CN116987204A - 一种均一银耳多糖的制备方法 - Google Patents
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Classifications
-
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Abstract
本发明属于多糖技术领域，具体涉及一种均一银耳多糖的制备方法，它包括以下制备步骤：将干银耳进行粉碎，过筛，与蒸馏水混合，加热至沸腾状态，提取，冷却至室温后，离心分离，上清液浓缩，加入乙醇溶液，搅拌，析出沉淀，得到银耳粗多糖，将银耳粗多糖静置后取出沉淀，冻干备用，用超纯水复溶，得到多糖溶液，向多糖溶液中滴加ATC溶液，调节多糖溶液pH值，静置，离心分离，得到银耳多糖溶液；向银耳多糖溶液中加入大孔树脂，搅拌，得到脱色的银耳多糖溶液，置于透析袋中，将透析后的袋内银耳多糖溶液，浓缩，冷冻干燥，得到均一银耳多糖。采用本发明方法制备得到大量均一银耳多糖，且方法快速便捷。
Description
技术领域
本发明属于多糖制备技术领域，具体涉及一种均一银耳多糖的制备方法。
背景技术
银耳(Tremellafuciformis)又名白木耳、雪耳、菊花耳，隶属担子菌门(Basidiomycota)异隔担子菌纲(Every basidiomycotina)银耳目(Tremellales)银耳科(Tremellaceae)银耳属(Tremella)，是一种具有较高研究开发价值的珍贵食用菌。银耳多糖是银耳中的主要活性成分，它具有提高机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、降血糖血脂、美白、保湿等保健功能。银耳多糖的提取易受多种因素影响，据研究表明，不同产地的原材料、不同的采收时间、不同的提取方法等都会影响最终提取出的银耳多糖结构和性质。目前，很多研究者对银耳多糖的提取都遵循先制备粗样，后通过柱层析的方法得到均一银耳多糖。这样方法过于耗时，且通过柱层析后得到的均一多糖产量极低，严重阻碍了银耳多糖的进一步开发和利用。此外，在柱层析阶段，每位研究者采用的填料、柱子类型、填充比例、洗脱流速和时间皆不相同，造成提取出的银耳多糖结构都存在差异。而银耳多糖本身结构就比较复杂，这样的差异给后续对银耳多糖的理化性质和生物活性研究带来了困扰。严重影响了银耳多糖在各个领域的开发与应用，极大程度上阻碍了其的标准化和推广公开。因此，开发一种新的、耗能少、效率高、能够快速得到大量均一银耳多糖的方法是很有必要的。综上，建立专属性强、规范化高、操作要求低、产量大、品质有保障的银耳均一多糖制备方法，对银耳多糖的生产开发和质量控制，具有极大的市场潜在价值和推广意义。
发明内容
本发明旨在解决上述技术问题，提供一种均一银耳多糖的制备方法，采用该方法制备得到大量均一银耳多糖，且方法快速便捷。
本发明的技术方案为：
一种均一银耳多糖的制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将干银耳进行粉碎，过筛，得到银耳干粉；
(2)将银耳干粉与蒸馏水混合，加热至沸腾状态，提取，冷却至室温后，离心分离，取上清液；
(3)将上清液浓缩，得到浓缩液；
(4)向浓缩液中加入乙醇溶液，搅拌8-12min，析出的沉淀，得到银耳粗多糖，将银耳粗多糖置于2-6℃环境中静置10-14h后取出沉淀，冻干备用；
(5)将步骤(4)得到的冻干银耳粗多糖用超纯水复溶，得到多糖溶液，向多糖溶液中滴加其重量10％的质量分数为10％的ATC溶液(三氯乙酸溶液)，调节多糖溶液pH值至2.3-2.7，置于2-6℃环境中静置12-14h后，离心分离，得到银耳多糖溶液；
(6)向步骤(5)得到的银耳多糖溶液加入大孔树脂，搅拌，抽滤，所得溶液即为脱色的银耳多糖溶液；
(7)将步骤(6)得到的银耳多糖溶液，置于截留分子量为8000-14000Da的透析袋中；
(8)将步骤(7)透析后的袋内银耳多糖溶液，浓缩，冷冻干燥，得到均一银耳多糖。
本发明中，采用ATC溶液除去银耳粗多糖中的蛋白效果会更加温和，更有利于保持银耳粗多糖有效成分的活性。
为保证提取样品的规格一致性，优选地，本发明所述步骤(1)中，粉碎后的银耳过60目筛。
为了最大限度促进多糖的溶出，优选地，本发明所述步骤(2)中，将银耳干粉与蒸馏水按1mg:60ml的比例于沸水中提取2h，所述沸水沸点因各地方气压高低的影响会有不同，如对于昆明市而言，实际温度约为96～97℃，冷却至室温，室温实际指提取时室内温度，本发明在昆明市提取，提取时为夏季，室内温度22～24℃。
优选地，本发明所述步骤(2)重复2次，合并上清液并且抽滤，通过抽滤可避免上清液中含有的少量漂浮杂质而影响后续制备。
优选地，本发明所述步骤(3)中，浓缩上清液至原体积的1/10；本发明所述步骤(4)中，浓缩液与乙醇溶液的体积比为1:4，所述乙醇溶液的体积浓度为95％。
优选地，本发明所述步骤(5)中，将步骤(4)得到的冻干银耳粗多糖用超纯水复溶体积浓度为5mg/ml的多糖溶液，本发明步骤(5)滴加ATC溶液并调节pH值，使溶液达到蛋白质的等电点使蛋白质析出，同时又保证银耳多糖不析出，保证银耳多糖的收率。
优选地，本发明所述步骤(6)中，向步骤(5)得到的银耳多糖溶液中加入其1/4体积的大孔树脂，以2500r/min的转速搅拌2h。
优选地，本发明所述步骤(7)中，透析袋每6h换一次水，透析72h。
为了使得银耳多糖尽可能析出，优选地，本发明所述步骤(8)中，浓缩其至原体积的1/10。
由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
1、通过本发明方法能够制备得到均一银耳多糖，且该方法不使用柱层析分离，就能快捷制备均一银耳多糖的方法。
2、本发明可极大程度上化简制备流程，节约时间和技术成本、材料成本，以及大幅提高生产控制效率，并达到生产过程和质量可控、产品纯度高、重现性好、容易放大生产的目的。
3、本发明方法制备得到的均一银耳多糖具有优异的抗氧化活性，对酪氨酸酶和弹性蛋白酶显著抑制效果，还具有优异地吸湿和保湿活性。
附图说明
图1为本发明实施例1提取银耳多糖的原材料干制银耳子实体。
图2为本发明实施例1得到的冻干粗银耳多糖样品和均一银耳多糖样品，其中，A为冻干粗银耳多糖样品、B为均一银耳多糖。
图3为本发明实施例1得到的均一银耳多糖的柱层析洗脱峰图，其中，A为DEAE-52纤维素柱层析洗脱峰，B为Sephadex G-200凝胶柱层析洗脱峰。
图4为本发明实施例1得到的均一银耳多糖的高效凝胶渗透色谱(HPGPC)图。
图5为本发明实施例1得到的均一银耳多糖的离子色谱图。
图6为本发明实施例1得到的均一银耳多糖的红外光谱图。
图7为本发明实施例1得到的均一银耳多糖甲基化后的GC-MS色谱图。
图8为本发明实施例1得到的均一银耳多糖与I2-KI反应物的紫外可见光谱图。
图9为本发明实施例1得到的均一银耳多糖与刚果红的反应曲线图。
图10为本发明实施例1均一银耳多糖的DPPH自由基清除能力。
图11为本发明实施例1均一银耳多糖的ABTS自由基清除能力。
图12为本发明实施例1均一银耳多糖的总抗氧化能力。
图13为本发明实施例1均一银耳多糖对酪氨酸酶的抑制活性。
图14为本发明实施例1均一银耳多糖对弹性蛋白酶的抑制活性。
图15为本发明实施例1均一银耳多糖的吸湿活性。
图16为本发明实施例1均一银耳多糖的保湿活性。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种均一银耳多糖的制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将干银耳进行粉碎，60目筛，得到银耳干粉；
(2)将银耳干粉与蒸馏水按1mg:60ml的比例混合，加热至沸腾状态，保持沸腾状态提取2h，冷却至室温后，在8000r/min条件下离心5min，取上清液，重复2次，合并上清液，真空度0.06MPa条件下采用布氏漏斗进行抽滤；
(3)将抽滤后的上清液，使用真空旋转蒸发仪(真空度为0.08MPa)浓缩其至原体积的1/10，得到浓缩液；
(4)向浓缩液中加入其体积4倍的体积浓度为95％乙醇溶液，搅拌10min，析出的沉淀，得到银耳粗多糖，将银耳粗多糖置于4℃环境中静置12h后，用120目筛网过滤乙醇溶液，取出沉淀，冻干备用；
(5)将步骤(4)得到的冻干银耳粗多糖用超纯水复溶体积浓度为5mg/ml的多糖溶液，得到多糖溶液，向多糖溶液中滴加其重量10％的质量分数为10％的ATC溶液(取三氯乙酸使用超纯水配置至质量分数为10％而得到)，调节多糖溶液pH值至2.5，置于4℃环境中静置12h后，于8000r/min条件下离心10min，取上清液，得到银耳多糖溶液；
(6)向步骤(5)得到的银耳多糖溶液加入其1/4体积的AB-8大孔树脂，以2500r/min的转速在50℃条件下搅拌2h，抽滤，所得溶液即为脱色的银耳多糖溶液；
(7)将步骤(6)得到的银耳多糖溶液，置于截留分子量为14000Da的透析袋中，透析袋每6h换一次水，于4℃透析72h；
(8)将步骤(7)透析后的袋内银耳多糖溶液，使用真空旋转蒸发仪(真空度为0.08MPa)浓缩至其原体积的1/10，冷冻干燥，得到分子量(843455Da)稳定、均一银耳多糖。
实施例2
一种均一银耳多糖的制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将干银耳进行粉碎，60目筛，得到银耳干粉；
(2)将银耳干粉与蒸馏水按1mg:60ml的比例混合，加热至沸腾状态，保持沸腾状态提取2h，冷却至室温后，在8000r/min条件下离心5min，取上清液，重复2次，合并上清液，真空度0.06MPa条件下采用布氏漏斗进行抽滤；
(3)将抽滤后的上清液，使用真空旋转蒸发仪(真空度为0.08MPa)浓缩其至原体积的1/10，浓缩其至原体积的1/10，得到浓缩液；
(4)向浓缩液中加入其体积4倍的体积浓度为95％乙醇溶液，搅拌8min，析出的沉淀，得到银耳粗多糖，将银耳粗多糖置于2℃环境中静置12h后，用120目筛网过滤乙醇溶液，取出沉淀，冻干备用；
(5)将步骤(4)得到的银耳粗多糖用超纯水复溶体积浓度为5mg/ml的多糖溶液，得到多糖溶液，向多糖溶液中滴加其重量10％的质量分数为10％的ATC溶液(取三氯乙酸使用超纯水配置至质量分数为10％而得到)，调节多糖溶液pH值至2.3，置于4℃环境中静置12h后，于8000r/min条件下离心10min，取上清液，得到银耳多糖溶液；
(6)向步骤(5)得到的银耳多糖溶液中加入其1/4体积的AB-8大孔树脂，以2500r/min的转速在60℃条件下搅拌2h，抽滤，所得溶液即为脱色的银耳多糖溶液；
(7)将步骤(6)得到的银耳多糖溶液，置于截留分子量为8000Da的透析袋中，透析袋每6h换一次水，于4℃透析72h；
(8)将步骤(7)透析后的袋内银耳多糖溶液，浓缩至其原体积的1/10，冷冻干燥，得到均一银耳多糖。
实施例3
一种均一银耳多糖的制备方法，包括以下制备步骤：
(1)将干银耳进行粉碎，60目筛，得到银耳干粉；
(2)将银耳干粉与蒸馏水按1mg:60ml的比例混合，加热至沸腾状态，保持沸腾状态提取2h，冷却至室温后，在8000r/min条件下离心5min，取上清液，重复2次，合并上清液，真空度0.06MPa条件下采用布氏漏斗进行抽滤；
(3)将抽滤后的上清液，浓缩其至原体积的1/10，得到浓缩液；
(4)向浓缩液中加入其体积4倍的体积浓度为95％乙醇溶液，搅拌12min，析出的沉淀，得到银耳粗多糖，将银耳粗多糖置于6℃环境中静置14h后，用120目筛网过滤乙醇溶液，取出沉淀，冻干备用；
(5)将步骤(4)得到的银耳粗多糖用超纯水复溶体积浓度为5mg/ml的多糖溶液，得到多糖溶液，向多糖溶液中滴加其重量10％的质量分数为10％的ATC溶液(取三氯乙酸使用超纯水配置至10％而得到)，调节多糖溶液pH值至2.7，置于4℃环境中静置12h后，于8000r/min条件下离心10min，取上清液，得到银耳多糖溶液；
(6)向步骤(5)得到的银耳多糖溶液中加入其1/4体积的AB-8大孔树脂，以2500r/min的转速在60℃条件下搅拌2h，抽滤，所得溶液即为脱色的银耳多糖溶液；
(7)将步骤(6)得到的银耳多糖溶液，置于截留分子量为8000Da的透析袋中，透析袋每6h换一次水，于4℃透析72h；
(8)将步骤(7)透析后的袋内银耳多糖溶液，浓缩至其原体积的1/10，冷冻干燥，得到均一银耳多糖。
试验例1：测定本发明均一银耳多糖化学成分组成
本发明测定了实施例1的银耳粗多糖、均一银耳多糖、过柱多糖(实施例1均一银耳多糖经柱层析分离后收集分离洗脱峰(洗脱峰见图3)所得多糖记为过柱多糖)的化学组成成分，具体为多糖的总糖含量、还原糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量、水分含量测定，包括如下步骤：
步骤1：采用苯酚-硫酸法测定银耳多糖的总糖含量。以葡萄糖标准品溶液质量浓度(x,μg/ml)为横坐标，其相对应的吸光度(y,490nm)为纵坐标，绘制线性回归曲线，得到方程(1)：y＝5.5659x+0.0005，R2＝0.9985，结果表明在0～100μg/ml的范围内，吸光度与葡萄糖浓度线性关系良好。
步骤2：采用DNS法测定银耳多糖的还原糖含量。以葡萄糖标准品溶液质量浓度(x,μg/ml)为横坐标，其相对应的吸光度(y,540nm)为纵坐标，绘制线性回归曲线，得到方程(2)：y＝0.8019x+0.1294，R2＝0.9909，结果表明在0～100μg/ml的范围内，吸光度与葡萄糖浓度线性关系良好。
步骤3：采用间羟基联苯法测定银耳多糖的糖醛酸含量。以D-半乳糖醛酸标准品溶液质量浓度(x,μg/ml)为横坐标，其相对应的吸光度(y,525nm)为纵坐标，绘制线性回归曲线，得到方程(3)：y＝1.066x+0.0642，R2＝0.9962，结果表明在0～100μg/ml的范围内，吸光度与D-半乳糖醛酸浓度线性关系良好。
步骤4：采用考马斯亮蓝法测定银耳多糖的蛋白质含量。以牛血清白蛋白标准品溶液质量浓度(x,μg/ml)为横坐标，其相对应的吸光度(y,595nm)为纵坐标，绘制线性回归曲线，得到方程(4)：y＝2.7306x+0.4610，R2＝0.9955，结果表明在0～100μg/ml的范围内，吸光度与牛血清白蛋白浓度线性关系良好。
样品的测定：将样品吸光度值分别代入回归方程(1)、(2)、(3)、(4)，计算银耳多糖样品中总糖、还原糖、糖醛酸、蛋白质的含量。
步骤5：采用105℃烘箱法测定银耳多糖水分含量。
上述测定结果见表1。
表1银耳粗多糖、均一银耳多糖、过柱多糖的化学成分组成
注：表1中不同小写字母分别表示不同多糖对应成分差异显著(p值<0.05)。
从表1可知，过柱多糖总糖含量，糖醛酸含量，水分含量都为最高。均一多糖的总糖含量、糖醛酸含量次之，这与过柱多糖的总糖含量几乎无差别。均一多糖水分含量与过柱多糖相比，差别也较小。而粗多糖因含有蛋白质、还原糖以及其它小分子杂质，故总糖含量、糖醛酸含量相对较低。以上结果表明，通过采用本发明方法即可制备均一银耳多糖，不使用柱层析分离，也能达到柱层析分离的效果。
试验例2：测定本发明均一银耳多糖分子量和纯度
为确定银耳均一多糖的纯度品质并进行质量监控，对实施例1均一银耳多糖的分子量和纯度进行了测定。
通过HPGPC测定多糖分子量和纯度，以系列分子量葡聚糖为标准品进行分子量测定，具体步骤如下：
步骤1：精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中；
步骤2：色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μl；检测器：示差检测器RI-10A。
经计算得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。如下所示：
lgMp-RT校正曲线方程(5)为：y＝-0.184x+11.752R2＝0.9956；
lgMw-RT校正曲线方程为(6)：y＝-0.1961x+12.315R2＝0.9934；
lgMn-RT校正曲线方程为(7)：y＝-0.1818x+11.589R2＝0.9920；
根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小。样品的分子量图谱如图4，仅有唯一的分子量峰，计算结果见表2所示。
表2均一银耳多糖分子量
试验例3：均一银耳多糖的结构表征
采用离子色谱法确定其单糖组成，红外光谱法确定官能团，甲基化分析其连接方式，I2-KI反应确定其支链结构单一或复杂，刚果红反应确定其是否具有三螺旋结构，核磁共振确定其信号峰，和对其结构的进一步分析。
1、采用离子色谱法测定实施例1得到的均一银耳多糖的单糖组成。其离子色谱图见图5，混标中，1为岩藻糖，2为盐酸氨基半乳糖，3为鼠李糖，4为阿拉伯糖，5为盐酸氨基葡萄糖，6为半乳糖，7为葡萄糖，8为N-乙酰-D氨基葡萄糖，9为木糖，10为甘露糖，11为果糖，12为核糖，13为半乳糖醛酸，14为古罗糖醛酸，15为葡萄糖醛酸，16为甘露糖醛酸。
实施例1得到的均一银耳多糖的单糖组成结果见表3。
表3均一银耳多糖的单糖组成
2、通过红外光谱观察多糖基团伸缩振动吸收峰，分析多糖所含基团。
称取2.0mg实施例1得到的冷均一银耳多糖样品，在红外光下与溴化钾一起研磨，制作溴化钾压片，采用傅立叶红外光谱仪进行红外光谱扫描，扫描波长范围为4000-400cm-1。
实施例1得到的均一银耳多糖的红外结果如图6所示。吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：
3390cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，表明存在分子间和分子内氢键，是糖类的特征峰。在2929cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C-H伸缩振动。在1635cm-1处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。在1558cm-1处、1540cm-1处有吸收峰，可能归属于C＝O伸缩振动。在1455cm-1处有吸收峰，可能归属于C-H变角振动。在1417cm-1处、1243cm-1处、1133cm-1处、1066cm-1处有吸收峰，可能归属于C-O伸缩振动。在1338cm-1处有吸收峰，可能归属于C＝O对称伸缩振动。这几组峰可初步判断均一银耳多糖是多糖类化合物。在917cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的非对称环伸缩振动。在894cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的β-端基差向异构的C-H变角振动。综上，初步确定均一银耳多糖可能是具有β-型糖苷键连接的多糖。
3、将实施例1得到的均一银耳多糖，先甲基化后水解以形成糖醇乙酸酯衍生物，再通过GC-MS分析，根据保留时间和质谱中的特征碎片进行结构鉴定。均一银耳多糖的糖苷键组成成分析结果如图7所示。同时，我们在表4中进行了总结。将均一银耳多糖先甲基化后水解以形成糖醇乙酸酯衍生物，再通过GC-MS分析，根据保留时间和质谱中的特征碎片进行结构鉴定。均一银耳多糖甲基化结果显示其存在3个主要残基，分别是(1→4,6)连接的α型甘露糖(22.6％)，(1→3)连接的α型岩藻糖(22.6％)和(1→4)连接的β型葡萄糖(21.6％)，其支链的糖残基主要含有(1→3)连接的β型木糖(6.4％)，(1→4)连接的甘露糖(1.5％)以及(1→)连接的半乳糖(1.3％)。结合单糖结果分析，得出均一银耳多糖是以(1→4,6)连接的α型甘露糖为主链，(1→3)连接的α型岩藻糖，(1→4)连接的β型葡萄糖，(1→3)连接的β型木糖为主要支链，以及含有少量半乳糖、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸支链构成的酸性杂多糖。
表4实施例1均一银耳多糖的甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析
4、配制实施例1得到的均一银耳多糖溶液(1mg/ml)与碘试剂(含0.02％I2的0.2％KI溶液)混匀，测定300-600nm波长范围内的吸收光谱，若在565nm处有最大吸收则说明多糖有较少的分支和较短的侧链。
如图8所示，均一银耳多糖与I2-KI的反应物最大吸收峰在350.5nm，而565nm处并没有最大吸收，说明均一银耳多糖可能存在较长的侧链和较多的分支。这与均一银耳多糖单糖组成复杂、红外分析分子键较多、甲基化分析糖苷键链接类型较多结果相一致。另外，均一银耳多糖与I2-KI反应呈阴性，说明不含淀粉。
5、将5mg实施例1得到的均一银耳多糖溶于2ml去离子水，后加入2ml 80μmol/L的刚果红试剂，逐渐加入4mol/L的NaOH溶液，使反应液中的碱浓度为0～0.5mol/L，用400～600nm进行紫外扫普，测出各碱性条件下的最大吸收波长。
如图9所示，随着NaOH的浓度升高，刚果红与均一银耳多糖形成的络合物的最大吸收波长相应增大，即最大吸收波长同刚果红相比发生相对位移，且刚果红与均一银耳多糖形成的络合物颜色加深，变为紫红色，说明均一银耳多糖具有三螺旋结构。
试验例4：本发明均一银耳多糖抗氧化活性
1、DPPH自由基清除活性
DPPH是一种稳定的自由基，可以与抗氧化剂反应，DPPH溶液的褪色程度反映了抗氧化化合物的清除能力。银耳多糖的DPPH自由基清除能力如图10所示。由图10中A可知，随着样品浓度的增大，三种银耳多糖的DPPH自由基清除能力也随着增强。其中，粗多糖表现出最强的DPPH自由基清除活性，其IC50值为1.63mg/ml(图10中B)。均一多糖和过柱多糖(TP1)的DPPH自由基清除活性次之，它们的IC50值分别为5.73mg/ml，6.39mg/ml，二者间无显著性差异(p>0.05)。虽然三种银耳多糖的IC50值均显著高于VC(IC50值＝0.0050mg/ml)和BHT(IC50值＝0.051mg/ml)两种阳性对照组，但与同类型的真菌多糖相比它们仍显示出较好的DPPH自由基清除能力。
2、ABTS自由基清除活性
ABTS的测定涉及氢电子转移，其原理是氧化剂将ABTS转化为绿色ABTS·+。与DPPH自由基清除活性类似，如图11所示，三种银耳多糖的ABTS自由基清除能力呈浓度梯度依赖性增强(图11中A)。同样地，粗多糖仍显示出最强的ABTS自由基清除活性(IC50值＝2.66mg/ml)，过柱多糖(TP1)活性(IC50值＝7.31mg/ml)最差，均一多糖活性在二者之间(IC50值＝6.43mg/ml)。三种银耳多糖的ABTS自由基清除活性仍显著低于阳性对照组VC和BHT，但阳性对照组间的ABTS自由基清除活性无显著性差异(p>0.05)，它们的IC50值分别是0.011mg/ml，0.013mg/ml。
3、总抗氧化活性
当FRAP在酸性条件下添加抗氧化剂时，Fe3+-TPTZ会被还原，并产生蓝紫色的Fe2+-TPTZ，可在593nm处检测到。图12中A为FeSO4的标准曲线，图12中B为各样品的总抗氧化值(FRAP值)。三种多糖的FRAP值由大到小分别是，粗多糖31.19μg FeSO4/mg TP、精多糖15.11μg FeSO4/mg TP、过柱多糖7.53μg FeSO4/mg TP。显然，粗多糖具有最强的总抗氧化能力，均一多糖和过柱多糖略弱。但总体而言，三种银耳多糖的FRAP值依旧显著低于阳性对照组VC(5166.33μg FeSO4/mg TP)和BHT(3950.67μg FeSO4/mg TP)。
综上可知，表明，通过采用本发明方法即可制备均一银耳多糖，不使用柱层析分离，也能达到柱层析分离的抗氧化活性，同时也说明通过本发明方法能够获得高抗氧化活性的均一银耳多糖。
试验例5：本发明均一银耳多糖对酪氨酸酶和弹性蛋白酶的抑制活性
1、酪氨酸酶活性的抑制能力
酪氨酸酶，又称多酚氧化酶，是黑色素合成的关键酶，能催化酪氨酸羟基化为醌类，醌类物质再经过一系列反应转化为黑色素。如果机体内酪氨酸酶活性较高，会加快黑色素的生成和沉积，使皮肤变黑。因此，抑制酪氨酸酶活性可以达到护肤美白的效果。银耳多糖对酪氨酸酶活性的抑制作用见图13，银耳多糖在一定范围内对酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用。随着银耳粗多糖和均一多糖浓度的升高，它们对酪氨酸酶的抑制率增强。但当过柱多糖浓度达到8mg/ml时，抑制率达到最高(36.97％)，之后随着多糖浓度增大，抑制率有下降趋势。当银耳粗多糖浓度为7.40mg/ml时，达到其对酪氨酸酶活性的半抑制浓度，是三种银耳多糖中，对酪氨酸酶活性抑制最强的。而银耳均一多糖对酪氨酸酶活性抑制能力次之，其半抑制浓度为9.15mg/ml。与阳性对照组曲酸(IC50值＝0.081mg/ml)相比，银耳多糖对酪氨酸酶活性的抑制能力较低，但与同类型的糖类相比，银耳多糖仍对酪氨酸酶活性具有较好的抑制作用。
2、弹性蛋白酶的抑制活性
弹性蛋白酶具有降解胶原蛋白、弹性蛋白等多种蛋白质的能力。皮肤组织中的弹性蛋白被弹性蛋白酶降解与皮肤衰老发生过程密切相关，因此对抗弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解，恢复皮肤弹性是延缓皮肤衰老的重要途径之一。从图14中A可见，所有样品均与弹性蛋白酶抑制活性呈剂量依赖性。其中，粗多糖显示出最强的弹性蛋白酶抑制活性，IC50值为0.10mg/ml，其效果略低于阳性对照组表没食子儿茶素没食子酸酯(IC50值＝0.049mg/ml)。均一多糖的活性次之(IC50值＝0.26mg/ml)，过柱多糖活性最低(IC50值＝3.55mg/ml)。
试验例6：本发明均一银耳多糖吸湿和保湿活性
1、银耳多糖的吸湿活性
银耳多糖的体外吸湿活性如图15所示。在0-72h的时间范围内，随着时间的延长，干燥的银耳多糖吸湿率在逐渐增加，说明银耳多糖具有吸湿能力。在0-8h内，吸水量增加最快，粗多糖、均一多糖、过柱多糖的吸湿率依次为：5.87％，8.93％，8.17％。12h后银耳多糖吸水量趋于饱和，吸水率的增加变缓，在72h时，达到最大值，粗多糖、均一多糖、过柱多糖的吸湿率依次为：9.10％，12.47％，12.70％。同时，我们以海藻糖作为阳性对照组，其也是当下用于护肤品保湿较为热门的原料之一。海藻糖在0-72h内的吸湿效果低于三种银耳多糖，其在6h和72h的吸湿率分别为5.07％和7.50％。综上说明本发明实施例1得到的均一银耳多糖具有较好的吸湿能力。
2、银耳多糖的保湿活性
银耳多糖的体外保湿活性如图16所示。在0-72h范围内，随着时间的增加，银耳多糖的水分含量逐渐减少。在0-36h间，三种银耳多糖均显示出较强的保湿活性。尤其是36h时，均一多糖(61.38％)和过柱多糖(63.80％)的保湿率强于海藻糖(55.16％)，且此时粗多糖的保湿率为55.54％，其与海藻糖几乎无差别。且在48h时，60h时，均一多糖，过柱多糖的保湿率也都高于海藻糖。所以，本发明实施例1得到的均一银耳多糖具有较好的吸湿和保湿活性，具有用于护肤保湿产品的潜在开发利用价值。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (10)
1.一种均一银耳多糖的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)将干银耳进行粉碎，过筛，得到银耳干粉；
(2)将银耳干粉与蒸馏水混合，加热至沸腾状态，提取，冷却至室温后，离心分离，取上清液；
(3)将上清液浓缩，得到浓缩液；
(4)向浓缩液中加入乙醇溶液，搅拌8-12min，析出的沉淀，得到银耳粗多糖，将银耳粗多糖置于2-6℃环境中静置10-14h后取出沉淀，冻干备用；
(5)将步骤(4)得到的冻干银耳粗多糖用超纯水复溶，得到多糖溶液，向多糖溶液中滴加其重量10％的质量分数为10％的ATC溶液，调节多糖溶液pH值至2.3-2.7，置于2-6℃环境中静置12-14h后，离心分离，得到银耳多糖溶液；
(6)向步骤(5)得到的银耳多糖溶液加入大孔树脂，搅拌，抽滤，所得溶液即为脱色的银耳多糖溶液；
(7)将步骤(6)得到的银耳多糖溶液，置于截留分子量为8000-14000Da的透析袋中；
(8)将步骤(7)透析后的袋内银耳多糖溶液，浓缩，冷冻干燥，得到均一银耳多糖。
2.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，粉碎后的银耳过60目筛。
3.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将银耳干粉与蒸馏水按1mg:60ml的比例于沸水中提取2h。
4.如权利要求3所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)重复2次，合并上清液并且抽滤。
5.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，浓缩上清液至原体积的1/10。
6.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，浓缩液与乙醇溶液的体积比为1:4，所述乙醇溶液的体积浓度为95％。
7.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中，将步骤(4)得到的银耳粗多糖用超纯水复溶体积浓度为5mg/ml的多糖溶液。
8.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中，向步骤(5)得到的冻干银耳多糖溶液中加入其1/4体积的大孔树脂，以2500r/min的转速搅拌2h。
9.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中，透析袋每6h换一次水，透析72h。
10.如权利要求1所述的均一银耳多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(8)中，浓缩透析后的银耳多糖溶液至原体积的1/10。
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