CN111607629B - 一种莲子活性多糖、莲子活性物质及其提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及莲子活性物质提取技术领域，尤其涉及一种莲子活性多糖、莲子活性物质及其提取方法和应用。将莲子依次经过内肽酶和端肽酶复合酶的第一次酶解和胰蛋白酶的第二次酶解，酶解后过滤得到酶解液；将酶解液经过一次以上离心醇析得到莲子活性物质。其可以通过简单的方法和较低的成本将糖蛋白分离出莲子多糖和莲子蛋白，并保持其活性，更为重要的是可以实现产业化发展；莲子活性物质，其包括高活性和高纯度的莲子多糖和莲子蛋白，其具有较强的抗氧化、抗菌以及益生元功能；可以在益生元及抗氧化制品中应用。

Description

一种莲子活性多糖、莲子活性物质及其提取方法和应用
技术领域
本发明涉及莲子活性物质提取技术领域，尤其涉及一种莲子活性多糖、莲子活性物质及其提取方法和应用。
背景技术
农产品含有丰富的功能成分，天然有效成分提取与利用已发展成为全球农产品精深加工的重要方向，是提升农产品附加值和扩大产品应用范围的主要途径。莲子是一种高级滋补食品，深受国内外消费者喜爱。建宁莲子已成为福建省建宁等地特色和农民致富的支柱产业。但目前莲子原料利用率不高、产品结构单一、加工技术较陈旧、产业结构不合理及加工技术缺乏等问题依然突出，严重制约了特色农产品加工产业的可持续发展。植物来源的天然多糖作为一类重要的天然活性物质，近年来在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、抗溃疡、降血糖等方面显示出了较大的开发潜力和诱人的产业前景。
多糖可采用多种方式(包括乙醇分级醇沉、膜分离、柱层析等)进行组分分离。
发明专利(201810016008.5)提供了从桑椹中获得的一种含半乳糖醛酸聚糖的蛋白多糖的方法，采用水提、酶解(纤维素酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶)、透析、离心、醇沉、阴离子纯化、凝胶柱分离。尽管柱层析具有较高的分离效能，但凝胶柱价格昂贵，通常应用在实验室中制备少量的纯品，不适合在工业上大规模使用，且所采用的纤维素酶、木瓜蛋白酶、淀粉酶针对性不强，导致原料浪费，提取率低。
膜分离操作目前多采用如发明专利一种超声波耦合膜分离分级制备不同分子量枸杞多糖的方法(201610476325.6)采用不同分子量的膜分离分级纯化，但多级膜分离操作操作较为繁琐。如乙醇分级醇沉方式分离多糖已有应用，如发明专利肿节风浸膏残渣多糖、其制备方法及用途(201710135706.2)和发明专利一种不同生物活性香菇多糖的制备方法(201910646558.X)使用30％、60％和90％、20％、50％和70％浓度的乙醇对原料多糖进行分级处理，但针对性不强。
莲子多糖是莲子中重要的功能成分，特别是与蛋白质呈紧密结合态的多糖的提取，其仍是一个难题。莲子中蛋白质含量较高，约为17％，因此本专利采用适度低温水解法提高莲子多糖的纯度和生物活性，同时有利于莲子蛋白质等营养产物的深度开发利用。其中已发现的一种莲子多糖中多糖与蛋白质呈紧密结合态，是一种糖蛋白，其中蛋白质含量为39.29％，多糖含量为37.78％。
现有技术中对于莲子活性物质的提取，目前关于莲子多糖提取的研究，均在纯化技术阶段；其研究成果由于步骤的繁琐，所用分离纯化材料的昂贵均只能停留在实验研究阶段，无法实际应用于产业化，无法完成研究成果的转化。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种莲子活性物质的提取方法，其可以通过简单的方法和较低的成本将糖蛋白分离出莲子多糖和莲子蛋白，并保持其活性，更为重要的是可以实现产业化发展；
相应的，本发明还提供一种上述提取方法提取得到的莲子活性物质，其包括高活性和高纯度的莲子多糖和莲子蛋白，其具有较强的抗氧化、抗菌以及益生元功能；
相应的，本发明还提供一种莲子活性多糖，其具有较强的抗氧化、抗菌以及益生元功能。
相应的，本发明还提供一种莲子活性物质在益生元及抗氧化制品中的应用。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种莲子活性物质的提取方法，其包括以下依次进行的步骤：S1包括：将莲子依次经过内肽酶和端肽酶复合酶的第一次酶解和胰蛋白酶的第二次酶解，酶解后过滤得到酶解液；S2包括：将酶解液经过一次以上离心醇析得到莲子活性物质。
进一步的，步骤S1中还包括酶解前莲子的处理：将莲子加水打浆后在4℃以下的条件下静置沉淀6～10h得到莲子料液。
进一步的，第一次酶解的pH值至5.8～6.2，复合酶的加酶量为280～320U/g，酶解温度为55～60℃，酶解时间为360～390min；
或/和
第二次酶解的加酶量为800～900U/g，酶解时间为30～40min。
进一步的，步骤S2包括第一次离心醇析：使酶解液中乙醇的浓度为35～38％，离心后得第一上清液和第一沉淀。
进一步的，步骤S2还包括第二次离心醇析：使第一上清液的乙醇浓度为52～55％，离心后得第二上清液和第二沉淀。
进一步的，步骤S2还包括第三次离心醇析：使第二上清液的乙醇浓度为78～80％，离心后得第三上清液和第三沉淀。
本发明还提供上述任一项莲子活性物质的提取方法，其还包括步骤S3，将一次以上离心醇析得到的沉淀分别进行切向流超滤，超滤膜截留分子量为1KD。
本发明还提供上述任一项莲子活性物质的提取方法提取得到的莲子活性物质。
本发明还提供上述莲子活性物质在益生元及抗氧化制品中的应用。
本发明还提供一种莲子活性多糖，其主要由按摩尔比为18.25:74.46:2.38:4.91的半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成的聚合糖。
莲子活性多糖的结构为→6-Glc-1→为主链，而在C3位有→3-Glc-1→支链取代的链接方式，其13CNMR谱的主要信号值与图7所示的13CNMR谱基本一致。
(三)有益效果
与现有技术对比，
1.本发明使用特异性内肽酶和端肽酶进行定向水解，使莲子中的多聚糖蛋白中的多聚糖和蛋白质分离；胰蛋白酶二次水解，使蛋白质进一步水解，便于通过醇析方法分离得到高活性的蛋白质和多糖。本发明制备方法所使用的设备简单，方法步骤容易实施，同时得到高纯度和高活性的莲子蛋白和多糖，提高原料的利用率，间接降低成本可实现产业化大规模生产。具体的本发明莲子多糖的制备未进行脱色、脱蛋白处理，没有进行多糖的柱分离纯化，从而得到的高纯度的莲子多糖组分，避免多糖的柱分离纯化过程导致的多糖损失，此外节省柱层析的大量费用开销、繁琐的操作步骤和较低的得率。
2.本发明得到的莲子多糖粉中组分纯度较高、结构明确、质量可控，在体外抗氧化试验及双歧杆菌生长试验中具有抗氧化活性和增殖活性，且其本身糖苷键具有一般多糖益生元的结构，具有潜在益生元潜力，可用于在食品、医药、保健品等领域的应用。
3.本发明的提取方法简单，易于操作，适合大规模生产，能实现特定莲子多糖组分的分离，且所得低聚糖单体具有益生元和抗氧化效应。本发明可填补国内高纯度莲子多糖单一组分生产方式的空白，为莲子多糖及其他营养成分的充分开发利用提供基础，有助于提升莲子产业价值，拓展莲子深加工副产物利用的有效途径，同时也可为其他天然多糖的高纯度生产提供新的方向。
附图说明
图1为莲子多糖DEAE-FAST-FLOW洗脱曲线；
图2为LSPS2的葡聚糖凝胶洗脱曲线；
图3为LSPS2各组分的高效液相色谱测试结果；
图4为不同乙醇浓度的溶液得到的醇析物的抗氧化活性与双歧杆菌增菌能力；
图5为不同醇析物处理下下双歧杆菌生长共聚焦显微镜图片；
图6为莲子活性多糖产品的IR谱图；
图7为莲子活性多糖的特征13CNMR图谱；
图8为莲子活性多糖产品的特征1HNMR图谱。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
【实施方式一】
本发明提供一种莲子活性物质的提取方法，其包括以下依次进行的步骤：S1包括：将莲子依次经过内肽酶和端肽酶复合酶的第一次酶解和胰蛋白酶的第二次酶解，酶解后过滤得到酶解液；S2包括：将酶解液经过一次以上离心醇析得到莲子活性物质。
本发明使用特异性内肽酶和端肽酶定向水解，水解蛋白质颗粒与多聚糖紧密相连的核心连接部分，使莲子中的多聚糖蛋白中的多聚糖和蛋白质分离，第一次酶解为慢反应；在蛋白质颗粒紧密相连部分经第一次酶解使其变成松散状态下，使用胰蛋白酶第二次酶解，与莲子蛋白质颗粒松散外围部分的特定肽段作用位点快速结合，实现快反应，进一步使蛋白质水解成多肽，便于离心醇析阶段同时分离得到高活性的蛋白、多肽和多糖。
本实施方式实现了莲子中蛋白、多肽和多糖的同时分离，提高原料的利用率，所得到的蛋白、多肽和多糖具有很强的抗氧化活性和益生元功能。
本实施方式的方法简单，易于操作，适合大规模生产，能实现特定莲子多糖组分的分离，且所得低聚糖单体具有益生元和抗氧化效应。本发明可填补国内叫高纯度莲子多糖单一组分生产方式的空白，为莲子多糖及其他营养成分的充分开发利用提供基础，有助于提升莲子产业价值，拓展莲子深加工副产物利用的有效途径，同时也可为其他天然多糖的高纯度生产提供新的方向。
为提高第一次酶解的效率，并能使蛋白的分离更为彻底，进一步的，第一次酶解的pH值至5.8～6.2，复合酶的加酶量为280～320U/g，酶解温度为55～60℃，酶解时间为360～390min；
或/和
第二次酶解的加酶量为800～900U/g，酶解时间为30～40min。
本实施方式中，第二次酶解加酶量和酶解时间的限制，其目的在于，在形成小分子肽段前停止反应，避免蛋白质的过度水解造成浪费和大量游离氨基酸的形成，有利于莲子蛋白粉的生产。其中，加酶量U/g表示每g莲子干粉所加入的酶活单位。
进一步的，步骤S1中还包括酶解前莲子的处理：将莲子加水打浆后在4℃以下的条件下静置沉淀6～10h得到莲子料液。
相对于传统高温度水浴提取多糖方式，会降低多糖功能价值及纯度，本实施方式制备过程，采用低温有助于避免在提取过程中多糖的氧化反应及与其他物质发生聚合作用进而保持了莲子多糖和蛋白、多肽较高的纯度和较好的抗氧化活性。
进一步的，本发明的莲子的处理还包括，
1.选料烘干：选取颗粒饱满、无损伤的新鲜莲子，筛选去芯后于40～45℃下烘至水分含量小于11～13％；
2.粉碎过筛：称取烘干的莲子于粉碎机中粉碎，过30～40目筛，得莲子粉；
3.加水复配：取所得莲子粉末于锥形瓶中，按料液比1:9～1:10加入去离子水混匀搅拌得复配料；
4.水洗淀粉：将所得复配料液使用打浆机打浆4～5min，并用莲子渣重量4～6倍的去离子水冲洗滤渣，合并滤液后置于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除沉淀为莲子淀粉，再将所得上清液与冲洗后的莲子滤渣合并搅拌，加入0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；
本发明通过构建生物技术与现代食品工程技术相结合的莲子多糖及副产物的高效提取集成技术，生产过程中同时提取了莲子多糖、莲子淀粉、莲子蛋白、莲子低聚肽，使每个步骤充分得到应用，极大程度地简化生产工艺。此外在每步醇沉沉降之前，先对溶液进行离心分离除去莲子多酚、黄酮等小分子醇溶物，避免了杂质带入莲子多糖和蛋白中，保证了产品的纯度，同时乙醇也可使溶液中的酶失活。
进一步的，步骤S2包括第一次离心醇析：使酶解液中乙醇的浓度为35～38％，离心后得第一上清液和第一沉淀。
具体的，将所得酶解液冷却至室温，4000r/min转速下离心20min得滤液，加无水乙醇，使酶解液的乙醇浓度达到35～38％，4000r/min转速下离心20min得第一上清液和第一沉淀；将所得第一沉淀经分离得到莲子蛋白。
进一步的，步骤S2还包括第二次离心醇析：使第一上清液的乙醇浓度为52～55％，离心后得第二上清液和第二沉淀。具体的使用无水乙醇加入到第一上清液中调节乙醇的浓度，并在转速4000r/min下，离心20min。将所得第二沉淀经分离得到莲子多糖。
进一步的，步骤S2还包括第三次离心醇析：使第二上清液的乙醇浓度为78～80％，离心后得第三上清液和第三沉淀。具体的使用无水乙醇加入到第二上清液中调节乙醇的浓度，并在转速4000r/min下，离心20min。将所得第三沉淀经分离得到莲子蛋白；第三上清液即为莲子低聚肽。
本实施方式通过分级离心醇析，第一次离心醇析，一方面还在于使酶酶活，另一方面在于析出莲子蛋白；第二次和第三次的离心醇析在于得到莲子多糖和莲子低聚肽。
本发明莲子多糖的制备工艺未进行脱色、脱蛋白处理，没有进行多糖的柱分离纯化，从而得到高纯度的莲子多糖，避免多糖的柱分离纯化过程导致的多糖损失，此外节省柱层析的大量费用开销、繁琐的操作步骤和较低的得率。本实施方式通过高通量分级醇沉分离莲子多糖及副产物的集成技术，形成具有连续、高效、定向的不同分子量的多糖及水解蛋白制备新工艺，实现多通道平行分离提纯莲子多糖组分及水解蛋白并行的技术手段，通过特定精确的乙醇浓度实现某种莲子多糖和蛋白组分从原料中的高纯度分离。莲子多糖及莲子蛋白通过分级醇沉不同的乙醇浓度被醇沉成多组，更有助于选择抗氧化、肠道菌群作用具有效果的组分，避免传统醇析步骤没有针对性的问题。
进一步的，其还包括步骤S3，将一次以上离心醇析得到的沉淀分别进行切向流超滤，超滤膜截留分子量为1KD。
具体的是将第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别加入去离子水配置成35％浓度的溶液，分别进行切向流超滤；超滤方式为等体积超滤并添加室温注射用水，超滤加水的倍数为4～5倍；流超滤膜包材料为三醋酸纤维素膜，截留分子量为1KD。
第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀经过切向流超滤分别得到第一溶液、第二溶液和第三溶液。本发明采用切向流超滤技术对醇析出的不同分子量的多糖和其他小分进行进一步提纯，可避免多糖或在蛋白质在传统超滤膜技术分离后出现分子量降低和团聚的现象。
进一步的，还包括冷冻干燥的步骤：将所得第一溶液、第二溶液和第三溶液分别用去离子水稀释后冷冻干燥，分别得莲子蛋白粉、莲子多糖粉和莲子蛋白粉。第三上清液经冷冻干燥得到莲子低聚肽粉。
【实施方式二】
本实施方式还提供实施方式一中莲子活性物质的提取方法提取得到的莲子活性物质。分别为莲子蛋白粉、莲子多糖粉和莲子低聚肽粉。
莲子多糖粉中总固体重量的85％以上；重均分子量为3.058×104Da；莲子多糖为单糖组成包括半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，摩尔比为18.25:74.46:2.38:4.91；莲子多糖其红外特征图谱的主要伸缩振动吸收峰与图6所示的红外图特征图谱中的基本一致。
莲子多糖的结构为→6-Glc-1→为主链，而在C3位有→3-Glc-1→支链取代的链接方式，其13C NMR谱的主要信号值与图7所示的13C NMR谱基本一致。
莲子多糖粉中，组分纯度较高、结构较为明确、质量可控，在体外抗氧化试验及双歧杆菌生长试验中具有抗氧化活性和增殖活性，且其本身糖苷键具有一般多糖益生元的结构，具有潜在益生元潜力，可在食品、医药、保健品等领域的应用。
【实施方式三】
本实施方式还提供上述莲子活性物质在益生元及抗氧化制品中的应用。
为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
S1莲子粉制备
S11选料烘干：选取颗粒饱满、无损伤的新鲜莲子，筛选去芯后于45℃下烘至水分含量小于13％；
S12粉碎过筛：称所得莲子于粉碎机中粉碎，过40目筛，得莲子粉末；
S2莲子料液配制：
S21加水复配：将所得莲子粉末于锥形瓶中，按料液比1:10加入去离子水混匀搅拌，得到复配液；
S22水洗淀粉：将所得复配液使用打浆机打浆5min，并用莲子渣重量4倍的去离子水冲洗滤渣，合并滤液后置于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除沉淀为莲子淀粉，再将所得上清液与冲洗后的莲子滤渣合并搅拌，加入0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，得到料液；
S3第一次酶解：将所得的料液使用醋酸调节pH值至6.0，并加入按质量比为1:1.5的内肽酶和端肽酶组成的复合酶，加酶量为300U/g，置于恒温水浴锅中，调节料液的温度为60℃，充分搅拌酶解390min，得到第一次酶解液；
S4第二次酶解：将所得的第一次酶解液加入胰蛋白酶进行第二次分酶解，加酶量为900U/g，充分搅拌酶解30min得到第二次酶解液；
S5离心醇析：
S51第一次离心醇析将所得第二次所得酶解液冷却至室温，进行离心转速为4000r/min，离心时间为20min，得到滤液，加无水乙醇，使酶解液的乙醇浓度达到36％，转速4000r/min下离心20min后得第一上清液和第一沉淀；
S52第二次离心醇析：将所得第一上清液继续加无水乙醇，使第一上清液的乙醇浓度达到54％，转速4000r/min下，离心20min后后得第二上清液和第二沉淀；
S53第三次离心醇析
将所得第二上清液继续加无水乙醇，使第二上清液的乙醇浓度达到80％，转速4000r/min下，离心20min后得第三上清液和第三沉淀。
S6切向流超滤
将第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别加入去离子水配置成35％浓度的溶液，分别进行切向流超滤；超滤方式为等体积超滤并添加室温注射用水，超滤加水的倍数为5倍；流超滤膜包材料为三醋酸纤维素膜，截留分子量为1KD。第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别经过切向流超滤得到第一溶液、第二溶液和第三溶液。
S7冷冻干燥：
将所得第一溶液、第二溶液和第三溶液分别用去离子水稀释后冷冻干燥，分别得莲子蛋白粉、莲子多糖粉和莲子蛋白粉。第三上清液经冷冻干燥得到莲子低聚肽粉。
实施例2
S1莲子粉制备
S11选料烘干：选取颗粒饱满、无损伤的新鲜莲子，筛选去芯后于43℃下烘至水分含量小于12％；
S12)粉碎过筛：称所得莲子于粉碎机中粉碎，过40目筛，得莲子粉末；
S2莲子料液配制：
S21加水复配：将所得莲子粉末于锥形瓶中，按料液比1:10加入去离子水混匀搅拌，得到复配液；
S22水洗淀粉：将所得复配液使用打浆机打浆4.5min，并用莲子渣重量6倍的去离子水冲洗滤渣，合并滤液后置于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除沉淀为莲子淀粉，再将所得上清液与冲洗后的莲子滤渣合并搅拌，加入0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，得到料液；
S3第一次酶解：将所得的料液使用醋酸调节pH值至5.8，并加入按质量比为1:1.5的内肽酶和端肽酶组成的复合酶，加酶量为280U/g，置于恒温水浴锅中，调节料液的温度为58℃，充分搅拌酶解370min，得到第一次酶解液；
S4第二次酶解：将所得的第一次酶解液加入胰蛋白酶进行第二次分酶解，加酶量为850U/g，充分搅拌酶解40min得到第二次酶解液；
S5离心醇析：
S51第一次离心醇析将所得第二次所得酶解液冷却至室温，进行离心转速为4000r/min，离心时间为20min，得到滤液，加无水乙醇，使酶解液的乙醇浓度达到38％，转速4000r/min下离心20min后得第一上清液和第一沉淀；
S52第二次离心醇析：将所得第一上清液继续加无水乙醇，使第一上清液的乙醇浓度达到52％，转速4000r/min下，离心20min后后得第二上清液和第二沉淀；
S53第三次离心醇析
将所得第二上清液继续加无水乙醇，使第二上清液的乙醇浓度达到79％，转速4000r/min下，离心20min后得第三上清液和第三沉淀。
S6切向流超滤
将第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别加入去离子水配置成35％浓度的溶液，分别进行切向流超滤；超滤方式为等体积超滤并添加室温注射用水，超滤加水的倍数为5倍；流超滤膜包材料为三醋酸纤维素膜，截留分子量为1KD。第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别经过切向流超滤得到第一溶液、第二溶液和第三溶液。
S7冷冻干燥：
将所得第一溶液、第二溶液和第三溶液分别用去离子水稀释后冷冻干燥，分别得莲子蛋白粉、莲子多糖粉和莲子蛋白粉。第三上清液经冷冻干燥得到莲子低聚肽粉。
实施例3
S1莲子粉制备
S11选料烘干：选取颗粒饱满、无损伤的新鲜莲子，筛选去芯后于40℃下烘至水分含量小于11％；
S12粉碎过筛：称所得莲子于粉碎机中粉碎，过30目筛，得莲子粉末；
S2莲子料液配制：
S21加水复配：将所得莲子粉末于锥形瓶中，按料液比1:9加入去离子水混匀搅拌，得到复配液；
S22水洗淀粉：将所得复配液使用打浆机打浆4min，并用莲子渣重量5倍的去离子水冲洗滤渣，合并滤液后置于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除沉淀为莲子淀粉，再将所得上清液与冲洗后的莲子滤渣合并搅拌，加入0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液，得到料液；
S3第一次酶解：将所得的料液使用醋酸调节pH值至6.2，并加入按质量比为1:1.5的内肽酶和端肽酶组成的复合酶，加酶量为320U/g，置于恒温水浴锅中，调节料液的温度为55℃，充分搅拌酶解360min，得到第一次酶解液；
S4第二次酶解：将所得的第一次酶解液加入胰蛋白酶进行第二次分酶解，加酶量为800U/g，充分搅拌酶解35min得到第二次酶解液；
S5离心醇析：
S51第一次离心醇析将所得第二次所得酶解液冷却至室温，进行离心转速为4000r/min，离心时间为20min，得到滤液，加无水乙醇，使酶解液的乙醇浓度达到38％，转速4000r/min下离心20min后得第一上清液和第一沉淀；
S52第二次离心醇析：将所得第一上清液继续加无水乙醇，使第一上清液的乙醇浓度达到55％，转速4000r/min下，离心20min后后得第二上清液和第二沉淀；
S53第三次离心醇析
将所得第二上清液继续加无水乙醇，使第二上清液的乙醇浓度达到78～80％，转速4000r/min下，离心20min后得第三上清液和第三沉淀。
S6切向流超滤
将第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别加入去离子水配置成35％浓度的溶液，分别进行切向流超滤；超滤方式为等体积超滤并添加室温注射用水，超滤加水的倍数为4倍；流超滤膜包材料为三醋酸纤维素膜，截留分子量为1KD。第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别经过切向流超滤得到第一溶液、第二溶液和第三溶液。
S7冷冻干燥：
将所得第一溶液、第二溶液和第三溶液分别用去离子水稀释后冷冻干燥，分别得莲子蛋白粉、莲子多糖粉和莲子蛋白粉。第三上清液经冷冻干燥得到莲子低聚肽粉。
实施例4阴离子交换分级纯化莲子多糖
阴离子交换柱层析：称取2g实施例1步骤S22中得到的料液，依次经90℃热水浸提和Sevag法脱蛋白后并加入3倍乙醇获得莲子粗多糖，将所得莲子粗多糖溶解于10mL蒸馏水中，完全溶解后，离心(12000r，10min)除去少量不溶物，待上样；DEAE柱(50*500mm)蒸馏水平衡过夜；分别使用蒸馏水、0.2mol/mL氯化钠溶液、0.5mol/mL氯化钠溶液、1.0mol/mL氯化钠溶液对样品进行洗脱，把洗脱液用自动收集器收集起来(流速1mL/min，每管2mL)，苯酚硫酸法跟踪监测，将OD490nm吸光值对吸脱管绘图。根据洗脱曲线图，收集位于吸收峰中间部分的多糖，经过旋转蒸发(65℃)，使用3500Da透析袋进行透析，并冷冻干燥，得到干燥莲子多糖粉末。
如图1所示DEAE-FAST-FLOW洗脱曲线，试验中分别由蒸馏水、0.2mol/mL氯化钠溶液、0.5mol/mL氯化钠溶液、1.0mol/mL氯化钠溶液进行分段洗脱，得到2种组分，分别命名为LSPS1和LSPS2。LSPS2组分含量最高，且LSPS1经过透析后没有组分，可能为二糖或单糖；收集多糖组分LSPS2冻干成LSPS2粉末。
实施例5莲子多糖的凝胶柱分级纯化
葡萄糖凝胶柱层析：将实施例4得到的LSPS2粉末加入蒸馏水中，制备50mg/mL溶液。离心(12000r，10min)除去少量不溶物，待上样；葡萄糖凝胶柱层析对样品进行进一步纯化分离，手动进样，用沪西纯化系统。蒸馏水洗脱，把洗脱液用自动收集器收集起来(流速0.5mL/min，每管4mL)，苯酚硫酸法在线跟踪监测，以OD490nm吸光值对吸脱管作图。根据检测结果，收集图中的对称峰，并重复过柱收集单峰，经过旋转蒸发(65℃)，采用3500Da透析袋进行透析，冷冻干燥，得到莲子多糖粉末。由图2可知，LSPS2通过葡萄糖凝胶柱层析分离，得到3个组分，分别命名为LSPS2-1、LSPS2-2和LSPS2-3，并分别冻干得到冻干粉。
实施例6莲子多糖组分组成与相对分子质量
将实施例5获得的LSPS2-1、LSPS2-2和LSPS2-3冻干粉，通过HPGPC分析仪器分析：高效液相色谱仪(waters515+2414示差检测器)，对莲子多糖样品进行测定。样品浓度及进样量(2mg/mL,20μL)；色谱条件：色谱柱Waters Ultra-hydrogel 250、1000和2000凝胶柱(7.8×300mm)串联柱；流动相：20mM CH3COONH4，流速0.5mL/min；柱温箱40℃。以相对分子质量不同的葡聚糖当作标准品，制作标准曲线，得到lgMw-RT校正曲线。得出方程为：y＝-0.1741x+11.505(R2＝0.9913)，其中y是样品和的平均分子量的对数，x是样品的保留时间；结果如表1和图2所示。
表1 LSPS2的各组分分子量
Figure BDA0002525321810000151
由表1和图3可得，LSPS2-1和LSPS2-3为分子量相近的化合物，LSPS2-2分子量与另两个相比低一个数量级。表明莲子多糖主要由LSPS2-1、LSPS2-2和LSPS2-3三个组分组成，且LSPS2-2为莲子多糖的主要成分。
实施例7
莲子多糖中的蛋白含量：实施例1的步骤S22中得到的上清液过Superdex 75凝胶柱，苯酚硫酸法收集含糖组分，组分的蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。
在室温条件，实施例1以及，将实施例1中步骤S3和步骤S4中分别采用下列不同酶替换处理后分别得到莲子多糖粉，并分别将莲子莲子多糖粉溶于水，依次釆用膜分离设备并使用截留分子量为10KD、30KD和100KD的二级超滤膜对莲子提取产物进行膜分离分级，过膜前的料液浓度为10mg/mL，收集不同膜分离段的分离产物。分离的产物进行冷冻干燥处理后称重，莲子组分质量占比＝冷冻干燥后收集的分离组分质量/膜分离各组分的样品总质量。
表2不同酶解处理后莲子组分质量占比变化
Figure BDA0002525321810000161
由表2可得，不加酶是代表莲子的大分子提取物主要集中于10～30KD分子量段，剩余分子量的大分子可能主要由蛋白质组成。单独胰蛋白酶作用时，胰蛋白酶水解莲子蛋白质颗粒松散的外围部分，由于胰蛋白酶由于短时位阻作用导致对此部分蛋白质作用较差。混合肽酶处理时30～100KD得到较好的保持，表明LSPS2-2除外的蛋白组分水解较少，表明混合肽酶对LSPS2-2存在特异性水解。实施例1实现莲子多肽快速生成，所形成水解产物分子量集中于10～30KD，可能由莲子蛋白质与莲子多糖类物质组成。当实施例1水解时间继续延长后，胰蛋白酶和混合肽酶继续对莲子提取物深度水解，导致大量小肽物质形成，使大量组分分子量集中于10KD以下，因此选用实施例1的酶解条件可较好地保持提高多糖的纯度，且莲子蛋白质也可较好地保留。
实施例8
采用苯酚硫酸法测定实施例1获得的莲子多糖粉中莲子多糖的含量，含量(％)为多糖质量与酶解物干重的比值。各部分得率为各部分收集好的冻干粉质量/原料干重。
将实施例1中步骤S51得到的滤液，加入无水乙醇和水，分别使溶液的乙醇浓度为0、36％、54％、80％进行分级醇沉处理，于4℃下静置12h，5000r/min下离心15min，收集沉淀，分别通过透析后冷冻干燥得到相应的4种莲子多糖粉，并将莲子多糖粉通过实施例6中的高效液相色谱法进行定量和换算LSPS2-1、LSPS2-2、LSPS2-3。莲子多糖各组分质量占比＝LSPS2-n的质量/LSPS2莲子多糖的总质量(n分别为1、2、3)。
表3分层醇沉处理后的多糖组分分布占比
Figure BDA0002525321810000171
由表3可知，在乙醇分级前水解物中的多糖含量较低，表明酶解物可能是由纯多糖、大分子莲子蛋白、水解蛋白、多肽构成的混合物。其中LSPS2-2为其主要构成成分。随着分级乙醇浓度的增加首先析出的LSPS2-1、LSPS2-3组分及部分LSPS2-2组分；表明54％的乙醇浓度有利于多糖的析出，此外有利于富集LSPS2-2组分；80％乙醇浓度有利于剩余蛋白产物的集中收集。经考马斯亮蓝法测试蛋白质含量，本实施例中36％、54％、80％的蛋白质分别为69.27％、12.99％、94.68％，表明乙醇分级虽可能在不同成分中混入一定量的莲子蛋白成分，但有助于特定莲子多糖组分的分离。将实施例1中第一沉淀物和第三沉淀物按质量比3:1进行混合调配后干燥得兼具抗氧化及益生元功效的莲子蛋白粉，经测试蛋白质含量可达到89.03％。
实施例9抗氧化性能及双歧杆菌增菌效能测定
双歧杆菌测定：取将实施例1取得的莲子多糖粉、莲子蛋白粉0.2g，置于带玻璃珠的无菌小瓶内，加入适量稀释液，然后将小瓶置于振荡器上充分振荡0.5min，使其均质化后以5％浓度加入双歧杆菌MRS培养基，37℃厌氧培养24h，培养后再依次进行适当稀释，以OD600nm进行菌悬液测定菌悬液的浓度。
还原能力测试：采用铁氰化钾法测定样品的还原能力。分别将1mL1mg/mL的实施例1取得的莲子多糖粉、莲子蛋白粉、莲子低聚肽粉溶液与1g/100mL铁氰化钾溶液、磷酸盐缓冲液(pH6.6)按体积比1:1:1混合，50℃水浴20min，加入2mL10g/100mL三氯乙酸溶液，3000r/min离心10min，取1mL上清液与等体积蒸馏水和0.2mL0.3g/100mL三氯化铁溶液混合，50℃水浴10min，OD700nm测定吸光度。样品本底以等体积蒸馏水代替三氯化铁溶液。
由图4表明，经过酶解处理后的抗氧化活性有较大的提高，使用的莲子低聚肽粉抗氧化活性最高，表明水解的小分子蛋白或低分子质量肽抗氧化活性优于其他组分。54％醇析物(第二沉淀得到的莲子多糖粉)大于36％醇析物(第一沉淀得到的莲子蛋白粉)，表明LSPS2-2的抗氧化性可能大于LSPS2-1、LSPS2-3和大分子蛋白质，同时LSPS2-2的抗氧化性相比于常规提取方法中90℃热水浸提的莲子醇析多糖抗氧化性高26％，可能是低温条件较好地保护了莲子多糖的抗氧化性。80％醇析物(第三沉淀得到的莲子蛋白粉)大于54％醇析物(第二沉淀得到的莲子多糖粉)，表明小分子蛋白的抗氧化性略大于多糖。莲子低聚肽粉可能由于莲子中的小分子的抑菌作用导致其双歧杆菌增长数量受到抑制，80％醇析物(第三沉淀得到的莲子蛋白粉)的菌体增长较低，可能由于莲子小分子蛋白也部分抑制菌体的生长。36％(第一沉淀得到的莲子蛋白粉)和54％醇析物(第二沉淀得到的莲子多糖粉)双歧杆菌菌体增长效果较好，表明莲子多糖和莲子蛋白联合培养或单一LSPS2-2培养具有较好地增菌作用，因此54％的醇析浓度具有较好的抗氧化和益生元效果。
实施例10双歧杆菌菌体增菌机制研究
将实施例1中步骤S51得到的滤液，加入无水乙醇和水，分别使溶液的乙醇浓度为0、36％、54％、80％进行分级醇沉处理，于4℃下静置12h，5000r/min下离心15min，收集沉淀，通过透析后冷冻干燥得到4种多糖样品。
莲子多糖的荧光标记：采用二月桂酸二丁基锡催化的FITC羟基标记法，将8mg四种莲子多糖样品分别溶解于0.016mL二甲基亚砜，加入0.016mL吡啶，0.821mg的二丁基二月桂酸锡。随后加入8.21mgFITC，95℃恒温水浴反应2h，反应完毕后将样品溶液过凝胶层析柱，收集并冷冻干燥后保存备用。莲子蛋白采用DAPI染色。样本制备方法：在直径100mm的培养皿内放入环氧乙烷灭菌的1×1cm聚苯乙烯塑料片，取双歧杆菌菌种母液(浓度为106～107CFU/mL)20mL于培养皿(包含0.5g/L的经过荧光标记LOS4溶液)，厌氧静置培养0、0.5、1、12、24h。同时设定空白对照，即将空白聚苯乙烯片放入细菌培养液中静置培养分别静置培养24h。荧光染液的封片：将上述样品标本取出，用无菌PBS溶液冲洗2次以去除片表面松散粘附的细菌。随后在黑暗环境下向样本上滴加1滴p-苯二胺抗荧光淬灭剂(包含90％甘油，10％PBS，其中p-苯二胺浓度为2mmol/L，pH＝8.5)及1滴无菌PBS后盖上盖玻片，4℃避光保存备用。将上述染色好的细菌培养标本倒置于激光共聚焦显微镜下观察。
图5中，A、B、C分别是36％醇析物(第一沉淀得到的莲子蛋白粉)、54％醇析物(第二沉淀得到的莲子多糖粉)、80％醇析物80％醇析物(第三沉淀得到的莲子蛋白粉)培养下的双歧杆菌的生长图片，荧光成像下的双歧杆菌菌体发出强于周围环境的绿色荧光，细菌表面的荧光分布均匀，说明多糖或蛋白质分子已穿越双歧杆菌表面的细胞膜进入细胞内部，其中细菌的分叉点荧光效应较弱。54％醇析物在荧光效应下呈现外部荧光的荧光强度较强，36％醇析物荧光强度较弱，80％醇析物最弱，说明高含量的莲子多糖首先在细菌外部大量积累并随后深入至菌体内部被利用，随后多糖再运输至菌体内部继续代谢发酵成为短链脂肪酸。而大分子和小分子莲子蛋白进入菌体内部较少，可能已在双歧杆菌菌体外被分解或无法进入菌体内部利用。莲子多糖是决定菌体生长能力的关键影响因素。
实施例11莲子活性多糖的分子特征测定
通过高性能尺寸排阻色谱与多角度激光散射(HPSEC-MALLS)分析相结合测定莲子多糖在0.1mol NaCl水溶液中的重均分子量(Mw)、多分散指数(PDI)和回转半径(<S2>z1/2)。
测定实施例1取得的莲子多糖LSPS2-2浓度，进样量(1mg/mL，1000μL)；色谱条件：色谱柱Ohpak SB-G、Ohpak SB-806、SB-805和SB-804HQ串联柱；检测器：示差折光仪器、激光散射仪；dn/dc值为0.135mL/g；流动相：0.1mol NaCl水溶液；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；采用Wyatt Tech公司的控制软件Astra对光散射数据进行采集和分析。
表4莲子多糖粉的分子量
Figure BDA0002525321810000211
注：Mw、Mn、Mz分别指重均、数均、z-平均分子量；Rw、Rn、Rz分别表示重均、数均、z-平均旋转半径。
由表4可知，多糖产品的Mw(重均分子量)、Mn(数均分子量)、Mz(z-平均分子量)分别测定为3.058×104Da、2.903×104Da、3.256×104Da，Rw(重均旋转半径)为25.8nm，多分散指数PDI(Mw/Mn)为1.053，为较均一的多糖组分，主要为LSPS2-2组分。通过多糖产品的对数-对数坐标中[S2]z1/2对Mw进行拟合。v值为0.83，多糖表现为刚性棒构象。
实施例12莲子活性多糖中的单糖组成分析
实施例1取得的莲子多糖粉采用三氟乙酸(TFA，2mol/L)水解，然后与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(0.5mol/L)络合。然后将得到的产物用HPLC分析：配备有ZORBAXEclipse的XDB-C18柱(150×4.6mm，粒度5μm，安捷伦科技，CA，USA)，并在UV245nm检测。样品溶液(10μL)注射，并在25用蒸馏水洗脱℃下用1.0的流速mL/min。流动相A是磷酸盐缓冲液(50mmol/L)-乙腈(85:15，v/v)的混合物，流动相B是磷酸盐缓冲液(50mmol/L)-乙腈(60:40，v/v)。使用15-23-15％B相从0至20-35分钟梯度洗脱进行分析。
表5莲子活性多糖的单糖组成
Figure BDA0002525321810000221
由表5可知。产品的单糖组分主要为葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖和半乳糖，这表明产品的单糖组成主要葡萄糖和半乳糖。
实施例13莲子活性多糖的的红外光谱分析
称取3.0mg实施例1取得的莲子多糖粉与20.0mg KBr粉末混合，研磨中充分研磨成约1mm颗粒，进行傅立叶变换红外光谱扫描，扫描的范围为4000～400cm-1。
如图6所示，LSPS2-2表现出多糖的典型吸收特征，在3386cm-1处的吸收为O-H伸缩振动峰，在碳水化合物中是常见的表现；2933cm-1处为-CH2-基团中C-H的反对称伸缩振动；1635cm-1和1540cm-1处的吸收带是由于酰胺基团的C＝O伸缩振动和N-H键偏离振动导致；在1179cm-1和1033cm-1处的吸收峰表明在LSPS2-2中存在糖醛酸；899cm-1处的吸收带表明LSPS2-2含有β-吡喃型单糖。众所周知，在1730cm-1处的吸收峰可用于评价多糖中糖醛酸的酯化程度，在1730.0cm-1处没有吸收峰出现，表明LSPS2-2中的糖醛酸为非酯化。
实施例14多糖产品的核磁共振图谱分析
取制备的实施例1取得的莲子多糖粉LSPS2-2反复多次冻干后，取40mg溶于0.4mLD2O中，置于核磁管中，用400MHz核磁共振仪BrukerAV-400记录其1H NMR，13C NMR，HSQC，HMBC等图谱进行分析。
表6莲子多糖粉的核磁共振分析结果
Figure BDA0002525321810000231
结合图7、8和表6以及COSY，HSQC和HMBC谱中H-H，C-H和远程C-H的相关信号，对糖类相关的核磁信号归属如表4所示，根据多糖信号的归属和单糖分析结果判断可知本专利制备的获得莲子多糖结构很可能为→6-Glc-1→为主链，而在C3位有→3-Glc-1→支链取代的链接方式。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种莲子活性物质的提取方法，其特征在于，其包括以下依次进行
的步骤：
S1包括：将莲子依次经过内肽酶和端肽酶复合酶的第一次酶解和胰蛋白酶的第二次酶解，酶解后过滤得到酶解液；
S2包括：将酶解液经过一次以上离心醇析得到莲子活性物质；
所述第一次酶解的pH值至5.8~6.2，复合酶的加酶量为280~320U/g，酶解温度为55~60℃，酶解时间为360~390min；
所述第二次酶解的加酶量为800~900U/g，酶解时间为30~40min；
步骤S2包括第一次离心醇析：使酶解液中乙醇的浓度为35~38%，离心后得第一上清液和第一沉淀；
步骤S2还包括第二次离心醇析：使第一上清液的乙醇浓度为52~55%，离心后得第二上清液和第二沉淀；
步骤S2还包括第三次离心醇析：使第二上清液的乙醇浓度为78~80%，离心后得第三上清液和第三沉淀；
第一沉淀为莲子蛋白；第二沉淀为莲子多糖；第三沉淀为莲子蛋白；第三上清液为莲子低聚肽。
2.如权利要求1所述的莲子活性物质的提取方法，其特征在于，步骤S1中还包括酶解前莲子的处理：将莲子加水打浆后在4℃以下的条件下静置沉淀6~10h得到莲子料液。
3.如权利要求1所述的莲子活性物质的提取方法，其特征在于，其还包括步骤S3，将第一沉淀、第二沉淀和第三沉淀分别加入去离子水配置成35%浓度的溶液分别进行切向流超滤，超滤膜截留分子量为1KD。
4.一种根据权利要求1所述的莲子活性物质的提取方法提取得到的莲子活性物质。
5.一种根据权利要求1所述的提取方法得到的莲子多糖在制备益生元及抗氧化制品中的应用。
6.一种莲子多糖，其特征在于：其为由按摩尔比为18.25:74.46:2.38:4.91的半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸组成的聚合糖，所述莲子多糖的结构以→6-Glc-1→为主链，并且在C3位有→3-Glc-1→支链取代的连接方式；其根据权利要求1所述的提取方法提取得到。
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