CN112794925B - 一种阳春砂多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种阳春砂多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阳春砂多糖及其制备方法和应用。阳春砂多糖主要由葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这5种单糖组成，其特征在于：其糖链结构如下：主链由→4)‑α‑D‑Glcp‑(1→3,4)‑β‑D‑Glcp‑(1→4)‑α‑D‑Glcp‑(1→构成，支链由β‑D‑Xylp‑(1‑、‑4)‑α‑D‑Galp‑(1‑、α‑L‑Araf‑(1‑和α‑D‑GlcpA‑(1‑构成，多糖含量为88.74%，糖醛酸含量为7.21%，重均分子量为5.14×105 D。阳春砂多糖AVPG‑1在50‑200μg/mL浓度范围内，可显著促进巨噬细胞RAW 264.7产生NO，提高巨噬细胞RAW 264.7的细胞活力。

Description

一种阳春砂多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然产物及其制备方法和应用，特别涉及一种阳春砂多糖及其制备方法和应用。
背景技术
阳春砂 (Amomum villosumLour.) 来源于姜科豆蔻属多年生常绿草本植物，入药部位为干燥成熟的果实，又称为春砂仁，是我国著名的“四大南药”之一。该药性温，味辛，具有化湿开胃、温脾止泻和理气安胎等功效，为我国的常用中药，在临床上应用广泛，有着1300多年的应用历史。目前，阳春砂主要分布在广东省、云南省、广西省、海南省、福建省等地，其中又以广东阳春所产的春砂仁药效最佳。
多糖又称多聚糖，是由10个或以上的单糖脱水缩合形成的具有糖苷键的一类高分子化合物，其在生物体内的生命活动中起着至关重要的作用。大量研究表明，许多中药多糖表现出较强的生物活性，具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、保肝和降血糖等作用。因其属于非细胞毒性物质，具有毒副作用小的特点，多糖已成为药物、食品添加剂、化妆品及保健品等研发的热点。
目前国内外关于阳春砂研究最多的是其挥发性成分，普遍认为阳春砂的主要有效成分是挥发油。关于阳春砂多糖的研究报道较少，且主要集中于阳春砂多糖提取方法、抗氧化活性、粗多糖的免疫调节活性等方面。鲜少有关于阳春砂多糖新成分、结构研究、纯化多糖活性的研究报道。多糖作为生物体内的一大类物质，应该有更深入的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种阳春砂多糖及其制备方法和应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种阳春砂多糖，主要由葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这5种单糖组成，其特征在于：其糖链结构如下：主链由→ 4)-α-D-Glcp-(1 →3,4)-β-D-Glcp-(1 →4)-α-D-Glcp-(1 →构成，支链由β-D-Xylp-(1-、-4)-α-D-Galp-(1-、α-L-Araf-(1-和α-D-GlcpA-(1-构成，多糖含量为88.74%，糖醛酸含量为7.21%，重均分子量为5.14 × 105 D，具体的糖链结构如下式所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中，Ara指阿拉伯糖残基、Glc指葡萄糖残基、Gal指半乳糖残基、Xyl指木糖残基、GlcpA指葡萄糖醛酸残基。
本发明的第二个方面，提供：
一种具有免疫调节功能的组合物，其含有本发明第一个方面所述的阳春砂多糖。
在一些实例中，还包括可接受的辅料。
在一些实例中，所述组合物为保健食品或药物。
本发明的第三个方面，提供：
本发明第一个方面所述的阳春砂多糖在制备免疫调节剂中的应用。
本发明的第四个方面，提供：
本发明第一个方面所述的阳春砂多糖制备方法，包括：
1)将阳春砂粉碎，脱除其中的脂肪，得阳春砂脱脂粉末；
2)将阳春砂脱脂粉末加水，合并提取液，减压浓缩，得浓缩液；
3)浓缩液经沉淀，除蛋白，去除多糖上清液中的有机溶剂，冷冻干燥后得粗多糖；
4)取粗多糖配制成粗多糖溶液，上样阴离子纤维素层析柱，分别使用蒸馏水、0.05M NaCl和0.1 M NaCl进行洗脱，取0.05 M NaCl 洗脱下来的组分，经浓缩透析冻干后得到阳春砂多糖AVPD-1；
5)取AVPD-1配制成5 mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3 mL/10 min，洗脱时间为10 min/管，浓缩、干燥，获得阳春砂均一多糖AVPG-1。
在一些实例中，按200 g粉碎后的阳春砂粉末，加入4 L 95%乙醇的比例将阳春砂粉末和95%乙醇混合，80℃提取3h，重复操作三次，最后将阳春砂粉末烘干，得阳春砂脱脂粉末。
在一些实例中，按200 g阳春砂脱脂粉末加4 L水的比例配料，95℃提取3 h，重复操作3次，再将水提液于60℃下减压浓缩，得浓缩液。
在一些实例中，向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，于4℃下静置12 h，沉淀多糖，然后离心收集沉淀，离心转速为5000 rpm，离心时间为5 min，得多糖沉淀，将多糖沉淀溶解于蒸馏水中，得到多糖溶液；向多糖溶液中加入4倍体积的Sevage试剂，剧烈震荡后离心，离心转速为5000 rpm，离心时间为10 min，取上清液，重复操作，直至去除蛋白。
在一些实例中，所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇体积比=4:1的溶剂。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例，首次从阳春砂中分离出一种大分子量酸性阳春砂多糖，记为AVPG-1，经高效尺寸排阻色谱联用多角度激光散射仪联用示差检测器（HPSEC-MALLS-RID）测定，其重均分子量为5.14 × 105 Da，经HPLC分析，阳春砂多糖AVPG-1主要由葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这5种单糖组成。经刚果红分析，没有三螺旋结构。结合单糖组成分析、红外光谱分析和核磁分析，解析了AVPG-1的分子结构，确定阳春砂多糖AVPG-1为新物质。
本发明一些实例的阳春砂多糖AVPG-1在50-200 mg/mL浓度范围内，可显著促进巨噬细胞RAW 264.7产生NO，提高巨噬细胞RAW 264.7的细胞活力。
附图说明
图1是阳春砂多糖AVPG-1的DEAE纤维柱层析洗脱图；
图2是阳春砂多糖AVPG-1的Sephadex G-100分子筛洗脱图；
图3是阳春砂多糖AVPG-1的HPSEC-MALLS-RID图；
图4是阳春砂多糖AVPG-1的单糖组成图；
图5是阳春砂多糖AVPG-1的红外光谱图；
图6是阳春砂多糖AVPG-1的1H NMR图谱；
图7是阳春砂多糖AVPG-1的13C NMR图谱；
图8是阳春砂多糖AVPG-1的1H-1H COSY图谱；
图9是阳春砂多糖AVPG-1的HSQC图谱；
图10是阳春砂多糖AVPG-1的HMBC图谱；
图11是阳春砂多糖AVPG-1的刚果红实验图谱；
图12是阳春砂多糖AVPG-1对巨噬细胞的影响，其中，A是阳春砂多糖AVPG-1提高巨噬细胞细胞活力图；B是阳春砂多糖AVPG-1促进巨噬细胞产生NO图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1：
一）阳春砂多糖AVPG-1的制备
阳春砂种子去壳取种子团，粉碎，取200 g粉碎后的阳春砂粉末，加入4 L 95%乙醇，提取温度80 ℃，提取3 h，重复操作三次，最后将阳春砂粉末烘干，得阳春砂脱脂粉末；往阳春砂脱脂粉末中加水，200 g阳春砂脱脂粉末加4 L水，提取温度95 ℃提取3 h，重复操作3次，再将水提液于60 ℃下减压浓缩，得浓缩液；
向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，于4 ℃下静置12 h，沉淀多糖，然后离心收集沉淀，离心转速为5000 rpm，离心时间为5 min，再将沉淀物溶解于蒸馏水中，得到多糖溶液；
向多糖溶液中加入4倍体积的Sevage试剂，所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇=4:1（体积比）的溶剂，剧烈震荡后离心，离心转速为5000 rpm，离心时间为10 min，取上清液，重复操作，直至完全去除蛋白；随后将去除蛋白的多糖溶液在50 ℃下浓缩至无有机试剂味，之后冷冻干燥，得到粗多糖。
取阳春砂粗多糖100 mg，配制成浓度为20 mg/mL 的溶液，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.05、0.1 M的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为1 mL/min，洗脱时间为10 min/管，洗脱曲线如图1所示；使用全自动馏分收集器收集，采用苯酚-硫酸法测多糖含量，收集0.05 M NaCl溶液洗脱下的组分，60 ℃浓缩，3500 Da的透析袋透析，冷冻干燥后得到阳春砂多糖AVPD-1；取AVPD-1 20mg，配制成5 mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶SephadexG-100柱分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3 mL/10 min，洗脱时间为10 min/管，洗脱曲线如图2所示；使用全自动馏分收集器收集，采用苯酚-硫酸法测多糖含量，合并含有多糖的组分，经浓缩、冷冻干燥后得到阳春砂多糖AVPG-1。
二）阳春砂多糖AVPG-1的分子量测定
AVPG-1的重均分子量通过HPSEC-MALLS-RID系统测得，该系统配备DAWN HELEOS-II激光散射仪，Waters e2695的分离系统和Optilab T-rEX的示差检测器，其中分离系统使用TSK-Gel G4000SWXL柱 (300 mm × 7.8 mm)，柱温为35 °C，流动相为0.9% NaCl溶液，流速为0.5 mL/min，使用Astra software (Version 7.1.3)对分子量数据进行获取和分析，结果如图3所示。由HPLC结果可知，阳春砂多糖AVPG-1的重均分子量为5.14 × 105 Da。
三）阳春砂多糖AVPG-1的单糖组成分析
取8 mg多糖，用2 mL的3 M三氟乙酸于120 °C温度下水解6h，水解后的多糖用0.5M PMP (1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮)进行衍生。分析采用Shimadzu高效液相色谱系统测定衍生产物样品。
HPLC条件：安捷伦XDB-C18色谱柱 (4.6 × 250 mm, 5 mm)，柱温35 ℃，检测波长250 nm，流速1.0 mL/min，流动相为磷酸盐缓冲液（A）（0.05M, pH 6.7）和乙腈（B），洗脱梯度为：0-40 min保持16.0% B, 40-41 min由16.0% B降至14.0% B并保持14.0% B 13 min，54-55 min由14.0% B升至16.0% B并保持16.0% B 15 min。
其中标准品顺序（1-9）依次为：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖，结果如图4所示。
由HPLC结果可知，阳春砂多糖AVPG-1的单糖组成及比例为：葡萄糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖=1.57:73.11:10:29:6.21:8.83。
四）阳春砂多糖AVPG-1的红外光谱分析
取多糖AVPG-1，使用傅里叶变换红外分光光度计（FT-IR），在4000-400 cm-1的范围内进行红外光谱扫描，结果如图5所示，可以看出：出现了多糖的特征吸收峰。在3314.15cm-1处的特征峰是由O-H基团的拉伸振动引起的，在2925.00 cm-1处的峰值是由C-H吸收引起的，包括CH、CH2和CH3的拉伸振动；在1639.85 cm-1和1600.82 cm-1处的吸收峰是由甲酯化羧基的C=O拉伸振动引起的，表明AVPG-2中含有糖醛酸；在853.08 cm-1处的特征吸收表明AVPG-1中存在α糖苷键。
五）阳春砂多糖AVPG-1的核磁共振分析
将AVPG-1以60 mg/mL 的浓度溶于D2O中使用Bruker Avance-600进行检测。阳春砂多糖AVPG-1核磁共振分析：结果如图6-10所示，根据图6-10的核磁图谱对各残基的各个碳和氢的化学位移值进行归属，归属结果如下表1所示。
表1-阳春砂多糖AVPG-1中各糖残基的氢、碳信号归属
Figure DEST_PATH_IMAGE002
结合单糖组成、红外光谱和核磁共振分析可知AVPG-1的糖链结构如下：
主链由→ 4)-α-D-Glcp-(1 →3,4)-β-D-Glcp-(1 →4)-α-D-Glcp-(1 →构成，支链由β-D-Xylp-(1-、-4)-α-D-Galp-(1-、α-L-Araf-(1-和α-D-GlcpA-(1-构成。具体连接方式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式中，Ara指阿拉伯糖残基、Glc指葡萄糖残基、Gal指半乳糖残基、Xyl指木糖残基、GlcpA指葡萄糖醛酸残基，式中的数字指其键合的羟基在残基上的位置。
六）阳春砂多糖AVPG-1的刚果红实验
将1.0 mL多糖样品（1.0 mg/mL）与1.0 mL 刚果红溶液（80 mM）混合。随后，加入NaOH溶液（1.0 M），使氢氧化钠的最终浓度为0.1-0.6 M，混合溶液避光放置10 min，用Shimadzu UV-2600分光光度计分析其最大吸收波长（λ max）。结果如图11所示，可以看出：AVPG-1没有三螺旋结构。
实施例2：
一）阳春砂多糖AVPG-1对巨噬细胞RAW 264.7细胞活力的影响
取RAW 264.7细胞（5.0 × 103个/孔）接种于康宁96孔板，于37 ℃ 5%的CO2培养箱中培养24 h；弃去旧培养液，加入不同浓度的AVPG-1（50，100和200 mg/mL），空白对照和阳性对照分别加入DMEM培养基和LPS（1 mg/mL），培养24 h；取出96孔板，每孔加入10 mLCCK-8试剂，于37 ℃ 5%的CO2培养箱中培养3 h，之后使用Epoch酶标仪于450 nm下测定吸光值。测定结果如图12A所示。从图中可以看出，AVPG-2在浓度为100和200 mg/mL时可以提高细胞活力，且呈剂量依赖关系。
二）阳春砂多糖AVPG-1对巨噬细胞RAW 264.7 NO释放量的影响
NO释放量通过Griess反应进行测定。RAW 264.7细胞（5.0 × 104 cells/well）于96孔板中培养24 h后给药，AVPG-1终浓度为50，100和200 mg/mL，等体积的培养基作为空白对照，等体积的LPS（1 mg/mL）作为阳性对照。给药后继续培养24 h，按照试剂盒说明书使用Griess反应，通过Epoch酶标仪测定吸光值。测定结果如图12B所示。从图中可以看出，AVPG-1在给药剂量下均可以显著促进巨噬细胞分泌NO，且呈剂量依赖关系。

Claims (10)

1.一种阳春砂多糖，主要由葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖这5种单糖组成，其特征在于：其糖链结构如下：主链由→ 4)-α-D-Glcp-(1 → 3,4)-β-D-Glcp-(1 →4)-α-D-Glcp-(1 →构成，支链由β-D-Xylp-(1-、-4)-α-D-Galp-(1-、α-L-Araf-(1-和α-D-GlcpA-(1-构成，多糖含量为88.74%，糖醛酸含量为7.21%，重均分子量为5.14 × 105 D，具体的糖链结构如下式所示：
Figure 425961DEST_PATH_IMAGE001
式中，Ara指阿拉伯糖残基、Glc指葡萄糖残基、Gal指半乳糖残基、Xyl指木糖残基、GlcpA指葡萄糖醛酸残基。
2.一种具有免疫调节功能的组合物，其特征在于：其含有权利要求1所述的阳春砂多糖。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：还包括可接受的辅料。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物为保健食品或药物。
5.权利要求1所述阳春砂多糖在制备免疫调节剂中的应用。
6.权利要求1所述阳春砂多糖的制备方法，包括：
1)将阳春砂粉碎，脱除其中的脂肪，得阳春砂脱脂粉末；
2)将阳春砂脱脂粉末加水，合并提取液，减压浓缩，得浓缩液；
3)浓缩液经沉淀，除蛋白，去除多糖上清液中的有机溶剂，冷冻干燥后得粗多糖；
4)取粗多糖配制成粗多糖溶液，上样阴离子纤维素层析柱，分别使用蒸馏水、0.05 MNaCl和0.1 M NaCl进行洗脱，取0.05 M NaCl 洗脱下来的组分，经浓缩透析冻干后得到阳春砂多糖AVPD-1；
5)取AVPD-1配制成5 mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3 mL/10 min，洗脱时间为10 min/管，浓缩、干燥，获得阳春砂均一多糖AVPG-1。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：按200 g粉碎后的阳春砂粉末，加入4L 95%乙醇的比例将阳春砂粉末和95%乙醇混合，80℃提取3 h，重复操作三次，最后将阳春砂粉末烘干，得阳春砂脱脂粉末。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于： 按200 g阳春砂脱脂粉末加4 L水的比例配料，95℃提取3 h，重复操作3次，再将水提液于60 ℃下减压浓缩，得浓缩液。
9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，于4 ℃下静置12 h，沉淀多糖，然后离心收集沉淀，离心转速为5000 rpm，离心时间为5min，得多糖沉淀，将多糖沉淀溶解于蒸馏水中，得到多糖溶液；向多糖溶液中加入4倍体积的Sevage试剂，剧烈震荡后离心，离心转速为5000 rpm，离心时间为10 min，取上清液，重复操作，直至去除蛋白。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇体积比=4:1的溶剂。
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