CN108323663A - 一种刺五加多糖保健饮品及从五加参中提取刺五加多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物成分提取及应用领域，尤其涉及一种刺五加多糖保健饮品及从五加参中提取刺五加多糖的方法。本发明采用高压提取工艺提取五加参中的刺五加多糖，并采用聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺进一步纯化刺五加多糖；本发明刺五加多糖保健饮品中仅含有具有提高免疫力功能的多糖组分，有效活性成分含量高，杂质少，避免了传统中成药饮品中非有效成分潜在的致敏危险，以及复杂的药物成分给服用者肝肾带来的负担及损伤，制备出更具有针对性的高效低毒的保健饮品，通过保健饮品中各药物多糖的配伍使服用者的免疫力获得了更全面的增强。
Description
技术领域
本发明属于植物成分提取及应用领域，尤其涉及一种刺五加多糖保健饮品及从五加参中提取刺五加多糖的方法。
背景技术
五加参又名西伯利亚人参、刺五加等，系五加科五加属植物，为我国传统珍贵药用植物，主要分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、河北等地。五加参味辛、微苦、性温、无毒，具有益气健脾、补肾安神、益精壮骨之功效，对神经衰弱疗效显著，能调节植物神经功能，改善和促进睡眠。用五加参治疗冠心病，能有效缓解心绞痛，同时还有调节血压的功能。此外，五加参还可用于白细胞减少症、糖尿病、性机能障碍等疾病；在肿瘤的综合治疗中，还可以预防和减少放射线或化疗药物对机体的损害。五加参还可促进人体新陈代谢，增进健康、延缓衰老，并可缓解女性更年期综合征。
研究表明，五加参中的刺五加多糖为免疫活性成分之一，主要为碱性多糖和水溶性多糖。现代药理学研究表明，刺五加多糖具有较强的抗肿瘤作用，可以促进T细胞、B细胞、NK细胞等细胞因子的产生，提高机体免疫力；同时，刺五加多糖还具有较强的抗氧化活性。
现有的刺五加保健品都是利用五加参益气健脾、补气安神的功效，目前市场上还没有专门用于提高免疫力的五加参产品，对于五加参产品的深度开发仍存在空白，这主要是由于对五加参所含药物成分的提取和分离存在技术缺陷。
目前的五加参提取物在提取时通常采用水提和有机溶剂提取为主。提取过程中并不注重样品前处理，煎煮时间和煎煮方式单一，一定程度上使得五加参中各种有效成分不能更加彻底的溶出，导致提取物中有效成分含量低或不均衡，甚至造成杂质含量高，从而导致后续纯化过程中因杂质过多而造成提取物纯度低。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种刺五加多糖保健饮品及从五加参中提取刺五加多糖的方法。
本发明的技术方案：
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥10～15h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至50～100目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:5～10mL，回流提取2-3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:15～20mL，常温下浸泡2～3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在10～15min内将高压提取装置内的压强升高至300～600Mpa，保压15～25min后在10～20s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作3～5次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于3000～5000rmp离心转速下离心10～30min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过弱极性或非极性色谱柱进行吸附；
c2：将水或能与水以任意比例相溶的低浓度有机溶剂pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将能与水以任意比例相溶的高浓度的有机溶剂pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
进一步的，步骤a1所述新鲜的五加参原料为五加参叶、五加参花、五加参果实、五加参茎和五加参根中的一种或几种，优选五加参茎或五加参根。
进一步的，步骤c1所述弱极性或非极性色谱柱为聚酰胺树脂色谱柱或大孔吸附树脂色谱柱，所述大孔吸附树脂色谱柱中大孔吸附树脂型号为D101、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-9中的一种。
进一步的，步骤c1所述弱极性或非极性色谱柱为聚酰胺树脂与大孔吸附树脂联合色谱柱，其中聚酰胺树脂与大孔吸附树脂的装料重量比为1:3，装料方式为聚酰胺树脂在色谱柱上层，大孔吸附树脂在色谱柱下层，所述大孔吸附树脂的型号为D101、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-9中的一种。
进一步的，步骤c2所述低浓度有机溶剂为0～20％甲醇溶液、0～20％乙醇溶液或0～20％丙酮溶液中的一种；所述高浓度有机溶剂为20～60％甲醇溶液、20～60％乙醇溶液或20～60％丙酮溶液中的一种，或由甲醇、乙醇和丙酮按照任一比例所组成的浓度为20～60％的混合有机溶剂。
一种以本发明任一提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物30～60份、灵芝多糖提取物10～40份、黄芪多糖提取物5～30份、柴胡多糖提取物5～30份、当归多糖提取物5～30份、枸杞多糖提取物5～30份、大枣多糖提取物5～30份，水500份。
进一步的，所述刺五加多糖保健饮品包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物40～50份、灵芝多糖提取物20～30份、黄芪多糖提取物10～20份、柴胡多糖提取物10～20份、当归多糖提取物10～20份、枸杞多糖提取物10～20份、大枣多糖提取物10～20份，水500份。
进一步的，所述刺五加多糖提取物中刺五加多糖纯度为95～99.4％，灵芝多糖提取物中灵芝多糖纯度为85～92％，黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
进一步的，所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物。
本发明的有益效果：
1、本发明采用高压提取工艺提取五加参中的刺五加多糖，高压提取过程中植物细胞内外压力达到平衡后快速泄压，造成五加参细胞内外渗透压突然增大，使细胞膜的结构发生变化，使得细胞内的刺五加多糖能够穿过细胞膜而转移到细胞外的提取液中，提高刺五加多糖的转移率，对五加参中刺五加多糖提取的更加充分，提高了五加参的利用率，降低了原料成本。
与热回流、煎煮、微波、超声等提取方法相比，本发明在室温下进行，从而减少了对药物活性成分的破坏，得到的提取物具有更好的药用活性，还具有提取时间短、效率高、操作简便、节约能源、对环境污染小等优点。
本发明采用聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺与高压提取工艺相结合，在分离纯化刺五加多糖方面，只是用水、甲醇、乙醇或丙酮作为洗脱液，条件温和，避免刺五加多糖因加热、化学处理等过程造成活性降低，本发明只收集含刺五加多糖的馏分，高效去除杂质，本发明分离纯化工艺简便、成本低，树脂易再生，无需特殊设备、利于工业化生产，所得刺五加多糖纯度高。
本发明提供的从五加参中提取刺五加多糖的方法工艺合理，操作简单可行，生产成本低，对环境污染小，刺五加多糖的得率及纯度高，可用于工业化大批量生产。
2、本发明提供的刺五加多糖保健饮品原料药材来源广泛，由刺五加、灵芝、黄芪、柴胡、当归、枸杞和大枣中提取的高纯度多糖提取物制备的，不同于市场上的中成药保健饮品，本发明刺五加多糖保健饮品中仅含有具有提高免疫力功能的多糖组分，有效活性成分含量高，杂质少，避免了传统中成药饮品中非有效成分潜在的致敏危险，以及复杂的药物成分给服用者肝肾带来的负担及损伤。本发明为中药深加工与利用提供了新的思路，充分利用药材中不同功效的药用成分，制备出更具有针对性的高效低毒的保健饮品。
3、本发明提供的刺五加多糖保健饮品以刺五加多糖为主，灵芝多糖为辅，主要通过促进脾脏淋巴细胞增殖来提高机体免疫力，同时添加黄芪多糖、柴胡多糖、当归多糖、枸杞多糖和大枣多糖进一步提高了巨噬细胞的吞噬能力，诱导白细胞介素1和肿瘤坏死因子(TNF)的生成以及促进淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的活性。本发明通过保健饮品中各药物多糖的配伍使服用者的免疫力获得了更全面的增强。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥10～15h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至50～100目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:5～10mL，回流提取2-3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:15～20mL，常温下浸泡2～3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在10～15min内将高压提取装置内的压强升高至300～600Mpa，保压15～25min后在10～20s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作3～5次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于3000～5000rmp离心转速下离心10～30min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过弱极性或非极性色谱柱进行吸附；
c2：将水或能与水以任意比例相溶的低浓度有机溶剂pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将能与水以任意比例相溶的高浓度的有机溶剂pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物30～60份、灵芝多糖提取物10～40份、黄芪多糖提取物5～30份、柴胡多糖提取物5～30份、当归多糖提取物5～30份、枸杞多糖提取物5～30份、大枣多糖提取物5～30份，水500份。
实施例2
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参根，清洗干净后将其置于60℃真空干燥箱中干燥10h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至50目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:5mL，回流提取2h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:15mL，常温下浸泡2h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在10min内将高压提取装置内的压强升高至300Mpa，保压15min后在10s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作3次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于3000rmp离心转速下离心10min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过聚酰胺色谱柱进行吸附；
c2：将水pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将30％甲醇pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物35份、灵芝多糖提取物15份、黄芪多糖提取物10份、柴胡多糖提取物10份、当归多糖提取物10份、枸杞多糖提取物10份、大枣多糖提取物10份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
实施例3
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参茎，清洗干净后将其置于62℃真空干燥箱中干燥12h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至80目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:6mL，回流提取3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:16mL，常温下浸泡3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在12min内将高压提取装置内的压强升高至400Mpa，保压18min后在12s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作4次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于4000rmp离心转速下离心15min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过大孔树脂D101色谱柱进行吸附；
c2：将10％甲醇pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将30％甲醇pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物40份、灵芝多糖提取物20份、黄芪多糖提取物15份、柴胡多糖提取物15份、当归多糖提取物15份、枸杞多糖提取物15份、大枣多糖提取物15份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
实施例4
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参叶，清洗干净后将其置于64℃真空干燥箱中干燥14h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至100目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:7mL，回流提取2h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:17mL，常温下浸泡2h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在14min内将高压提取装置内的压强升高至500Mpa，保压20min后在14s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作5次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于5000rmp离心转速下离心20min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过大孔树脂HPD-100色谱柱进行吸附；
c2：将10％乙醇pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将30％乙醇pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物45份、灵芝多糖提取物25份、黄芪多糖提取物20份、柴胡多糖提取物20份、当归多糖提取物20份、枸杞多糖提取物20份、大枣多糖提取物20份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
实施例5
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参花，清洗干净后将其置于65℃真空干燥箱中干燥15h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至50目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:8mL，回流提取3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:18mL，常温下浸泡3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在15min内将高压提取装置内的压强升高至600Mpa，保压23min后在15s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作3次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于3000rmp离心转速下离心25min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过聚酰胺树脂与大孔树脂AB-8联合色谱柱进行吸附，其中聚酰胺树脂与大孔吸附树脂AB-8的装料重量比为1:3，装料方式为聚酰胺树脂在色谱柱上层，大孔吸附树脂在色谱柱下层；
c2：将10％丙酮pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将40％丙酮pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物50份、灵芝多糖提取物30份、黄芪多糖提取物25份、柴胡多糖提取物25份、当归多糖提取物25份、枸杞多糖提取物25份、大枣多糖提取物25份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
实施例6
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参果实，清洗干净后将其置于60℃真空干燥箱中干燥10h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至80目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:9mL，回流提取2h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:19mL，常温下浸泡2h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在10min内将高压提取装置内的压强升高至300Mpa，保压25min后在18s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作4次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于4000rmp离心转速下离心30min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过聚酰胺树脂与大孔树脂X-5联合色谱柱进行吸附，其中聚酰胺树脂与大孔吸附树脂X-5的装料重量比为1:3，装料方式为聚酰胺树脂在色谱柱上层，大孔吸附树脂在色谱柱下层；
c2：将20％甲醇pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将50％甲醇pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物55份、灵芝多糖提取物35份、黄芪多糖提取物30份、柴胡多糖提取物30份、当归多糖提取物30份、枸杞多糖提取物30份、大枣多糖提取物30份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
实施例7
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参根，清洗干净后将其置于62℃真空干燥箱中干燥12h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至100目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:6mL，回流提取3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:16mL，常温下浸泡3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在12min内将高压提取装置内的压强升高至400Mpa，保压15min后在20s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作5次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于3000rmp离心转速下离心20min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过聚酰胺树脂与大孔树脂NKA-9联合色谱柱进行吸附，其中聚酰胺树脂与大孔吸附树脂NKA-9的装料重量比为1:3，装料方式为聚酰胺树脂在色谱柱上层，大孔吸附树脂在色谱柱下层；
c2：将20％乙醇pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将60％乙醇pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物60份、灵芝多糖提取物25份、黄芪多糖提取物15份、柴胡多糖提取物15份、当归多糖提取物15份、枸杞多糖提取物15份、大枣多糖提取物15份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
实施例8
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参根，清洗干净后将其置于64℃真空干燥箱中干燥14h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至100目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:8mL，回流提取3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:18mL，常温下浸泡3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在14min内将高压提取装置内的压强升高至500Mpa，保压20min后在18s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作5次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于4000rmp离心转速下离心25min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过大孔树脂D101色谱柱进行吸附；
c2：将20％丙酮pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将60％丙酮pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物60份、灵芝多糖提取物30份、黄芪多糖提取物10份、柴胡多糖提取物10份、当归多糖提取物10份、枸杞多糖提取物10份、大枣多糖提取物10份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
实施例9
一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参根，清洗干净后将其置于65℃真空干燥箱中干燥15h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至100目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:10mL，回流提取3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:20mL，常温下浸泡3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在15min内将高压提取装置内的压强升高至600Mpa，保压25min后在15s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作5次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于5000rmp离心转速下离心30min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过大孔树脂HPD-100色谱柱进行吸附；
c2：将15％乙醇pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将60％甲醇、乙醇和丙酮的混合溶液pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
一种以本实施例提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物60份、灵芝多糖提取物35份、黄芪多糖提取物5份、柴胡多糖提取物5份、当归多糖提取物5份、枸杞多糖提取物5份、大枣多糖提取物5份，水500份。
将上述多糖提取物加入水中，充分溶解后，过滤，灌装，121℃高压灭菌即可。本实施例刺五加多糖保健饮品的服用方法，每天服用一次，每次30～50mL，因本实施例保健饮品无毒副作用，服用者可依需要加大或减小用量。
所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物，其灵芝多糖的纯度为85～92％。
所述黄芪多糖提取物、柴胡多糖提取物、当归多糖提取物、枸杞多糖提取物和大枣多糖提取物均采用与本实施例高压提取技术结合聚酰胺树脂与大孔吸附树脂分离纯化工艺提取五加参中的刺五加多糖相同的工艺参数和方法提取得来，其中黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
对比例1
有机溶剂提取五加参中的刺五加多糖：将五加参根除杂碎断，置于提取罐中，加60％乙醇回流提取2-4次，每次1-3h，五加参叶与乙醇的质量体积比为1g：10mL，合并提取液，浓缩过滤得到刺五加多糖粗提液；将刺五加多糖粗提液加入已处理好的聚酰胺柱中，以水为第1洗脱溶剂进行洗脱，再以60％乙醇溶液为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
经高效液相色谱分析，实施例2-9和对比例1粗提液中刺五加多糖的纯度、刺五加多糖提取物中刺五加多糖的纯度和刺五加多糖的得率见表1：
表1：
由表1中数据可以看出，本发明高压提取方法提取效率比现有技术更高，纯化后刺五加多糖的纯度更高，杂质更少，获得的刺五加多糖得率更高。
实验例1：本发明提供的刺五加多糖保健饮品提高免疫力的药效学研究
用本发明提供的刺五加多糖保健饮品灌胃小鼠30d，比较本发明和正常组小鼠受ConA诱导的脾脏淋巴细胞增殖的差别，来判断本发明是否增强脾脏淋巴细胞增殖。
实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，
实验药物：实施例7、实施例8、实施例9提供的刺五加多糖口服液；
实验步骤：小鼠，按体重分层随机分组，每组12只，正常组灌胃给水；盐酸左旋咪唑组灌胃盐酸左旋咪唑；实施例7、实施例8、实施例9组分别灌胃本发明实施例7、实施例8、实施例9提供的刺五加多糖口服液，各组连续灌胃给药30d。无菌取脾，按照常规制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5×105个/mL。将脾细胞混悬液加在24孔板中，每孔1mL，每只动物设二个复孔，一孔加50uL PRMI1640培养液正常培养；一孔加50uL刀豆蛋白A(ConA)液(终浓度为4.76ug/mL)。置于5％CO2，37℃CO2孵箱中培养48h。实验结束前4h，每孔吸去上清液700uL，再加入700uL不含胎牛血清的PRMI1640培养液，同时每孔加入50uL 5mg/mL的MTT液。培养结束后，每孔加1mL酸性异丙醇，小心吹打均匀至紫色的结晶全部溶解。检测前分装到96孔培养板中，每孔作4个复孔，在570nm波长处测定其光密度值。
实验结果：实施例7、实施例8、实施例9组小鼠脾脏淋巴细胞受ConA诱导后的增殖率转化值显著高于正常组小鼠，如表1所示，
表1
| 组别 | 剂量 | 动物 | 淋巴细胞增值率 | 增值率转化值 |
| 正常组 | - | 10 | 0.425±0.298 | 0.365±0.072 |
| 盐酸左旋咪唑组 | 0.008g/kg | 10 | 0.484±0.056 | 0.738±0.073** |
| 实施例7 | 10mL/kg | 10 | 0.581±0.070 | 0.593±0.125 |
| 实施例8 | 10mL/kg | 10 | 0.596±0.161 | 0.668±0.148* |
| 实施例9 | 10mL/kg | 10 | 0.630±0.097 | 0.835±0.076** |
注：与正常组相比★★P＜0.01，★P＜0.05。
结论：本发明提供的刺五加多糖口服液能够增强小鼠脾脏淋巴增殖，具备提高免疫力的药效。
Claims (9)
1.一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，其特征在于所述提取方法步骤如下：
步骤a、五加参原料预处理：
a1：选取新鲜的五加参原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥10～15h，将充分干燥后的五加参原料粉碎至50～100目；
a2：向步骤a1得到的五加参粉末中加入石油醚，所述五加参粉末与石油醚的质量体积比为1g:5～10mL，回流提取2-3h后过滤除去滤液，将滤渣放入50℃真空干燥箱中干燥30min使溶剂挥发，得到已除去叶绿素中脂溶性杂质的脱脂五加参粉末；
步骤b、高压提取脱脂五加参粉末中的刺五加多糖：
b1：向步骤a2得到的脱脂五加参粉末中加入40％乙醇溶液，所述脱脂五加参粉末与40％乙醇溶液的质量体积比为1g:15～20mL，常温下浸泡2～3h待用；
b2：将步骤b1得到的浸泡有脱脂五加参粉末的乙醇溶液装入耐压的塑料袋中，密封后放入高压提取装置的提取容器中；
b3：常温下在10～15min内将高压提取装置内的压强升高至300～600Mpa，保压15～25min后在10～20s内将高压提取装置内的压强泄为常压；
b4：重复b3的操作3～5次后，将塑料袋从高压提取装置的提取容器中取出，将物料过滤除去滤渣，将滤液置于3000～5000rmp离心转速下离心10～30min，取上清液重复离心1次，上清液浓缩即为刺五加多糖粗提液；
步骤c、分离纯化刺五加多糖：
c1：将步骤b4得到的刺五加多糖粗提液pH值调至中性后使其通过弱极性或非极性色谱柱进行吸附；
c2：将水或能与水以任意比例相溶的低浓度有机溶剂pH值调至中性并以此为第1洗脱溶剂进行洗脱；将能与水以任意比例相溶的高浓度的有机溶剂pH值调至中性并以此为第2洗脱溶剂进行洗脱，收集含有刺五加多糖成分的馏分；
c3：将步骤c2得到的含有刺五加多糖成分的馏分进行减压浓缩，喷雾干燥，得到纯化后的刺五加多糖提取物。
2.根据权利要求1所述一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，其特征在于步骤a1所述新鲜的五加参原料为五加参叶、五加参花、五加参果实、五加参茎和五加参根中的一种或几种，优选五加参茎或五加参根。
3.根据权利要求1所述一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，其特征在于步骤c1所述弱极性或非极性色谱柱为聚酰胺树脂色谱柱或大孔吸附树脂色谱柱，所述大孔吸附树脂色谱柱中大孔吸附树脂型号为D101、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-9中的一种。
4.根据权利要求1所述一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，其特征在于步骤c1所述弱极性或非极性色谱柱为聚酰胺树脂与大孔吸附树脂联合色谱柱，其中聚酰胺树脂与大孔吸附树脂的装料重量比为1:3，装料方式为聚酰胺树脂在色谱柱上层，大孔吸附树脂在色谱柱下层，所述大孔吸附树脂的型号为D101、HPD-100、AB-8、X-5、NKA-9中的一种。
5.根据权利要求1所述一种从五加参中提取刺五加多糖的方法，其特征在于步骤c2所述低浓度有机溶剂为0～20％甲醇溶液、0～20％乙醇溶液或0～20％丙酮溶液中的一种；所述高浓度有机溶剂为20～60％甲醇溶液、20～60％乙醇溶液或20～60％丙酮溶液中的一种，或由甲醇、乙醇和丙酮按照任一比例所组成的浓度为20～60％的混合有机溶剂。
6.一种以权利要求1-5任一提取方法所得刺五加多糖提取物制备的刺五加多糖保健饮品，其特征在于所述保健饮品包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物30～60份、灵芝多糖提取物10～40份、黄芪多糖提取物5～30份、柴胡多糖提取物5～30份、当归多糖提取物5～30份、枸杞多糖提取物5～30份、大枣多糖提取物5～30份、水500份。
7.根据权利要求6所述一种刺五加多糖保健饮品，其特征在于所述保健饮品包括以下重量份的组分：刺五加多糖提取物40～50份、灵芝多糖提取物20～30份、黄芪多糖提取物10～20份、柴胡多糖提取物10～20份、当归多糖提取物10～20份、枸杞多糖提取物10～20份、大枣多糖提取物10～20份、水500份。
8.根据权利要求6或7所述一种刺五加多糖保健饮品，其特征在于所述刺五加多糖提取物中刺五加多糖纯度为95～99.4％，灵芝多糖提取物中灵芝多糖纯度为85～92％，黄芪多糖提取物中黄芪多糖纯度为90～92％、柴胡多糖提取物中柴胡多糖纯度为80～90％、当归多糖提取物中当归多糖纯度为90～93％、枸杞多糖提取物中枸杞多糖的纯度为90～92％、大枣多糖提取物中大枣多糖的纯度为90～92％。
9.根据权利要求8所述一种刺五加多糖保健饮品，其特征在于所述灵芝多糖提取物的提取方法步骤如下：选取灵芝原料，清洗干净后将其置于60～65℃真空干燥箱中干燥24h，将充分干燥后的灵芝原料粉碎至100目；采用行星球磨机对灵芝粉进行破壁处理，球磨时间为5～6h；破壁处理后向灵芝粉体中加入5～8倍重量份的水，同时加入4500U/g的纤维素酶，在45℃下酶解30～45min；酶解完成后过滤并收集滤液，用10000Da超滤膜对滤液进行超滤处理，分离得到分子量大于10000的物质，即蛋白质和多糖；利用6000U/g的碱性蛋白酶对所述分子量大于10000的物质进行酶解处理，在45℃下酶解30～45min，得到酶解液；用10000Da的超滤膜对酶解液进行超滤处理，收集分子量大于10000的灵芝多糖滤液，减压浓缩，喷雾干燥，得到灵芝多糖提取物。
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