CN115819634B - 一种银柴胡多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

一种银柴胡多糖及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115819634B
CN115819634B CN202211471808.9A CN202211471808A CN115819634B CN 115819634 B CN115819634 B CN 115819634B CN 202211471808 A CN202211471808 A CN 202211471808A CN 115819634 B CN115819634 B CN 115819634B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
starwort
extraction
starwort root
crude
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211471808.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115819634A (zh
Inventor
彭励
王红
宋乐
冯璐
李振凯
吴巍
牛丕莲
李彦青
李海姗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningxia University
Original Assignee
Ningxia University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningxia University filed Critical Ningxia University
Priority to CN202211471808.9A priority Critical patent/CN115819634B/zh
Publication of CN115819634A publication Critical patent/CN115819634A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115819634B publication Critical patent/CN115819634B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Landscapes

  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Abstract

本发明提供了一种银柴胡多糖及其制备方法和用途，其中，银柴胡多糖由半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖组成，所述半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖所占百分比分别为61.86％、32.51％、4.77％、0.39％、0.28％、0.19％，所述银柴胡多糖的重均分子质量(Mw)为31309Da。获得高提取得率、降低成本、减少污染的银柴胡多糖制备技术。首先，对银柴胡原料粉碎后采用绿色提取技术，即超临界萃取技术进行脱脂处理，解决了有机溶剂造成的环境污染或溶剂回收增加成本的问题；其次，根据银柴胡药材的特点采用响应面法对超声辅助提取多糖的关键工艺参数进行了优化，提高了银柴胡粗多糖得率，本发明提供的银柴胡多糖可用于制备抗氧化产品。

Description

一种银柴胡多糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种银柴胡多糖及其制备方法和用途。
背景技术
中药银柴胡是石竹科繁缕属一种多年生草本植物，该属植物世界上大概有190种，在《中国植物志》英文版《Flora of China》收载有64种(不含种下单位)，其中有28种为我国特有种。繁缕属药材资源丰富，我国药用繁缕主要为繁缕(S.media(L.)Cyr.)、中国繁缕(S.chinesis Regel)、湖北繁缕(S.henyri Williams)、鸡肠繁缕(S.neglecta Weihe)、银柴胡(S.dichotomaL.var.lanceolata Beg.)等10余种，但历版《中国药典》中仅收录了银柴胡的干燥根为正品药材，其它几种均为民间用药，该属植物民间应用广泛，具有清热解毒、益气养血、健脾益肾之功效；主治痢疾、疮痈肿毒、乳痈、肠痈、疖肿、跌打损伤，产后瘀滞腹痛等。繁缕属植物中存在的黄酮类、多糖类、环肽类、酚酸类、挥发油类等成分被认为与其具有抗菌、抗病毒、清热解毒等作用相关，也逐渐成为人们关注的药用资源热点。
银柴胡是繁缕属重要药用植物之一，也是我国传统医学中一味常用的清热药材，其性寒味甘，具有祛除小儿疳热，治疗骨蒸痨热等功效。《本草纲目拾遗》云：“热在骨髓，非银柴胡莫疗……固虚热之良药。”，特别是治疗由阴虚导致的发热有优异的治疗效果。近年来，研究者陆续从银柴胡药材中分离鉴定出大量的甾醇类、环肽类、生物碱类、黄酮类、酚酸类和挥发性物质等，并发现其中的部分活性物质或浸出物在抗炎、抗过敏、抗癌等方面有不同程度的作用效果。但关于其多糖类成分的研究报道甚少。
植物多糖作为一种天然产物，大量的研究证明多糖具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗炎、调节免疫、心血管保护和抗突变等作用。因其来源广泛，价格低廉，具有重要的生物学活性，无毒副作用，逐渐受到人们的青睐，被广泛应用于食品、保健品和化妆品中，特别是从传统中药中也发现大量具有药理活性和不同结构特征的植物多糖，为功能性药品或食品开发及传统中药药效物质基础的研究奠定了基础。
大多数植物多糖是一种极性分子，易溶于水，不溶于有机溶剂，因此水提醇沉是使用最广泛的方法。但由于原料的特点不同，提取中采取的处理方法也不完全一致。多糖提取的主要原理是在温和的条件下从外到内打破细胞壁，从而避免多糖变性。基于此，超声辅助提取、微波提取等新技术被用于植物多糖提取。超声辅助提取(UE)技术是利用机械、空化和热效应提高分子运动速率和溶剂渗透能力，最终提高多糖的提取效率。也有研究者认为超声提取方法可以显著提高物料中多糖的溶解速率，但长时间的超声暴露可能会改变多糖的高级结构，影响其生物活性，而且不同植物、甚至同一植物不同器官采用超声提取中关键工艺参数存在较大差异，不仅提取得率不同，也可能造成结构改变而影响生物活。因此根据植物原料的特性选择适宜的提取方法和条件是十分必要的。蔡少青等人仅在实验室以测定含量为目的，采用热水对药材粉末煮制4小时，取滤液用不同浓度的乙醇沉淀，并采用乙醇、丙酮、乙醚等在索氏抽提器中回流除取非极性成分等方法，获得精制多糖，得率为0.5％，但进一步关于银柴胡多糖理化性质与结构特征等研究未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种银柴胡多糖及其制备方法，具体方案如下：
本发明提供了一种银柴胡多糖，该银柴胡多糖由半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖组成，半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖所占百分比分别为61.86％、32.51％、4.77％、0.39％、0.28％、0.19％，所述银柴胡多糖的重均分子质量(Mw)为31309Da。
进一步地，银柴胡多糖为吡喃糖环构型，既具有α-构型糖苷键，也具有β-构型糖苷键，银柴胡多糖比旋光度[α]D20为+118°。
进一步地，银柴胡多糖的提取方法包括以下步骤：
(1)将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，分别加入30-50％浓度乙醇，离心、弃沉淀，取上清液加入无水乙醇至85％，离心后将下层沉淀用无水乙醇冲洗2次，制得银柴胡多糖粗提物；
(2)银柴胡多糖粗提物溶于蒸馏水后，加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，得到银柴胡粗多糖；
(3)将脱蛋白的银柴胡粗多糖采用DEAE-52纤维素柱进行分级纯化，即得银柴胡多糖。
本研究考察了超声提取温度、提取时间、提取次数分别与银柴胡多糖粗提物得率的变化关系，并明确了因素之间存在交互作用及其对多糖粗提物得率的影响，即提取时间和提取次数的交互作用对多糖粗提物得率的影响极显著(p<0.01)；提取时间和提取温度的交互作用对多糖粗提物得率有显著的影响(p<0.05)，而提取温度和提取次数交互作用对多糖粗提物得率影响较小(P>0.05)。采用响应面法(Box-Behnken)对上述提取条件进行了优化，得到银柴胡多糖提取条件的优化模型，即Y＝28.22-0.71A+1.43B-0.82C+1.36AB+0.39AC+2.24BC-0.67A2-3.30B2-3.31C2。
根据该模型，通过Des ign-Expert 10.0.7软件对提取参数进行分析，获得最佳提取条件的理论值，考虑到实际操作简便性，对数值取整数，即提取时间3h、提取次数2次、提取温度45℃、提取得率为27.39％。进一步按此工艺条件进行实际操作验证，银柴胡多糖粗提物平均得率为28.16％，模型预测理论与实际值误差为2.73％，符合要求。
进一步地，步骤(3)具体为：将脱蛋白后的银柴胡粗多糖溶解于蒸馏水中，得到40mg/ml银柴胡粗多糖溶液，上样至DEAE-52纤维素柱，分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl溶液以1.0ml/min的流速逐步洗脱，收集最大峰部分的洗脱液，浓缩后冷冻干燥，制得银柴胡多糖。
本发明另一方面提供了一种从银柴胡中提取银柴胡多糖的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，加入30-50％浓度乙醇，离心、弃沉淀，取上清液加入无水乙醇至85％，离心后将下层沉淀用无水乙醇冲洗2次，制得银柴胡多糖粗提物；
(2)将银柴胡多糖粗提物加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，得到银柴胡粗多糖；
(3)将脱蛋白的银柴胡粗多糖采用DEAE-52纤维素柱进行分级纯化，即得银柴胡多糖。
进一步地，步骤(3)具体为：将脱蛋白后的银柴胡粗多糖溶解于蒸馏水中，得到40mg/ml银柴胡粗多糖溶液，上样至DEAE-52纤维素柱，分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L NaCl溶液以1.0ml/min的流速逐步洗脱，收集最大峰部分的洗脱液，浓缩后冷冻干燥，制得银柴胡多糖。
进一步地，银柴胡多糖由半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖组成，所述半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖所占百分比分别为61.86％、32.51％、4.77％、0.39％、0.28％、0.19％，所述银柴胡多糖的重均分子质量(Mw)为31309Da。
进一步地，银柴胡多糖为吡喃糖环构型，既具有α-构型糖苷键，也具有β-构型糖苷键，所述银柴胡多糖比旋光度[α]D20为+118°。
本发明另一方面还公开了银柴胡多糖在制备抗氧化产品中的用途。
本发明的有益效果在于：1.获得高提取得率、降低成本、减少污染的银柴胡多糖制备技术。首先，对银柴胡原料粉碎后采用绿色提取技术，即超临界萃取技术进行脱脂处理，改进了有机溶剂造成的环境污染或溶剂回收增加成本的问题；其次，根据银柴胡药材的特点采用响应面法对超声辅助提取多糖的关键工艺参数进行了优化，提高了银柴胡粗多糖得率。2.对纯化后的银柴胡多糖理化性质及其结构特征进行鉴定，利用离子色谱技术(ICS5000离子色谱仪)、高效凝胶色谱串联多角度激光散射检测器技术(HPGPC-MALLS)和傅里叶红外光谱技术(FTIR-650)等对银柴胡多糖结构表征进行分析。
附图说明
图1a.提取温度、时间、次数对银柴胡多糖粗提物得率影响的折线图；
图1b.提取时间对银柴胡多糖粗提物得率影响的折线图；
图1c.提取次数对银柴胡多糖粗提物得率影响的折线图；
图2.两因素交互作用的三维响应面图和等高线图；
图3.标准样品离子色谱图；
图4.银柴胡多糖(SRP-1)离子色谱图；
图5.银柴胡多糖(SRP-1)红外光谱图；
图6.银柴胡粗多糖抗氧化活性的测定结果。
具体实施方式
1.材料
1.1仪器
KQ-500DE型数控超声机(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(上海振荣科学仪器有限公司)；TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机(长沙湘仪离心机设备有限公司)；DEF-6050真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)；TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；AL204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；HH SY21-Ni型电热恒温水浴锅(北京长源实验设备厂)；Thermo ICS5000离子色谱系统(ICS5000，Thermo Fisher Scientific，USA)；凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，示差检测器Optilab T-rEX(Wyatt technology，CA，USA)，激光光散射检测器为DAWNHELEOSⅡ(Wyatt technology，CA，USA)，傅里叶红外光谱仪(Spectrum Two)，自动旋光仪(上海仪电物理光学仪器有限公司)。2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)ABTS)(上海易恩化学技术有限公司)。
1.2药材与试剂
供试材料选自银柴胡道地产区宁夏同心县，栽培3年以上干燥药材。经专家鉴定为石竹科繁缕属植物银柴胡(Stellaria dichotoma L.var.lanceolata Bge.)的干燥根，为正品银柴胡药材。
无水乙醇、硫酸(天津市北方天医化学试剂厂)；过硫酸钾(上海广诺化学科技有限公司)；硫酸亚铁(徐州天鹅化工有限公司)；三氯甲烷、正丁醇、苯酚(上海广诺化学科技有限公司)。甲醇(ANPEL)，醋酸钠(Sigma)；硝酸钠(国药集团)；以上均为分析纯。三氟乙酸(ANPEL)；氢氧化钠(Sigma)为色谱纯，葡萄糖对照品(HPLC≥98％，上海源叶生物科技有限公司)；L-抗环血酸(天津市凯通化学试剂有限公司)；以上均为分析纯；KQ-500DE型数控超声机(昆山市超声仪器有限公司)；TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。
2.方法
2.1银柴胡多糖的制备流程
取银柴胡药材(含水量低于10％)→粉碎→过筛(40目)→装入超临界CO2萃取釜→脱脂(压力35MPa，温度47℃，时间为3h)→取出脱脂后粉末→加水超声辅助提取→渣液分离→浓缩滤液→加入30％-50％乙醇→过滤→取滤液加入无水乙醇至85％→离心分离→取下层沉淀用无水乙醇冲洗1-2次→得到银柴胡多糖粗提物→取多糖粗提物加水溶解→Sevag法除蛋白→上清液加无水乙醇沉淀→离心(4000r·min–1，10min)得沉淀→无水乙醇洗涤1-2次→冷冻干燥
→获得银柴胡粗多糖。
2.2银柴胡多糖提取工艺关键参数单因素筛选试验设计
称取脱脂后的银柴胡粉末800g，分为3个处理组，分别考察超声提取温度、提取时间、提取次数，每个处理组设计5个水平，详见表1。考察不同提取温度时，提取时间设为3h，提取次数为2次；考察不同提取时间时，提取温度设为40℃，提取次数为2次；考察提取次数时，提取温度设为40℃，提取时间设为3h。各处理组提取结束后，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量，分别根据公式计算多糖含量(1)和(2)计算多糖粗提物得率。
表1单因素筛选实验设计
(1)式中：C为样品溶液多糖粗提物浓度(mg/mL)；D为样品溶液稀释倍数；W为样品质量(g)；f为换算因数，W：提取用银柴胡粉末质量(g)。
(2)式中，M:干燥后的银柴胡多糖粗提物质量(g)，M0：银柴胡粉末质量(g)。
单因素筛选试验结果如下：
根据单因素试验设计，超声提取的温度、时间和次数对银柴胡多糖粗提物得率均有影响。结果见图1。由图1a可见，当提取时间3h、提取次数为2次时，多糖粗提物得率随着温度增加呈先上升后下降趋势，在50℃时得率达到最大值，为27.89％。而后随温度上升，得率逐渐降低；由图1b可见，当提取温度为40℃、提取次数2次时，多糖粗提物得率随着提取时间延长呈现快速提高，在3h时达到最高大值，为27.51％，继续延长提取时间，得率呈下降趋势。同样的，由图1c可以看出，当提取温度为40℃、提取时间为3h时，多糖粗提物得率随提取次数的增多呈现先增加后降低的趋势，当提取次数2次时，得率达到最高值，为27.91％，之后增加提取次数，但多糖粗提物得率分别为24.57％、22.44％、19.43％，降低了11.97％、19.6％、30.38％。通过单因素不同水平考察结果可见，提取温度为50℃、提取时间为3h、且提取次数为2次可以获得最高得率。并以此作为Box-Behnken法优化设计的依据。2.3响应面法(Box-Behnken)对提取工艺参数优化试验设计
根据单因素试验结果，选择提取温度、提取时间和提取次数的变化范围为40-60℃、2-4h和1-3次。运用Des ign-Expert 10.0.7软件，以银柴胡多糖粗提物得率(Y)为响应值，考察提取温度(A)、提取时间(B)和提取次数(C)对Y的影响，进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计(表2)。
表2Box-Behnken试验因素与水平设计
试验设计和数据如表3所示。通过对数据进行线性拟合，得到因柴胡多糖粗提物的二次多元回归模型方程。
Y＝28.22-0.71A+1.43B-0.82C+1.36AB+0.39AC+2.24BC-0.67A2-
3.30B2-3.31C2。
银柴胡多糖粗提物回归方程进行了方差分析结果见表4。用F值和P值评价模型的显著性。F值越大，P值越小，模型越显著。如表4所示，该模型的F值为27.47，P＝0.0001，表明该模型具有极显著意义。利用失拟项评价模型的拟合度。该模型失拟项为P＝0.3108>0.05，表示拟合程度较高，表明实验值是准确可靠的。总体而言，银柴胡多糖粗提物的回归模型良好。
表3Box-Behnken优化试验设计与结果
表4回归方程的方差分析
注：*P＜0.05，差异显著；**P＜0.01，差异极显著。
根据上述结果，进一步对3个关键工艺参数超声提取温度，提取时间，提取次数的交互作用进行分析，结果见图2所示三维效应面曲面图和等高线图，曲面图越陡峭，等高线图越接近椭圆，说明交互作用越显著。由图2a可见，在提取温度处于0水平时，提取时间和提取次数的交互作用对多糖粗提物得率的影响极显著(p<0.01，见表4)，表现为三维响应面图中曲面陡峭，其中提取时间(B)比次数(C)对提取得率影响大，而且二维图中等高线也呈明显的椭圆形；由图2b可以看出，在提取次数处于0水平时，提取时间和提取温度的交互作用对多糖粗提物得率具有显著的影响(p<0.05，见表4)，表现为三维响应面图中曲面较陡峭，其中提取时间的影响比提取温度影响大，而且在二维图中等高线呈椭圆形；由图2c可以看出，在提取时间处于0水平时，提取温度和提取次数交互作用对得率影响较小(P>0.05，见表4)，三维响应面图中曲面较为平缓，但提取次数比提取时间影响略大，而且二维等高线图趋近圆形，说明二者之间的交互作用较小。综上所述，以上结果均符合银柴胡多糖粗提物得率回归模型的方差分析。
Box-Behnken优化工艺的验证结果如下：
根据所得模型，根据该模型，通过Design-Expert 10.0.7软件对提取参数进行分析，获得最佳提取条件的理论值，考虑到实际操作简便性，对数值取整数，即提取时间3h、提取次数2次、提取温度45℃、提取得率为27.39％。进一步按此工艺条件进行实际操作验证，结果见表5。由表中结果可见，银柴胡多糖粗提物平均得率为28.16％(SD值＝0.10％，n＝3)，实际值与模型预测值基本相符，误差为2.73％说明模型对银柴胡多糖粗提物工艺参数的优化结果可靠，具有一定的实用价值。获得的银柴胡多糖粗提物中多糖纯度51.98％。
表5最佳提取工艺验证结果
2.4银柴胡粗多糖纯化与分级
首先对获得的银柴胡粗多糖进行除蛋白，采用的方法Sevag，经过比较筛选后，确定使用Sevag试剂除蛋白5次，处理后的多糖测定蛋白含量平均为0.021ug/ml，粗多糖得率为14.45％，纯度达到76.18％。对除蛋白后的多糖进一步进行分级纯化，采用DEAE离子交换色谱法。具体操作为：采用DEAE-52纤维素柱对银柴胡多糖进行分级纯化，称取200mg多糖样品，溶于5ml蒸馏水中，上样至DEAE-52纤维素柱，用蒸馏水、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/LNaCl溶液以1.0ml/min的流速逐步洗脱，每管收集10ml，采用苯酚-硫酸法于482nm处测定吸光度，绘制洗脱曲线。合并同一吸收峰的洗脱液，冻干备用。收集最大峰部分的洗脱液，浓缩后冷冻干燥(预冻温度-20℃、干燥中温度30℃、真空压强60Pa)，得到银柴胡多糖(SRP-1)，经检测，除蛋白后，精制后银柴胡多糖的得率为8.8％，纯度可达到93.49％。
2.5银柴胡多糖单糖组分测定：采用离子色谱-安培检测法(HPAEC-PAD)，具体操作如下：
(1)供试样品衍生化前处理
取干净的色谱瓶，精确称量SRP-1 5mg(±0.05mg)，加入1ml 2MTFA酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2-3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。
(2)单糖衍生物混合对照品的制备
分别称取岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(Gal-UA)、葡萄糖醛酸(Glc-UA)、甘露糖醛酸(Man-UA)、古罗糖醛酸(Gul-UA)各5mg，按照供试品PMP衍生化方法对单糖标品进行衍生化，作为单糖衍生物对照品母液。
(3)仪器及色谱条件
离子色谱仪为：Thermo戴安ICS-5000离子色谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)、脉冲安培检测器。采用DionexTM CarboPacTM PA20(150*3.0mm，10um)液相色谱柱；进样量为5uL。流动相A(0.1M NaOH)，流动相B(0.1M NaOH，0.2M NaAc)，流速0.5ml/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min A相/B相(95：5V/V)，30min A相/B相(80：20V/V)，30.1min A相/B相(60：40V/V)，45min A相/B相(60：40V/V)，45.1min A相/B相(95：5V/V)，60min A相/B相(95：5V/V)。
测定结果如下：
单糖组成：将SRP-1衍生物的离子色谱图和混合标准单糖进行对比(图3和图4)，发现SRP-1主要是由半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)、木糖(Xyl)、果糖(Fru)、甘露糖(Man)以及鼠李糖(Rha)组成，各组分所占比分别为61.81％：32.50％：4.74％：0.39％：0.28％：0.19％。
2.6银柴胡多糖分子量测定：采用高效凝胶色谱技术(HPGPC)测定，具体操作为：
将多糖样品溶解在0.1MNaNO3水溶液中，样品液的终浓度为1mg/mL。上样前将样品液过滤，滤膜为0.22μm，保存待测。色谱条件见表6。
表6色谱条件
多糖分子量：如表7所示，银柴胡多糖的重均分子量(Mw)为31309Da，数均分子量(Mn)为14040Da，Mw/Mn较大，结合单糖组成分析，推测该多糖主要以聚合度较高的中性聚糖片段构成。
表7SRP-1分子参数信息
2.7银柴胡多糖旋光度测定：采用自动旋光仪测定，具体操作如下
称取一定量的银柴胡多糖，配制成2mg/ml的多糖供试溶液，利用自动旋光仪(安东帕MCP200)测定，钠灯作为光源，蒸馏水进行仪器调零，在26℃下测定银柴胡多糖的比旋光度。
经测定分析SRP-1比旋光度[α]D20的测定结果见下表。
表2SRP-1的比旋光度测定结果
2.8银柴胡多糖红外光谱特征鉴定：采用傅里叶红外光谱法，具体操作如下：
精确称取银柴胡多糖(SRP-1)样品2mg，按1:100的比例加入溴化钾粉末，置于玛瑙质研钵中混合研碎，压片机压片20s后放入样品室待测。使用OPUS软件开始扫描，记录红外光谱，波数范围在4000-450cm-1。
红外光谱特征如下所示：
对银柴胡多糖进行傅里叶红外光(FTIR)扫描后得到谱图如下，如图5所示，3290cm-1为多糖分子间或分子内氢键O-H伸缩振动的强且宽的吸收峰，2930cm-1为CH2中C-H伸缩振动的吸收峰，因此一般多糖类物质在这两处都会表现出相似的吸收峰。1632cm-1为羰基的C＝O伸缩振动形成的吸收峰，1412cm-1为C-H的变形振动吸收峰，800-1300cm-1被称为多糖FTIR图谱的“指纹区”，吸收峰密集且高度重叠，多与糖残基类型和链接方式有关，1400-1200cm-1为C-H的变角振动和C-H的伸缩运动构成了糖环的特征吸收，1139cm-1处的吸收峰为吡喃环吸收峰，说明其糖环构型为吡喃型。870cm-1处吸收峰属于β-构型糖苷键，830cm-1处有吸收峰表明SRP-1含有α-构型糖苷键。综上分析，表明银柴胡多糖具有吡喃糖环结构，既存在α-构型糖苷键，也有β-构型糖苷键。
2.9银柴胡粗多糖抗氧化活性试验
精确称取银柴胡粗多糖，分别配制成不同浓度(1、2、4、8、10mg/ml)的多糖供试品溶液。以L-抗坏血酸为抗氧化活性对照品，分别配制成不同浓度的溶液。低温保存，待测。
2.9.1银柴胡多糖清除DPPH自由基能力的测定
取不同浓度的粗多糖供试品溶液，以L-抗坏血酸为阳性对照，于517nm波长处测定吸光度，重复3次。清除率计算方法如下:
式中：A0为无样品的反应混合物溶液吸光度；A1为样品与DPPH溶液的吸光度；A2为无DPPH的反应混合物溶液吸光度。
2.9.2银柴胡粗多糖清除·OH自由基能力的测定
参照文献，取不同浓度粗多糖供试品溶液，以超纯水为参比，L-抗坏血酸作为阳性对照，在510nm波长处测定吸光度，重复3次。清除率计算方法如下:
式中：Aa:为空白对照的吸光度；Ax为加入银柴胡多糖或L-抗坏血酸溶液后的吸光度；Ay为不加H202的样品液吸光度。
2.9.3银柴胡粗多糖清除ABTS自由基能力的测定
采用ABTS自由基清除法。取不同浓度粗多糖供试品溶液，以未加入ABTS的反应混合物作为对照，L-抗坏血酸作为阳性对照，在734nm处测定吸光度，重复3次。按公式(5)计算ABTS阳离子自由基清除率。
式中：A0为无样品的反应混合物溶液吸光度；A1为样品组吸光度；A2为无ABTS的反应混合物溶液吸光度。
如图6所示，银柴胡粗多糖对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除能力均随着浓度的增加而提高，当粗多糖浓度为10mg/mL时，对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除率达到最大值，分别为87.68％、97.74％和99.0％，呈现良好的剂量依赖关系。与同浓度下L-抗坏血酸(阳性对照)的清除能力相比，三者分别达到L-抗坏血酸清除能力的90.77％、98.07％和99.14％，计算IC50分别是5.468、2.369和1.443mg/mL，显示银柴胡粗多糖有较好的体外清除自由基能力。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims (7)

1.一种银柴胡多糖，其特征在于，所述银柴胡多糖由半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖组成，所述半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖所占百分比分别为61.86％、32.51％、4.77％、0.39％、0.28％、0.19％，所述银柴胡多糖的重均分子质量(Mw)为31309Da。
2.根据权利要求1所述的银柴胡多糖，其特征在于，所述银柴胡多糖为吡喃糖环构型，既具有α-构型糖苷键，也具有β-构型糖苷键，所述银柴胡多糖比旋光度[α]D20为+118°。
3.根据权利要求1所述的银柴胡多糖，其特征在于，所述银柴胡多糖的提取方法包括以下步骤：
(1)将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，分别加入30-50％浓度乙醇，离心、弃沉淀，取上清液加入无水乙醇至85％，离心后将下层沉淀用无水乙醇冲洗2次，制得银柴胡多糖粗提物；
(2)银柴胡多糖粗提物溶于蒸馏水后，加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，得到银柴胡粗多糖；
(3)将脱蛋白的银柴胡粗多糖采用DEAE-52纤维素柱进行分级纯化，即得银柴胡多糖；
所述步骤(3)具体为：将脱蛋白后的银柴胡粗多糖溶解于蒸馏水中，得到40mg/ml银柴胡粗多糖溶液，上样至DEAE-52纤维素柱，分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/LNaCl溶液以1.0ml/min的流速逐步洗脱，收集最大峰部分的洗脱液，浓缩后冷冻干燥，制得银柴胡多糖。
4.一种从银柴胡中提取银柴胡多糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将银柴胡药材粉碎至40-60目，通过超临界CO2萃取进行脱脂，制得银柴胡粉末，将所述银柴胡粉末按1:20(W/V)加入水进行超声提取，超声提取的温度为45-50℃、提取时间为2h-4h，提取次数为2次，将滤液合并后过滤，浓缩，加入30-50％浓度乙醇，离心、弃沉淀，取上清液加入无水乙醇至85％，离心后将下层沉淀用无水乙醇冲洗2次，制得银柴胡多糖粗提物；
(2)将银柴胡多糖粗提物加入Sevag试剂脱蛋白4-5次至蛋白含量为0.015-0.025ug/ml，得到银柴胡粗多糖；
(3)将脱蛋白的银柴胡粗多糖采用DEAE-52纤维素柱进行分级纯化，即得银柴胡多糖；
所述步骤(3)具体为：将脱蛋白后的银柴胡粗多糖溶解于蒸馏水中，得到40mg/ml银柴胡粗多糖溶液，上样至DEAE-52纤维素柱，分别用蒸馏水、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/LNaCl溶液以1.0ml/min的流速逐步洗脱，收集最大峰部分的洗脱液，浓缩后冷冻干燥，制得银柴胡多糖。
5.根据权利要求4所述的从银柴胡中提取银柴胡多糖的方法，其特征在于，所述银柴胡多糖由半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖组成，所述半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、甘露糖以及鼠李糖所占百分比分别为61.86％、32.51％、4.77％、0.39％、0.28％、0.19％，所述银柴胡多糖的重均分子质量(Mw)为31309Da。
6.根据权利要求4所述的从银柴胡中提取银柴胡多糖的方法，其特征在于，所述银柴胡多糖为吡喃糖环构型，既具有α-构型糖苷键，也具有β-构型糖苷键，所述银柴胡多糖比旋光度[α]D20为+118°。
7.权利要求1-3任一所述的银柴胡多糖在制备抗氧化产品中的用途。
CN202211471808.9A 2022-11-23 2022-11-23 一种银柴胡多糖及其制备方法和用途 Active CN115819634B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211471808.9A CN115819634B (zh) 2022-11-23 2022-11-23 一种银柴胡多糖及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211471808.9A CN115819634B (zh) 2022-11-23 2022-11-23 一种银柴胡多糖及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115819634A CN115819634A (zh) 2023-03-21
CN115819634B true CN115819634B (zh) 2024-01-26

Family

ID=85530488

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211471808.9A Active CN115819634B (zh) 2022-11-23 2022-11-23 一种银柴胡多糖及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115819634B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102697800A (zh) * 2012-04-26 2012-10-03 贾晓斌 繁缕多糖组合物及其在制备抗病毒药物中的应用
CN112843086A (zh) * 2021-02-01 2021-05-28 宁夏医科大学 一种具有抗抑郁作用的多糖冻干粉及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102697800A (zh) * 2012-04-26 2012-10-03 贾晓斌 繁缕多糖组合物及其在制备抗病毒药物中的应用
CN112843086A (zh) * 2021-02-01 2021-05-28 宁夏医科大学 一种具有抗抑郁作用的多糖冻干粉及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Protective effects of a traditional herbal extract from Stellaria dichotoma var. lanceolata against Mycobacterium abscessus infections;Bae SJ等;Plos One;第13卷(第11期);第 1-19页 *
柴胡多糖的结构和抗氧化活性分析;杜柯 等;生物加工过程;第09卷(第04期);第45-48页 *
银柴胡多糖超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性分析;王红 等;食品工业科技;第1-12页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115819634A (zh) 2023-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yuan et al. Structural characterization of a low-molecular-weight polysaccharide from Angelica pubescens Maxim. f. biserrata Shan et Yuan root and evaluation of its antioxidant activity
Hua et al. Structural characterization of a 2-O-acetylglucomannan from Dendrobium officinale stem
Wang et al. Structural characterization and antioxidant activities of a novel fructan from Achyranthes bidentata Blume, a famous medicinal plant in China
Wu et al. Comparison of different extraction methods of polysaccharides from cup plant (Silphium perfoliatum L.)
Zheng et al. Extraction of polysaccharides and its antitumor activity on Magnolia kwangsiensis Figlar & Noot.
Meng et al. Characterization and immunoregulatory activity of two polysaccharides from the root of Ilex asprella
Zhao et al. Extraction, characterization and antioxidant activity evaluation of polysaccharides from Smilacina japonica
CN112876577B (zh) 一种知母均一多糖及其制备方法与应用
AU2020459437B2 (en) Acanthopanax senticosus Harms homogeneous polysaccharide, preparation method therefor and use thereof
CN109651532B (zh) 一种铁皮石斛葡甘聚糖
CN108727509B (zh) 一种毛竹笋壳阿拉伯半乳聚糖及其制备和用途
CN108997510B (zh) 一种高良姜多糖的抗氧化应用及其分离纯化方法
Benvidi et al. A new water-soluble polysaccharide from Echinops pungens Trautv roots. Part I. Isolation, purification, characterization and antioxidant activity
Wang et al. Structural characteristics and in vitro and in vivo immunoregulatory properties of a gluco-arabinan from Angelica dahurica
Borjigin et al. Extraction, purification, structural characterization and biological activity of polysaccharides from Fritillaria: A review
Yuan et al. Isolation, purification, and physicochemical characterization of Polygonatum polysaccharide and its protective effect against CCl4-induced liver injury via Nrf2 and NF-κB signaling pathways
Zhou et al. Extraction, purification and antioxidant activity of Juglans regia shell polysaccharide
Zhou et al. Preparation, structural characterization and in vitro activity of ginger polysaccharide
CN113896807A (zh) 一种鲜地黄多糖及其制备方法和应用
CN115819634B (zh) 一种银柴胡多糖及其制备方法和用途
Wang et al. Purification, characterization and bioactivities of a 4-O-methylglucuronoxylan from Aralia echinocaulis
CN112794925B (zh) 一种阳春砂多糖及其制备方法和应用
CN102276754A (zh) 红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖及其制备方法和应用
CN111320708B (zh) 一种芦根多糖及其制备方法和用途
CN111154006B (zh) 一种天然低分子量独活多糖及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Peng Li

Inventor after: Wang Hong

Inventor after: Song Le

Inventor after: Feng Lu

Inventor after: Li Zhenkai

Inventor after: Wu Wei

Inventor after: Niu Pilian

Inventor after: Li Yanqing

Inventor after: Li Haipan

Inventor before: Peng Li

Inventor before: Wang Hong

Inventor before: Song Le

Inventor before: Feng Lu

Inventor before: Li Zhenkai

Inventor before: Wu Wei

Inventor before: Niu Pilian

Inventor before: Li Yanqing

Inventor before: Li Haishan

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant