CN116120475B

CN116120475B - 一种云莓均一多糖rcp-90-1及其分离纯化方法和作为抗肿瘤药物的应用

Info

Publication number: CN116120475B
Application number: CN202211309863.8A
Authority: CN
Inventors: 凌娜; 李文兰; 高铭泽; 徐贵国; 田海燕; 王祺瑶
Original assignee: Harbin University of Commerce
Current assignee: Harbin University of Commerce
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2042-10-25
Also published as: CN116120475A

Abstract

云莓均一多糖RCP‑90‑1及其分离纯化方法和作为抗肿瘤药物的应用，它涉及均一多糖及其分离纯化方法和应用，它是要提供新型云莓均一多糖RCP‑90‑1及其制法和应用，本发明的RCP‑90‑1是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖与甘露糖构成的多糖。制法为：采用含乙醇的蒸馏水闪式提取法提取云莓粗多糖，再脱蛋白、脱色，用90％乙醇醇沉后，再采用DEAE‑52纤维素柱层析用0.3mol/L的NaCl溶液洗脱，最后用Sephadex G‑100柱层析纯化，获得RCP‑90‑1；该均一多糖通过诱导线粒体凋亡和调控PI3K‑Akt信号通路来抑制人肝癌HepG‑2细胞的生长活性，可用于人肝癌的治疗领域。

Description

一种云莓均一多糖RCP-90-1及其分离纯化方法和作为抗肿瘤药物的应用

技术领域

本发明涉及一种云莓均一多糖的分离纯化方法及其应用，属于多糖的分离纯化方法及其应用领域。

背景技术

植物多糖是生物体代谢过程中产生的由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键组成的生物大分子化合物，普遍存在于自然界植物体中，包括淀粉、纤维素、多聚糖、果胶等。研究表明，植物多糖具有显著的抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、降血糖、降血脂、抗辐射等生理活性。植物多糖作为一种潜在的抗肿瘤先导化合物，具有安全、高效、无毒等特点，对多糖结构和功能的研究已成为多糖研究领域的重点和热点，也为开发多糖类新药和保健品提供一定的科学依据，具有较高的研究意义和应用价值。

云莓(Rubus chamaemorus或Cloudberries)属于蔷薇科、悬钩子属多年生草本植物，又名沼泽金莓、矮桑悬钩子、兴安悬钩子、鲑莓、黄莓等。云莓高10-25cm，叶子有褶皱，雌雄异株，雄株只开花不结果；生长在阴凉处，喜欢潮湿、酸性(pH3.5～5)和排水良好的土壤，极度耐寒(-40℃以下)，分布于中国东北、俄罗斯、北欧、北美。云莓的果实可食用，成熟的浆果金黄色，色泽宜人、柔软多汁，不仅可以生吃，也被用来制作蜜饯、果酱及甜酒。云莓也是一种药食同源植物，富含维生素C、维生素E、多糖、多酚(鞣花丹宁、花青素)、黄酮类、鞣花酸、膳食纤维、脂肪酸、微量元素等多种活性物质，具有极高的食用和药用价值，对于云莓中有效成分的开发研究具有广阔的市场应用前景。

目前关于云莓多糖的研究报道较少，特别是对云莓多糖的分离纯化、结构鉴定及其应用方面的研究目前尚处于空白阶段。仅有少数几篇类似多糖的相关报道，例如：徐丽萍等在2017年《中国食品添加剂》第9期第187页《响应曲面法优化红树莓多糖提取工艺》中采用响应曲面法对红树莓多糖提取工艺条件进行优化，在料液比为1∶20、温度71℃、时间59min的条件下多糖提取率仅达到10.69％。吴媛媛在2018年其硕士论文《红树莓多糖分离纯化及降血糖作用研究初探》第33-34页中采用复合酶法提取红树莓多糖，响应曲面法优化最佳工艺条件为：复合酶(果胶酶和纤维素酶)配比为1:2、pH4.0、料液比1:30(g/mL)、酶添加量1.5％、酶解温度30℃、酶解时间25min，在此条件下红树莓粗多糖的得率为4.82％。采用DEAE-Sepharose离子交换柱层析和Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析对红树莓多糖进行分离纯化。用蒸馏水和不同浓度NaCl溶液进行梯度洗脱，得到单一峰，命名为RRP-I。高效液相凝胶色谱法(HPLC)和气相色谱法(GC)对RRP-I的分子量和单糖组成进行测定，RRP-I分子量为11220Da，是由葡萄糖组成的均一多糖，且RRP-I具有一定的降血脂活性。此外，滕歆在2014年其硕士论文《树莓果实多糖的提取纯化、结构鉴定及生物活性的研究》第31-37页中采用复合酶法提取树莓多糖。确定最佳反应条件：复合酶(果胶酶：纤维素酶：木瓜蛋白酶＝2.5：1.7：2.1)用量2.6％、pH4、温度55℃、提取时间2.6h，树莓多糖的得率达到4.09％。RCP通过Sephadex G-100柱纯化,去离子水洗脱后得到2个组分,RCP I、RCPⅡ。其中多糖含量较高的组分RCPⅡ分子量为3.9x10³Da。RCPⅡ由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成,其物质量比为1：2.07：0.72：0.85：3.54。红外光谱分析表明RCPⅡ是一种含有乙酰基或糖醛酸的呋喃糖环多糖，且RCPⅡ对DPPH具有非常明显的清除作用。有鉴于此，对云莓中的活性成分特别是对新型、高效低毒抗肿瘤活性多糖的研究与开发具有重要的意义，可能成为新药研发的候选目标之一。

发明内容

本发明是要提供云莓均一多糖RCP-90-1及其分离纯化方法和作为抗肿瘤药物的应用，本发明采用含5％乙醇的蒸馏水闪式提取法从云莓中提取粗多糖，并进行脱蛋白、脱色处理，并采用不同浓度的乙醇分级醇沉，并对90％乙醇醇沉的云莓多糖RCP-90进一步采用DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析进行纯化获得3种云莓均一多糖，其中0.3mol/L的NaCl洗脱得到的即为云莓多糖RCP-90-1；并对云莓多糖RCP-90-1的化学结构进行表征，通过测试云莓多糖RCP-90-1的抗肝癌活性及作用机制，证明云莓多糖的化学结构和抗肿瘤活性之间的构效关系，为临床上抗肝癌药物的研发提供新的理论依据。

本发明的云莓均一多糖RCP-90-1是由阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、核糖(Rib)与甘露糖(Man)按摩尔比为0.63：4.17：1.0：0.62：0.45：0.17构成的多糖。

上述的云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，按以下步骤进行：

(1)云莓的粉碎、脱脂：将干净的云莓果干粉碎过40目筛，获得云莓粉末，用石油醚回流提取，除去其中的脂溶性物质，得到云莓果渣；

(2)云莓多糖的提取：将云莓果渣与含有4％～6％乙醇的蒸馏水按料液比1:(18～22)的比例混合进行闪式提取，设置提取电压180～220V，提取温度80～90℃，提取时间80～100s，反复提取2次，过滤后合并提取液；本步骤设置提取液中含4％～6％的乙醇，用来提高细胞的渗透性，有利于细胞内多糖的溶出，但乙醇浓度过高则降低多糖的溶解性；

(3)云莓粗多糖的浓缩：将提取液冷却、浓缩，获得浓缩液；再将无水乙醇加入到浓缩液中，4℃条件下醇沉12h～15h，离心分离、浓缩、真空干燥，获得云莓粗多糖；

(4)云莓粗多糖的脱蛋白处理：采用蛋白酶法和Sevag法联合对云莓粗多糖进行脱蛋白处理，具体操作为：配制云莓粗多糖水溶液，然后加入木瓜蛋白酶，在温度为54～56℃、pH为6的条件下水浴酶解1～1.5h，再沸水浴灭活，离心去除沉淀；然后在上清液中加入Sevag试剂，振荡15～30min，再静置1～1.5h，离心分离，弃去固相物，即变性蛋白，重复2次，取上清液浓缩，干燥，得到固体粉状脱蛋白的云莓多糖；

(5)云莓粗多糖的脱色处理：配制脱蛋白的云莓多糖溶液，调节pH值至8.0，加入2.5％～3％的H₂O₂溶液脱色，脱色温度为40℃～45℃，脱色时间为1h～1.5h，获得脱色的云莓多糖；本步骤中，H₂O₂的浓度和脱色时间要严格控制，浓度过高，时间过长容易导致氧化脱色，进而引起部分多糖的降解；

(6)除小分子杂质：将脱蛋白、脱色后的云莓多糖置于透析袋中流水透析24h～48h，蒸馏水透析24h～48h，真空干燥，获得纯云莓多糖；

(7)云莓多糖的醇沉：将纯云莓多糖配制成水溶液，向纯云莓多糖溶液中加入质量百分浓度为90％的乙醇进行醇沉，醇沉时的温度控制在4～5℃，醇沉6～7h，然后离心，浓缩、冷冻真空干燥，得到云莓精多糖RCP-90；

(8)云莓多糖的纯化：将云莓精多糖RCP-90配制成水溶液，离心、过滤，然后将上清液加入到预平衡好的DEAE-52纤维柱中，采用浓度为0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱剂流速为1mL/min，收集洗脱液，每管2mL，采用蒽酮-硫酸法对洗脱液进行跟踪检测，收集洗脱峰液体；再加入到Sephadex G-100色谱柱中进一步分离纯化，采用蒸馏水进行洗脱，控制流速为1mL/min，采用蒽酮-硫酸法对层析液进行跟踪检测，收集单一洗脱峰液体；再用蒸馏水透析24h～48h，浓缩、真空冷冻干燥，获得云莓均一多糖RCP-90-1。

更进一步地，步骤(1)中所述的过筛为过40目筛；

更进一步地，步骤(1)中所述的用石油醚回流提取的次数为2次，每次提取2h；

更进一步地，步骤(3)中所述的离心分离是在转速为3000～4000rpm离心分离10～15min；

更进一步地，步骤(4)中所述的Sevag试剂为氯仿：正丁醇按体积比为5：1的混合溶液；

更进一步地，步骤(4)中，云莓粗多糖的脱蛋白处理中，木瓜蛋白酶溶液的加入量是按每克云莓粗多糖加入1000U/mL的木瓜蛋白酶溶液2～3mL；

更进一步地，步骤(4)中所述的离心分离是在转速为3000～4000rpm离心分离10～15min；

更进一步地，步骤(4)中所述的干燥是在温度为40℃的烘箱中干燥1～2小时。

本发明的分离提纯方法在步骤(3)中获得的云莓粗多糖的质量得率为17.72％，提取率较高；步骤(7)中用90％乙醇醇沉获得的RCP-90组分的总糖含量高达89.3％，步骤(8)中进一步纯化后得到的云莓多糖RCP-90-1的质量得率为8.91％。本发明获得的云莓均一多糖RCP-90-1为高附加值云莓多糖的开发和利用奠定一定的理论基础。

上述的云莓均一多糖RCP-90-1的应用，是将云莓均一多糖RCP-90-1作为治疗肝癌的抗肿瘤药物的应用。

本发明获得云莓均一多糖RCP-90-1通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤活性，对人肝癌HepG-2细胞具有显著的抑制作用。云莓均一多糖RCP-90-1对人肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用显著优于RCP-90-0和RCP-90-2(P<0.05或P<0.01)，其中RCP-90-0、RCP-90-1、RCP-90-2对HepG-2细胞作用72h的IC₅₀值分别为477.34mg/L、23.12mg/L、84.23mg/L。此外，RCP-90-1可显著上调肝癌HepG-2细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bad、caspase-3、caspase-9的表达，下调Bcl-2和细胞周期蛋白Cdk2、CyclinA的表达；RCP-90-1还通过调控PI3K-Akt信号通路发挥抗肝癌作用，表现为细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达量也显著降低。本发明的云莓均一多糖RCP-90-1可作为新型的抗肿瘤药物，用于临床上肝癌的治疗。

附图说明

图1为实施例1获得的云莓均一多糖的DEAE-52柱层析洗脱峰图；

图2为实施例1获得的云莓均一多糖RCP-90-1的紫外光谱图；

图3为实施例1获得的云莓均一多糖RCP-90-1的红外光谱图；

图4为实施例1获得的云莓均一多糖RCP-90-1的扫描电镜图；

图5为实施例1获得的云莓均一多糖RCP-90-1的¹H-NMR谱图；

图6为实施例1获得的云莓均一多糖RCP-90-1的¹³C-NMR谱图；

图7为云莓均一多糖RCP-90对人肝癌HepG-2细胞生长抑制图；

图8为云莓均一多糖RCP-90-1对人肝癌HepG-2细胞周期及凋亡的流式细胞图；

图9为云莓均一多糖RCP-90-1对人肝癌HepG-2细胞中相关蛋白的影响图。

具体实施方式

用下面的实施例验证本发明的有益效果。

实施例1：本实施例的云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，具体按以下步骤进行：

(1)云莓的粉碎、脱脂：将干净的云莓果干粉碎过40目筛，获得云莓粗粉，石油醚回流提取2次，每次2h，除去其中的脂溶性物质，得到云莓果渣；

(2)云莓多糖的提取：将云莓果渣与含有5％乙醇的蒸馏水按料液比1:20的比例混合进行闪式提取，设置提取电压200V，提取温度85℃，提取时间90，反复提取2次，过滤后合并提取液；

(3)云莓粗多糖的浓缩：将提取液冷却、浓缩，获得浓缩液；无水乙醇加入到浓缩液中，4℃条件下醇沉15h，3500rpm离心10min、浓缩、真空干燥，获得云莓粗多糖；经过计算，云莓粗多糖的含量为72.44％，得率为17.72％，得率较高；

(4)云莓粗多糖的脱蛋白处理：采用蛋白酶法和Sevag法联合对云莓粗多糖进行脱蛋白处理，具体操作为：配制100mL浓度为10mg/mL的云莓粗多糖水溶液，然后加入1000U/mL的木瓜蛋白酶3mL，55℃，pH为6的条件下水浴酶解1h，沸水浴灭活10min，离心去除沉淀；然后在上清液中加入25mL的Sevag试剂，其中Sevag试剂为氯仿与正丁醇按体积比为5：1的混合溶液，振荡20min，再静置1h，3500rpm下离心15min，弃去固相物，即变性蛋白，重复2次，取上清液浓缩，置于40℃的烘箱中干燥，得到固体粉状脱蛋白的云莓多糖；

(5)云莓粗多糖的脱色处理：配制50mg/mL脱蛋白的云莓多糖溶液，调节pH值至8.0，加入3％的H₂O₂溶液脱色，脱色温度为45℃，脱色时间为1h，获得脱色的云莓多糖；

(6)除小分子杂质：将脱蛋白、脱色后的云莓多糖置于透析袋中流水透析24h，蒸馏水透析24h，真空干燥获得纯云莓多糖；

(7)云莓多糖的分级醇沉：配制50mg/mL的纯云莓多糖水溶液，向纯云莓多糖溶液中依次加入质量百分浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇进行不同浓度乙醇分级醇沉，4℃下每次醇沉6h，3500rpm离心15min，浓缩、冷冻真空干燥，得到各分级云莓精多糖；分级醇沉后得到4组多糖组分，依次记为RCP-30、RCP-50、RCP-70和RCP-90，其中利用质量百分浓度为90％的乙醇醇沉得到的RCP-90中总糖含量最高，达到89.3％，如表1所示。

表1乙醇分级沉淀检测结果

(8)云莓多糖的纯化：将云莓精多糖RCP-90配制成水溶液，离心、过滤，然后将上清液加入到预平衡好的DEAE-52纤维柱中，分别采用浓度为0、0.3、0.6mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱剂流速1mL/min，收集洗脱液，每管2mL，采用蒽酮-硫酸法对洗脱液进行跟踪检测，收集洗脱峰液体；再加入到Sephadex G-100色谱柱中进一步分离纯化，采用蒸馏水进行洗脱，控制流速为1mL/min，采用蒽酮-硫酸法对层析液进行跟踪检测，收集单一洗脱峰液体；再用蒸馏水透析24h，浓缩、真空冷冻干燥，获得3种云莓均一多糖。云莓均一多糖的DEAE-52柱层析洗脱峰图如图1所示，图1显示0、0.3mol/L和0.5mol/L的NaCl洗脱分别得到云莓多糖RCP-90-0、RCP-90-1和RCP-90-2。

本实施例1中提取的云莓粗多糖含量为72.44％，得率为17.72％，90％乙醇醇沉获得的RCP-90组分总糖含量最高，达到89.3％，进一步纯化后得到的云莓均一多糖RCP-90-1的得率最高(267.29mg，8.91％)，显著高于RCP-90-0(118.64mg，3.95％)和RCP-90-2(145.58mg，4.37％)(P<0.01)。

实施例2：本实施例对实施例1提取的云莓均一多糖RCP-90的结构进行鉴定，如下。

1.分子量测定：制备2.0mg/mL样品溶液，5000rpm离心10min，0.22μm滤膜过滤收集样品。采用液相色谱法测定各均一多糖组分的分子量，流动相为超纯水，流速为1mL/min，压力为1.4MPa，进样量为20μL，采用Astra软件计算多糖的分子量。

经计算，RCP-90-0、RCP-90-1和RCP-90-2的分子量分别为2.09kDa、3.75kDa和2.87kDa。

2.单糖组成：分别取3种云莓均一多糖RCP-90-0、RCP-90-1和RCP-90-2各10mg，分别在90℃下溶解于2mL的3.0mol/L三氟乙酸中酸水解6h，然后进行气相色谱分析，起始温度为140℃，进样温度为250℃，载气为氦气(He)，流速为1mL/min。经本实施例获得的3种云莓均一多糖的单糖组成及摩尔比如表2所示：其中云莓均一多糖RCP-90-1是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖与甘露糖按摩尔比为0.63：4.17：1.0：0.62：0.45：0.17组成。

表2实施例1获得的3种云莓均一多糖的单糖组成及摩尔比

3.紫外光谱分析：用云莓均一多糖RCP-90-1配制成浓度为0.5mg/mL的水溶液，用紫外分光光度计对多糖溶液进行扫描，扫描200～400nm的波长范围。云莓均一多糖RCP-90-1的紫外光谱图如图2所示。由图可知，云莓均一多糖RCP-90-1在206nm处具有多糖特征吸收峰，证明RCP-90-1是一种多糖类物质；在260nm和280nm两个波长处均无吸收峰，说明云莓均一多糖RCP-90-1中不含有游离的核酸和蛋白质。

4.红外光谱分析：取2.0mg云莓均一多糖RCP-90-1样品与KBr粉末混合压片，在4000～400cm^-1范围内进行红外光谱扫描，对云莓多糖的主要官能团进行鉴定。云莓均一多糖RCP-90-1的红外光谱图如图3所示。由图3可知，云莓均一多糖RCP-90-1在3420.78cm^-1处有羟基O-H的伸缩振动峰，2924.56cm^-1附近的吸收峰为C-H伸缩振动峰，1648.66cm^-1处有羰基C-O伸缩振动峰，表明RCP-90-1是一种多糖水合物，1467.78cm^-1附近的吸收峰与C-H的弯曲振动有关，1078.29cm^-1处的吸收峰表明RCP-90-1中存在吡喃糖，813.54cm^-1处的吸收峰为β-糖苷键的特征峰，红外光谱表明RCP-90-1是一种β-吡喃糖。

5.扫描电镜分析：将云莓均一多糖RCP-90-1粉末均匀附着于样品台上，采用扫描电镜观察多糖表面形态。云莓均一多糖RCP-90-1的扫描电镜图如图4所示；由图可知，云莓均一多糖RCP-90-1呈片状结构，表面不规整，常沿边缘折叠，结构紧密，说明分子间作用力较强。

6.核磁共振光谱分析：将20mg云莓均一多糖RCP-90-1溶于D2O中，采用核磁共振波谱仪上机检测，¹H-NMR和¹³C-NMR光谱分析多糖的结构特征。云莓均一多糖RCP-90-1的¹H-NMR谱图如图5所示，由图可知，在¹H-NMR谱中，端基区出现的糖基信号化学位移均小于5ppm，表明云莓多糖中存在β-型糖苷键。云莓均一多糖RCP-90-1的¹³C-NMR谱图如图6所示。由图可知，在¹³C-NMR谱中有多个信号峰，分别为C1～C6信号，结合红外光谱分析，RCP-90-1主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖、甘露糖组成的β-吡喃糖。

实施例3：本实施例对实施例1提取的云莓均一多糖RCP-90进行抗肿瘤活性检测，如下。

1.生长抑制作用：采用MTT法检测3种云莓均一多糖RCP-90-0、RCP-90-1和RCP-90-2对人肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用。具体操作步骤为：取对数生长期的人肝癌HepG-2细胞，调整细胞密度为5×10⁴个/mL。在96孔板中每孔加入100μL单细胞悬液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。设置0、25、50、100、200mg/L不同浓度的云莓多糖溶液，每孔加入100μl，继续培养72h。弃去培养液，每孔加入100μL的0.5mg/mL MTT溶液，继续培养4h，弃上清，每孔再加入150μL DMSO溶液，振荡10min，用酶标仪在490nm波长下测定其吸光度值(OD)。计算云莓均一多糖对肝癌HepG-2细胞的生长抑制率和IC₅₀。

抑制率(％)＝(对照组OD值－给药组OD值)/对照组OD值×100％

云莓均一多糖RCP-90-0、RCP-90-1、RCP-90-2对人肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用如图7所示，由图7可知，云莓均一多糖RCP-90-1对人肝癌HepG-2细胞的生长抑制作用显著优于RCP-90-0和RCP-90-2(P<0.05或P<0.01)，RCP-90-0、RCP-90-1、RCP-90-2对HepG-2细胞作用72h的IC₅₀值分别为477.34mg/L、23.12mg/L、84.23mg/L。结果表明RCP-90-1对肝癌细胞具有显著的增殖抑制作用，可用于后续肝癌抗肿瘤药物的研究和开发。

2.细胞周期和凋亡检测：采用流式细胞术检测云莓均一多糖RCP-90-1对人肝癌HepG-2细胞周期和细胞凋亡的影响。具体操作为：制备人肝癌HepG-2细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁶/mL，6孔板中每孔加入1mL细胞悬液，培养24h后，添加0、50、100、200mg/L的云莓多糖RCP-90-1溶液，继续培养48h。收集细胞，PBS洗2次，75％冰乙醇4℃固定2h以上，2000rpm离心5min，PBS洗涤1次，加入10μL的RNase A和10μL的PI染液(5g/mL)，避光染色30min，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化。

用流式细胞术检测云莓多糖RCP-90-1对人肝癌HepG-2细胞周期和细胞凋亡的影响如图8所示，由图8可知，云莓多糖RCP-90-1可诱导HepG-2细胞发生S期周期阻滞和细胞凋亡，且具有剂量依赖性。

3.蛋白表达：采用Western blot检测云莓均一多糖RCP-90-1对肝癌HepG-2细胞中与细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达的影响，主要检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CDK2、CyclinA等蛋白的表达。主要包括细胞处理及蛋白样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、蛋白检测等步骤，最后采用ECL化学发光试剂盒进行显色，凝胶扫描分析系统进行拍照分析。

用Western Blot法检测RCP-90-1对人肝癌HepG-2细胞中相关蛋白的表达情况如图9所示，结果显示：RCP-90-1可显著上调HepG-2细胞中Bax、Caspase-3、caspase-9、Cyt-C蛋白的表达，下调Bcl-2和细胞周期蛋白CyclinA、CDK2的表达。此外，RCP-90-1还通过调控PI3K-AKT信号通路抑制人肝癌HepG-2细胞的活性，表现为细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达量显著降低。

结果表明，云莓多糖RCP-90-1主要通过线粒体凋亡途径和PI3K-AKT信号通路抑制人肝癌HepG-2细胞的活性，诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，云莓均一多糖RCP-90-1可作为一种新型的抗肿瘤药物应于临床上肝癌的治疗领域。

Claims

1.一种云莓均一多糖RCP-90-1，其特征在于该云莓均一多糖RCP-90-1是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、核糖与甘露糖按摩尔比为0.63：4.17：1.0：0.62：0.45：0.17构成的多糖，云莓均一多糖RCP-90-1的分子量为3.75kDa。

2.分离纯化权利要求1所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

（1）云莓的粉碎、脱脂：将干净的云莓果干粉碎过筛，获得云莓粉末，用石油醚回流提取，除去其中的脂溶性物质，得到云莓果渣；

（2）云莓多糖的提取：将云莓果渣与含有4%~6%乙醇的蒸馏水按料液比1:（18~22）的比例混合进行闪式提取，设置提取电压180~220V，提取温度80~90℃，提取时间80~100s，反复提取2次，过滤后合并提取液；

（3）云莓粗多糖的浓缩：将提取液冷却、浓缩，获得浓缩液；再将无水乙醇加入到浓缩液中，4℃条件下醇沉12h~15h，离心分离、浓缩、真空干燥，获得云莓粗多糖；

（4）云莓粗多糖的脱蛋白处理：采用蛋白酶法和Sevag法联合对云莓粗多糖进行脱蛋白处理，具体操作为：配制云莓粗多糖水溶液，然后加入木瓜蛋白酶，在温度为54~56℃、pH为6的条件下水浴酶解1~1.5h，再沸水浴灭活，离心去除沉淀；然后在上清液中加入Sevag试剂，振荡15~30min，再静置1~1.5h，离心分离，弃去固相物，即变性蛋白，重复2次，取上清液浓缩，干燥，得到固体粉状脱蛋白的云莓多糖；

（5）云莓粗多糖的脱色处理：配制脱蛋白的云莓多糖溶液，调节pH值至8.0，加入2.5%~3%的H₂O₂溶液脱色，脱色温度为40℃～45℃，脱色时间为1h～1.5h，获得脱色的云莓多糖；

（6）除小分子杂质：将脱蛋白、脱色后的云莓多糖置于透析袋中流水透析24h～48h，蒸馏水透析24h～48h，真空干燥，获得纯云莓多糖；

（7）云莓多糖的醇沉：将纯云莓多糖配制成水溶液，向纯云莓多糖溶液中加入质量百分浓度为90%的乙醇进行醇沉，醇沉时的温度控制在4~5℃，醇沉6~7h，然后离心，浓缩、冷冻真空干燥，得到云莓精多糖RCP-90；

（8）云莓多糖的纯化：将云莓精多糖RCP-90配制成水溶液，离心、过滤，然后将上清液加入到预平衡好的DEAE-52纤维柱中，采用浓度为0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，洗脱剂流速为1mL/min，收集洗脱液，每管2mL，采用蒽酮-硫酸法对洗脱液进行跟踪检测，收集洗脱峰液体；再加入到Sephadex G-100色谱柱中进一步分离纯化，采用蒸馏水进行洗脱，控制流速为1mL/min，采用蒽酮-硫酸法对层析液进行跟踪检测，收集单一洗脱峰液体；再用蒸馏水透析24h～48h，浓缩、真空冷冻干燥，获得云莓均一多糖RCP-90-1。

3.根据权利要求2所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，其特征在于步骤（1）中所述的过筛为过40目筛。

4.根据权利要求2或3所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中所述的用石油醚回流提取的次数为2次，每次提取2h。

5.根据权利要求2或3所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，其特征在于，步骤（3）中所述的离心分离是在转速为3000~4000rpm离心分离10~15min。

6.根据权利要求2或3所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，其特征在于，步骤（4）中所述的Sevag试剂为氯仿：正丁醇按体积比为5：1的混合溶液。

7.根据权利要求2或3所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，其特征在于，步骤（4）中，云莓粗多糖的脱蛋白处理中，木瓜蛋白酶溶液的加入量是按每克云莓粗多糖加入1000U/mL的木瓜蛋白酶溶液2~3mL。

8.根据权利要求2或3所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，其特征在于，步骤（4）中所述的离心分离是在转速为3000~4000rpm离心分离10~15min。

9.根据权利要求2或3所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的分离纯化方法，其特征在于，步骤（4）中所述的干燥是在温度为40℃的烘箱中干燥1~2小时。

10.根据权利要求1所述的一种云莓均一多糖RCP-90-1的应用，其特征在于该应用是将云莓均一多糖 RCP-90-1作为制备治疗肝癌抗肿瘤药物的应用。