于截留分子量3.0×103Da透析袋中透析72h，冷冻干燥。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四不同的是：步骤五中葡聚糖凝胶G-200柱层析：
1)、Sephadex G-200凝胶预处理：将凝胶用10倍体积超纯水浸泡48h，使凝胶充分膨胀，清洗两次后搅拌均匀，制备成凝胶匀浆；
2)、装柱：湿法装柱，将玻璃柱垂直固定于铁架台，检查装置气密性，将填料匀浆搅拌均匀，倒入柱床；装填完成后选择超纯水为流动相，1mL/min流速下洗脱，隔夜静置；
3)、上样：取200mg DEAE-52离子交换柱中得到的馏分，配制成5％溶液，缓慢倒入柱中，连接蠕动泵，准备洗脱；
4)、洗脱：控制流速为15mL/L，采用超纯水进行洗脱，每5min接取一管，收集90个样品管，绘制洗脱曲线，合并管号为15～50的样品。其他步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施九：具体实施方式一所述的刺五加果多糖在抑制肿瘤细胞的应用。
本实施方式中所述抑制的肿瘤细胞为肺癌A549细胞。
实施例1本实施例刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行：
一、将3kg的刺五加干果粉碎，过60目筛，将过筛后的粉末用8～12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次，一次3h，合并提取液，烘干；
二、烘干后，按重量份数比为1:10～15的比例加入蒸馏水寖提两次，一次2h，合并水提液，浓缩至原来体积的1/5～1/3；
三、步骤二浓缩后，按照重量份数比为1:10～15的比例向浓缩液中加入浓度为80％的无水乙醇，静置过夜，然后在4000r/min条件下离心4～6min，收集沉淀，再用甲醇洗涤两次，晾干，得到粗多糖ASP；
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液，粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖；
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离，然后依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化，即得到刺五加果多糖。
上述步骤四中Sveage法脱蛋白的方法是：首先氯仿和正丁醇按照体积比为4:1的比例配置Sevage溶液，将步骤三的粗多糖ASP的样品溶液和Sevage溶液按照体积比为4：1的比例混合，震荡30min，7000r/min离心10min，留上清去沉淀，重复操作3次，收集上清多糖溶液，真空旋干后冷冻干燥，其中，真空旋干后用适量水溶解，冷冻干燥，Bradford法检测蛋白含量，计算脱蛋白率；另外，通过对脱蛋白前后的糖含量与蛋白含量的检测发现其脱蛋白率为78.45±1.21％，多糖损失率在16.75％左右。通过采用CCK-8法检测肺癌细胞存活率变化，可以看出除去蛋白的多糖随着其纯度的上升而对A549细胞显示出更高的抑制作用。
上述步骤五中阴阳离子树脂柱联用：将20g步骤四的总多糖的样品用蒸馏水配制成5％的样品水溶液，3000r/min离心10min，取上清液依次经过AmberliteFPA90-Cl-(5×50cm,i.d.)和AmberliteIRC-84(5×50cm,i.d.)阴阳离子交换联用树脂柱，即先用蒸馏水洗脱，将流速控制为10mL/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测，至无糖组分流出时，再依次采用0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl洗脱，直至无糖分流出后，用2mol/L NaCl冲柱，将0.5mol/LNaCl洗脱下来的成分，用3.0x103Da的透析袋透析72h后，冻干得到9.28g多糖。
上述步骤五中DEAE-52离子交换柱层析：
1、DEAE-52纤维素预处理：取适量DEAE-52纤维素，用15倍体积的ddH2O浸泡24h，待其充分溶胀后，真空抽滤去除水分；使用0.05mol/L NaOH浸泡1h，水洗至中性，再采用0.1mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性，最后用0.1mol/L NaOH处理30min，水洗至中性，将填料与水按1:2比例混合，充分搅拌除去气泡，准备装柱，选用柱型3.5×50cm；
2、装柱：将玻璃柱垂直固定于铁架台，检查装置气密性，将填料匀浆搅拌均匀，倒入柱床(边倒边搅拌，防止气泡产生)；装填完成后选择超纯水为流动相，1mL/min流速下洗脱，隔夜静置(使填料面稳定)；
3、上样：取0.8g阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离得到的多糖，溶于超纯水中得到配制为5％多糖溶液，再按照与多糖溶液重量份数比为1:0.05的比例加入活性炭粉末脱色，70℃水浴条件下静置2h后抽滤除去活性炭，将脱色后的糖液缓慢倒入柱中，连接蠕动泵，准备洗脱；
4、洗脱：控制洗脱流速为1mL/min，依次以ddH2O、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，自动收集器收集110管洗脱液，每个样品管是5mL，采用苯酚-硫酸法对每管中的糖含量进行检测，绘制洗脱曲线，合并管号为88～96的洗脱液，于截留分子量3.0×103Da透析袋中透析72h，冷冻干燥。
上述步骤五中葡聚糖凝胶G-200柱层析：
1、Sephadex G-200凝胶预处理：将适量凝胶用10倍体积超纯水浸泡48h，使凝胶充分膨胀，清洗两次后搅拌均匀，制备成凝胶匀浆。
2、装柱：湿法装柱，将玻璃柱垂直固定于铁架台，检查装置气密性，将填料匀浆搅拌均匀，倒入柱床(边倒边搅拌，防止气泡产生)；装填完成后选择超纯水为流动相，1mL/min流速下洗脱，隔夜静置(使填料面稳定)；
3、上样：取200mg步骤五中DEAE-52离子交换柱中得到的馏分，配制成5％溶液，缓慢倒入柱中，连接蠕动泵，准备洗脱；
4、洗脱：控制流速为15mL/L，采用超纯水进行洗脱，每5min接取一管，收集90个样品管，绘制洗脱曲线，根据检测结果合并管号为21～42的样品，冻干。
本实施例检测结果如下：
1、步骤三得到的粗多糖ASP如图1中A所示，经过Sveage法脱蛋白、阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离、离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化得到的刺五加果多糖(ASPF)如图1中B所示，本实施例的刺五加果多糖(ASPF)外表呈白色，外表蓬松，质地轻，易溶于水，不溶于甲醇、丙酮等有机试剂。苯酚-硫酸法检测ASPF的糖含量为89.8％，Bradford法未检测到蛋白含量，硫酸-咔唑法检测其糖醛酸含量为22.9％，为一种酸性多糖。
2、本实施例通过DEAE-52柱层析的检测结果如图2、3、4所示，从图2看出，本实施例通过阴阳离子树脂柱联用的方法基本已除尽Sevage法未脱去的残留蛋白与色素类成分，经过DEAE-52柱层析后，共洗出了三组馏分，分别命名为ASPB-1、ASPB-2、ASPB-3；图3是采用CCK-8法检测三组馏分对A549细胞存活率的影响，从图3可以看出，ASPB-3对其抑制效果最强，计算得到其IC50值为664.6μg/mL；图4是凝胶渗透色谱法对其纯度进行检测的结果图，如图所示，ASPB-3中存在两种分子量的多糖，通过对其相对分子量的估算。
3、Sephadex G-200柱层析：
葡聚糖凝胶柱层析可以根据其分子体积的不同而达到纯化的效果，在多糖、蛋白等生物大分子的纯化中有着广泛应用。检测结果如图5所示，从图5可以看出洗脱曲线与其凝胶渗透色谱图结果一致，共洗出两种多糖，合并相应管号，分别命名为ASPF与ASPN，以同样方法进行三次富集；对两种多糖的抗肿瘤活性追踪结果如图6所示，图中
Figure BDA0003059762430000091
表示ASPF、
Figure BDA0003059762430000092
表示ASPN，从图6可以看出，发现ASPF对A549细胞的作用效果最强，而ASPN的抑制作用相对较弱。因此后续实验将以ASPF结构表征及其抗肺癌机制的研究为主要内容。
4、刺五加多糖(ASPF)结构鉴定
4.1 ASPF紫外光谱扫描
紫外图谱在220nm处有一强吸收峰，为多糖的特征吸收峰，其它位置处(260-280nm为核酸、蛋白的特征吸收区)处均无吸收峰，表明已不存在蛋白、核酸等成分。
4.2 ASPF纯度鉴定
采用凝胶渗透色谱法鉴定刺五加果多糖ASPF的纯度，如图7所示，图中发现色谱图中峰形单一且对称，表明该多糖分子量排布均一，表明除去ASPN多糖，得到一均一分子量多糖ASPF。
4.3 ASPF相对分子量测定
通过对不同分子量葡聚糖标准品的GPC数据分析，经计算得到回归方程为log MW＝-0.2736tR+6.7599，R2＝0.9993。将保留时间tR代入得到ASPF的重均相对分子量MW为97462。
4.4ASPF红外光谱扫描
ASPF的IR扫描图谱(图8)中存在多糖的特征吸收峰。3392.79cm-1处的强宽峰为羟基的特征吸收峰，2935.66cm-1处有吸收峰，表明有C-H的伸缩振动，两个位于1710cm-1、1620.21cm-1处的拉伸峰表明有C＝O与COO-的存在[26]，这说明ASPF中有酯化基团或酸性基团。1417.67cm-1为糖醇羟基-C-OH的面内弯曲振动峰，1101cm-1附近的峰值确认了C-O-C的存在，证明ASPF中的糖基为吡喃糖环构型，772.62cm-1处的典型峰表明其具有α-糖苷的构型。
4.5 ASPF核磁1H谱
一般情况下，α型吡喃糖C1位置质子的化学位移通常超过5.0ppm，而β型糖的质子化学位移则小于5.0ppm，因此可以通过1H-NMR谱数据对此加以区分，图9中所示，氢谱中的δH4.5～5.0通常为β-型吡喃糖的异头碳上质子的化学位移，因此可推断ASPF的端基碳为β构型，在δH4.20，δH4.15处的信号可推断为β-葡萄糖基吡喃糖信号。δH4.56、δH4.39分别为半乳糖、葡萄糖端基氢信号，符合HPLC的单糖测定结果，δH3.20～4.20多为多糖中连氧碳上的氢信号。
4.6 ASPF单糖组成分析
以单糖标准品与ASPF水解物进行保留时间比对，见图10和图11，最终确定ASPF由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖六种单糖组成(通过糖苷键组成)，选择肌醇作为内标物，最终通过内标校正因子法确定其组成单糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
5、ASPF对肺癌A549细胞增殖影响
5.1ASPF对A549细胞存活率影响
ASPF作用下的人肺癌A549细胞存活率如图12所示(Means±SD(n＝3),one-wayANOVA,*p<0.05，表示处理组与对照组差异显著；**p<0.01,表示处理组与对照组差异极显著)，当作用时间为24h
Figure BDA0003059762430000101
48h
Figure BDA0003059762430000102
时，在25μg/mL浓度时相比对照组出现显著性差异，200μg/mL起出现极显著性差异。ASPF对A549细胞抑制效果显著，且随剂量依赖性上升，经SPSS22.0数据分析后，其IC50值为424.39μg/mL，相比较纯化前有显著提高。
5.2ASPF对A549细胞克隆形成影响
肿瘤细胞的克隆影响如图13和图14所示，图中A为对照，B、C、D分别为200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL的ASPF，从图中可以看出，肿瘤细胞的克隆影响形成能力较强，因此克隆形成率试验是检测细胞增殖、侵袭的一种重要手段，通过结晶紫染色发现，对照组中细胞克隆能力较强，在给药200μg/mL时，其克隆形成率发生一定变化，其中间颜色空洞化，而随着给药浓度的上升，其空白区域不断增大，A549细胞克隆数在不断减少，说明ASPF对A549细胞的克隆形成有着显著抑制作用。
5.3ASPF的细胞毒性
ASPF的细胞毒性的结果如图15所示。细胞凋亡会使乳酸脱氢酶渗透入培养基中，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒是检测细胞毒性的常用方法，乳酸脱氢酶能够催化乳酸并产生NADH，通过测定NADH在340nm处的吸光度变化即可反映LDH活力，依次判断其对细胞毒性大小。试验中选择25-1600μg/mL ASPF给药处理，结果发现随着给药浓度的逐渐上升，LDH含量有着逐渐升高的趋势，但各组分均未出现显著性差异，为保证药物的无毒性，在研究细胞凋亡、迁移活性时选择200μg/mL、400μg/mL给药浓度。
6、ASPF对A549细胞迁移影响
细胞划痕试验是检测细胞迁移变化的一种重要试验手段，结果如图16所示，图中为ASPF处理48h后的细胞划痕，经过12h、24h后，对照组中的划痕基本已完全闭合，而剂量组中划痕闭合缓慢，且400μg/mL剂量组比200μg/mL闭合缓慢，说明ASPF能够有效抑制细胞迁移。
7、ASPF对肺癌A549细胞凋亡作用
7.1 A549细胞形态学观察
不同浓度ASPF作用下，A549细胞凋亡形态变化的倒置显微镜图片(200×)如图17所示(图中A为对照组；B，C，D，E分别为100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL ASPF处理48h；F为阳性对照组(5μg/mL姜黄素处理48h)，倒置显微镜下可观察到阴性对照组细胞贴壁生长状态良好，主要呈现梭形，紧密排列。阳性对照组姜黄素处理后细胞形态变圆，胞质破碎，出现了严重的空泡化现象。在用100μg/mLASPF处理后，细胞外周出现皱缩，200μg/mLASPF作用下，细胞之间的连接性消失，在400μg/mL给药浓度下，大部分细胞形态已经变圆，细胞液中有大量死细胞漂浮，到800μg/mL药物作用浓度时，细胞开始出现空泡化现象。
7.2 ASPF对A549细胞Caspase-3,8,9酶活性的影响
细胞凋亡途径主要分为外源性与内源性凋亡途径。ASPF对A549细胞Caspase酶活性影响如图18所示，图中A为Caspase 3活性；B为Caspase 8活性；C为Caspase 9活性ASPF对A549细胞Caspase酶活性影响。在通常情况下，细胞膜表面的死亡受体受到刺激后会促使线粒体释放细胞色素C，并增强Caspase 8的表达，同时与Caspase 9而形成复合体，激活Caspase 3的表达，从而启动激酶级联反应，共同促进细胞凋亡。另外，多项研究表明，Caspase3的激活为细胞不可逆凋亡的信号。
本研究采用Caspase活力测定试剂盒检测了在ASPF的作用下，Caspase-3,8,9活力的变化，发现对照组细胞基本无变化，因此以对照组为参比，计算剂量组中Caspase酶的活力变化。结果发现，在ASPF处理组中，Caspase酶活力均有不同程度的上升，与对照组相比存在显著性差异，其中以Caspase-3,8酶活力增强最为明显，且随剂量依赖式增长。
7.3ASPF对Bcl-2、Bax的mRNA表达量影响
同一家族的Bcl-2与Bax是两种重要的凋亡因子，能够通过改变线粒体内膜通透性而控制凋亡激活物产生。ASPF对Bcl-2/Bax的mRNA表达量影响如图19所示(图中Means±SD(n＝3),one-way ANOVA,*p<0.05，表示处理组与对照组差异显著；**p<0.01,表示处理组与对照组差异极显著，A为RNA电泳检测图；B、C、D为mRNA相对表达量统计图)，在ASPF处理48h后，促凋亡基因Bax的mRNA表达量显著上调，而抑凋亡基因Bcl-2的mRNA表达量显著下降，此外Bcl-2/Bax比值明显下降。因此，ASPF可能通过增强Bax的mRNA表达并下调Bcl-2表达而促进细胞色素c的释放，激活Caspase-9而产生凋亡小体，从而激活Caspase-3，最终达到促进癌细胞凋亡的效果。

Claims (8)

1.一种刺五加果多糖，其特征在于该刺五加果多糖ASPF的分子量为97462，刺五加果多糖ASPF为杂多糖，由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖通过糖苷键组成，其中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖物质的量比为1:3.9:1.5:4.45:0.56:3.62。
2.根据权利要求1所述的一种刺五加果多糖，其特征在于刺五加果多糖ASPF的半乳糖醛酸中的糖醛酸含量为22.9％。
3.权利要求1所述的刺五加果多糖的提取方法，其特征在于刺五加果多糖的提取方法按照以下步骤进行：
一、将刺五加干果粉碎，过60目筛，将过筛后的粉末用8～12倍体积的无水乙醇回流脱脂2次，一次3h，合并提取液，烘干；
二、烘干后，按重量份数比为1:10～15的比例加入蒸馏水寖提两次，一次2h，合并水提液，浓缩至原来体积的1/5～1/3；
三、步骤二浓缩后，按照重量份数比为1:10～15的比例向浓缩液中加入浓度为80％的无水乙醇，静置过夜，然后在4000r/min条件下离心4～6min，收集沉淀，再用甲醇洗涤两次，晾干，得到粗多糖ASP；
四、粗多糖ASP溶解于ddH2O中得到粗多糖水溶液，粗多糖水溶液采用Sveage法脱蛋白得到总多糖；
五、步骤四的总多糖采用阴阳离子树脂柱联用的方法进行分离，分离后的多糖依次用离子交换柱层析、葡聚糖凝胶G-200柱层析进行纯化得到刺五加果多糖ASPF。
4.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法，其特征在于步骤四中Sveage法脱蛋白的方法是：首先将氯仿和正丁醇按照体积比为4:1的比例配置成Sevage溶液，将粗多糖水溶液和Sevage溶液按照体积比为4：1的比例混合，震荡30min，在转速7000r/min离心10min，留上清去沉淀，重复操作3次，收集上清多糖溶液，真空旋干后冷冻干燥。
5.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法，其特征在于步骤五中阴阳离子树脂柱联用：将20g的总多糖用蒸馏水配制成5％的样品水溶液，3000r/min离心10min，取上清液依次经过AmberliteFPA90-Cl-(5×50cm,i.d.)和AmberliteIRC-84(5×50cm,i.d.)阴阳离子交换联用树脂柱，即先用蒸馏水洗脱，将流速控制为10mL/min，采用苯酚-硫酸法跟踪检测，至无糖组分流出时，再依次采用0.5mol/L NaCl、1mol/L NaCl洗脱，直至无糖分流出后，用2mol/L NaCl冲柱，将0.5mol/L NaCl洗脱下来的成分，用3.0x103Da的透析袋透析72h后，冻干得到多糖。
6.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法，其特征在于步骤五中DEAE-52离子交换柱层析：
1)、DEAE-52纤维素预处理：取DEAE-52纤维素，用15倍体积的ddH2O浸泡24h，待其充分溶胀后，真空抽滤去除水分；使用0.05mol/L NaOH浸泡1h，水洗至中性，再采用0.1mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性，最后用0.1mol/L NaOH处理30min，水洗至中性，将填料与水按1:2比例混合，充分搅拌除去气泡，准备装柱，选用柱型3.5×50cm；
2)、装柱：将玻璃柱垂直固定于铁架台，检查装置气密性，将填料匀浆搅拌均匀，倒入柱床；装填完成后选择超纯水为流动相，1mL/min流速下洗脱，隔夜静置；
3)、上样：取0.8g阴阳离子树脂柱联用的方法分离后的多糖，溶于超纯水中得到配制为浓度为5％的糖液，再按照与糖液重量份数比为1:0.05的比例加入活性炭粉末脱色，70℃水浴条件下静置2h后抽滤除去活性炭，将脱色后的糖液缓慢倒入柱中，连接蠕动泵，准备洗脱；
4)、洗脱：控制洗脱流速为1mL/min，依次以ddH2O、0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行洗脱，自动收集器收集110管洗脱液，每个样品管是5mL，采用苯酚-硫酸法对每管中的糖含量进行检测，绘制洗脱曲线，合并管号为78～100的洗脱液，于截留分子量3.0×103Da透析袋中透析72h，冷冻干燥。
7.根据权利要求3所述的刺五加果多糖的提取方法，其特征在于步骤五中葡聚糖凝胶G-200柱层析：
1)、Sephadex G-200凝胶预处理：将凝胶用10倍体积超纯水浸泡48h，使凝胶充分膨胀，清洗两次后搅拌均匀，制备成凝胶匀浆；
2)、装柱：湿法装柱，将玻璃柱垂直固定于铁架台，检查装置气密性，将填料匀浆搅拌均匀，倒入柱床；装填完成后选择超纯水为流动相，1mL/min流速下洗脱，隔夜静置；
3)、上样：取200mg DEAE-52离子交换柱中得到的馏分，配制成5％溶液，缓慢倒入柱中，连接蠕动泵，准备洗脱；
4)、洗脱：控制流速为15mL/L，采用超纯水进行洗脱，每5min接取一管，收集90个样品管，绘制洗脱曲线，合并管号为15～50的样品，冻干。
8.权利要求1所述的刺五加果多糖作为抑制肿瘤药物活性成分的应用。
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