CN116622001B - 一种百年蔗红糖多糖及其制备、鉴定方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种百年蔗红糖多糖及其制备、鉴定方法和应用，本发明可快速从百年蔗红糖中提取多糖，操作简单，生产成本低。具体为：通过膜分离法得到了粗多糖，粗多糖经过去除蛋白质和色素后，通过纤维素和凝胶柱层析分离得到了纯度较高的百年蔗红糖多糖。通过甲基化和核磁共振分析鉴定了百年蔗多糖的结构，为其与药理活性的构效关系研究奠定了基础。同时对百年蔗红糖多糖的益生元活性进行了分析评价，揭示了百年蔗红糖多糖的益生元活性应用。

Description

一种百年蔗红糖多糖及其制备、鉴定方法和应用
技术领域
本发明涉及功能食品技术领域，特别涉及一种百年蔗红糖多糖及其制备、鉴定方法和应用。
背景技术
百年蔗是种植于福建省松溪县郑墩镇的一种甘蔗品种，分类上属于甘蔗属中国种的竹蔗。百年蔗中含有丰富的多糖、多酚和黄酮等功能活性组分。多糖是自然界中最丰富的生物聚合物，广泛地存在于动物、植物和微生物中，是构成生命的四大物质之一。已有的一些研究表明，多糖的结构特征对其生物活性有重要影响，包括多糖的分子量、单糖组成、糖基残基序列、分支程度、分子结构等。一些天然多糖被认为在胃肠道中不可消化，因为它们通过对益生菌(如双歧杆菌或乳酸杆菌)的增殖作用调控肠道微生物群的组成，从而改善由于肠道紊乱引起的一系列并发症，因此多糖在维持菌群平衡方面具有重要意义。本发明以百年蔗红糖作为原料，发明一种百年蔗红糖多糖的提取、结构鉴定和在益生元方面的应用，为百年蔗开发提供了一种新的思路。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种百年蔗红糖多糖及其制备、鉴定方法和应用。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种百年蔗红糖多糖，包括葡萄糖，所述多糖分子量为2-2000KDa，百年蔗红糖多糖的的一级结构为：
一种百年蔗红糖多糖制备方法，包括以下步骤：
S1溶解：将百年蔗红糖溶于少量蒸馏水中，离心去除杂质；
S2透析：将S1溶解的百年蔗红糖在透析袋内透析48小时；
S3去蛋白和脱色：将S2得到的百年蔗红糖溶液通过木瓜蛋白酶-等电点法、AB-8大孔吸附树脂在振荡器中进行脱蛋白和脱色，冷冻干燥后得到粗多糖；
S4多糖的分离纯化：将S3得到的多糖复溶于水，在DEAE-52纤维素柱中经过0-0.3M的NaCl溶液洗脱，根据苯酚硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集多糖组分，将组分浓缩、透析、醇沉和冷冻干燥；再将组分复溶于水，离心，取上清液；
将上清液进行凝胶柱层析，采用葡聚糖凝胶G-75进行分离，洗脱液为去离子水，随后通过苯酚硫酸法绘制洗脱曲线，根据曲线收集组分，浓缩、透析、醇沉和冷冻干燥后得到百年蔗红糖多糖。
优选的，所述步骤S2中透析袋的规格为2-200kDa。
优选的，所述步骤S3中木瓜蛋白酶的用量为1-4％，等电点pH为2-3，脱色温度为20-60℃。
一种百年蔗红糖多糖的鉴定方法，包括以下步骤：
(1)取百年蔗红糖多糖样品，将其完全酸水解，水解产物经衍生化后进行GC-MS检测；
(2)取百年蔗红糖多糖样品，干燥压片后进行红外光谱检测；
(3)取百年蔗红糖多糖样品，甲基化水解、还原、乙酰化后进行GC-MS检测；
(4)取百年蔗红糖多糖样品溶1于D2O，进行核磁共振分析。
一种百年蔗红糖多糖的应用，所述百年蔗红糖多糖促进益生元生长的应用。
(三)有益效果
本发明的有益效果在于：采用上述技术方案，本发明可快速从百年蔗红糖中提取多糖，操作简单，生产成本低。具体为：通过膜分离法得到了粗多糖，粗多糖经过去除蛋白质和色素后，通过纤维素和凝胶柱层析分离得到了纯度较高的百年蔗红糖多糖。通过甲基化和核磁共振分析鉴定了百年蔗多糖的结构，为其与药理活性的构效关系研究奠定了基础。同时对百年蔗红糖多糖的益生元活性进行了分析评价，揭示了百年蔗红糖多糖的益生元活性应用。
附图说明
图1为百年蔗红糖多糖的分子量测定谱图；
图2为百年蔗红糖多糖单体的分子量测定谱图；
图3为GC-MS单糖组成测定谱：
(a)百年蔗红糖多糖单糖谱图；(b)单糖标准品谱图
图4为百年蔗红糖多糖单体的红外谱图；
图5为百年蔗红糖多糖单体的1HNMR谱图；
图6为百年蔗红糖多糖单体的13CNMR谱图；
图7为百年蔗红糖多糖单体的COSY谱图；
图8为百年蔗红糖多糖单体的TOCSY谱图；
图9为百年蔗红糖多糖单体的NOESY谱图；
图10为百年蔗红糖多糖单体的HSQC谱图；
图11为百年蔗红糖多糖单体的HMBC谱图；
图12为百年蔗红糖多糖单体的结构图；
图13为益生菌的生长通过其在不同浓度的百年蔗红糖多糖和FOS培养基中培养48小时后在600nm处的光密度来表达：
(a)两歧双歧杆菌；(b)保加利亚乳杆菌；(c)嗜酸乳杆菌；以及百年蔗红糖多糖和FOS对培养48小时后益生菌酸化活性的影响：(d)两歧双歧杆菌；(e)保加利亚乳杆菌；(f)嗜酸乳杆菌。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明第一实施例：
一种百年蔗红糖多糖制备方法，具体如下：
百年蔗红糖多糖的提取和杂质去除：
称取一定量的百年蔗红糖溶于少量蒸馏水中，倒入预处理好后的分子截留量为2000Da的透析袋内，透析48小时，期间更换透析液。透析完成将袋内溶液在50℃下旋转蒸发水分至少量，采用酶(木瓜蛋白酶)-等电点法去除蛋白质。
得到的溶液以料液比为1：4添加预处理后的AB-8大孔吸附树脂，调节pH值至4，于摇床中以40℃、150r/min吸附色素6h，过滤除去树脂，经浓缩后添加4倍体积的无水乙醇于4℃下过夜沉淀多糖，真空冷冻干燥得到百年蔗红糖多糖。
百年蔗红糖多糖的分离纯化将得到百年蔗红糖多糖通过柱层析实验进一步分离纯化，具体方法如下：
准确称取0.15g的百年蔗红糖多糖粉末，溶于10mL超纯水中并过0.45m滤膜，于DEAE-52纤维素柱上，先后以超纯水和不同浓度的氯化钠(0-0.3mol/L)溶液进行梯度洗脱。以苯酚硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱峰收集多糖组分，浓缩、透析、醇沉、冷冻干燥。取0.04g样品复溶后经DEAE-52分离，过0.45m滤膜，于葡聚糖凝胶(G-75)柱上，以去离子水进行洗脱，以苯酚硫酸法测定跟踪洗脱曲线，根据洗脱峰合并相同组分，干燥后得到百年蔗红糖多糖单体。
参考图1至图12，本发明第二实施例：
百年蔗红糖多糖单体的结构鉴定
(一)实验方法
1、百年蔗红糖多糖单体的分子量测定
将高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)用于测定多糖的重均分子量(Mw)。方法如下：
色谱柱：Ultrahydro-gelTMLinear(300mm×7.8mm)，检测器：RID示差折光检测器，柱温保持在40℃，多糖浓度为5mg/mL，进样量为10μL。使用KH2PO4水溶液(0.1M)作为流动相，其流速为0.8mL/min。通过用葡聚糖标准品(T-10000、T-40000、T-70000、T-100000和T-500000)建立的校准曲线计算百年蔗红糖多糖分子量。
2、百年蔗红糖多糖单体的组成测定
百年蔗红糖多糖单体的前处理：精确称取10mg的百年蔗红糖多糖单体于水解管中，加入6mL TFA(4M)，在120℃下水解4h。水解完成后，加入5mL甲醇，旋转蒸发至近干，重复加入甲醇和蒸发至近干5次。然后将吡啶和乙酸酐加入水解产物中，并在90℃水浴中乙酰化1h，随后用氮吹仪除去过量的乙酸酐，最后，加入三氯甲烷以溶解乙酰化产物。
单糖组成测定方法：将上述三氯甲烷溶解的乙酰化产物于GC-MS中进行检测。色谱柱：DB-1701石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)中。升温程序如下：
初始柱温为160℃，保持1分钟，以2.0℃/min的速率升至230℃，保持10分钟。使用氦气作为载气，其流速为1.0mL/min，分流比设置为100:1。进样口温度保持在300℃，离子源温度设置为230℃。以1s的间隔在35-550amu的m/z范围内扫描质谱。通过NIST14s谱库搜索和分析GC-MS光谱。
单糖标准品的测定同百年蔗红糖多糖单体的处理方法。
3、红外光谱测定
将2mg百年蔗红糖多糖单体和200mg KBr混匀后进行压片，并在傅里叶变换红外光谱仪(FTIR iS5 Thermo Fisher)中以波长为4000-400cm-1范围内进行扫描。
4、百年蔗红糖多糖单体的甲基化分析
(1)甲基化反应
称取10mg百年蔗红糖多糖单体于10mL水解管中，加入500μL DMSO，充入氮气，超声30min，充分溶解样品。加入10mg NaOH粉末，充入氮气，孵育30min，将样品冰浴冷却至样液凝固，充入氮气，加入0.1mL CH3I，反应30min，孵育期间控制水浴温度为18-20℃。冰浴冷却至样液凝固，充入氮气，再加0.1mL CH3I，反应30min。加入1mL Na2S2O3(4mmol/L)的水溶液，终止甲基化反应。向反应液中加入1mL氯仿，涡旋混合，静置分层，吸取下层氯仿相，重复萃取4次。合并氯仿相，加入1mL水，涡旋混合，离心，除去水相，重复4次。合并滤液，氮气吹干。随后进行水解、还原和乙酰化，乙酰化产物溶用二氯甲烷溶解，过0.45μm滤膜于GC-MS中检测。
(2)GC-MS仪器参数
进样量为1μL，分流比10:1，载气为高纯氦气；初始温度为50℃保持1.0min，以40℃/min程序升温至215℃，保持45min。分析物在全扫描(SCAN)采集方式下进行检测，质量扫描范围(m/z):30-600。
5、核磁共振分析
取15mg百年蔗红糖多糖单体充分溶解至500μL含0.05％wt TSP的D2O中，将溶解后溶液转移至核磁管中。采用700MHz核磁共振波谱仪对目标物进行定量分析，检测温度为25℃，在核磁共振波谱仪中扫描记录1H谱、13C谱、COSY、TOCSY、HSQC、HMBC、NOESY谱图。
(二)鉴定结果
1、百年蔗红糖多糖和百年蔗红糖多糖单体的分子量
参考图1显示百年蔗红糖多糖具有多个液相色谱峰，参考图2显示百年蔗红糖多糖单体的液相色谱峰为单一对称的单峰，根据标准品的分子量和保留时间绘制得到的校准曲线方程LogMW＝10.883-0.5799T(T表示保留时间，R2＝0.9958)，计算出百年蔗红糖多糖的分子量分布为2-2000kDa，百年蔗红糖多糖单体的重均分子量(MW)为4307Da。
2、百年蔗红糖多糖单体的单糖组成
如图3所示，百年蔗红糖多糖单体衍生化反应后，通过GC-MS分析获得了多个单色谱峰。根据谱库检索和与标准品谱图(图)的比对分析，确定百年蔗红糖多糖单体主要由葡萄糖(Glp)、核糖(Rib)、来苏糖(Lys)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)和半乳糖(Gal)组成，摩尔比为206.9:1.0:11.4:6.2:2.3:1.5:1.4。
3、百年蔗红糖多糖单体的红外光谱
如图4所示，由百年蔗红糖多糖单体的红外光谱可知，百年蔗红糖多糖单体含有多糖的红外特征吸收峰。
4、百年蔗红糖多糖单体的甲基化分析结果
GC–MS测得百年蔗红糖多糖单体的糖苷键种类及比例如表1所示：
表1百年蔗红糖多糖单体的甲基化分析数据
5、百年蔗红糖多糖单体的核磁共振分析
参考图5至图11，结合核磁1H谱、13C谱、COSY、TOCSY、NOESY、HSQC和HMBC谱图对百年蔗红糖多糖单体的糖残基的碳原子和氢原子的化学位移进行了归属，同时确认了糖残基之间的连接顺序。
在表2中，列出了百年蔗红糖多糖单体每个糖残基的1H和13C化学位移的分配，同时在谱图中对各残基所属信号进行了标注，并对残基间质子信号的耦合关系进行了分析。
表2百年蔗红糖多糖单体的1H和13C NMR谱的分配，如下所示：
注：表中“n.d”notdetected”的缩写，表示未识别到。
综上所述：百年蔗红糖多糖单体是一种由葡萄糖聚合而成的葡萄多聚糖，甲基化、红外光谱和核磁共振分析表明百年蔗红糖多糖单体的骨架主要存在α-和β-构型，主链主要由→4)-α-Glcp-(1→链接构成，支链存在α-Araf-(1→3糖苷键和α-Araf-(1→4糖苷键，由以上分析得出百年蔗红糖多糖单体的结构如图12所示。
参考图13，本发明第三实施例：
一种百年蔗红糖多糖的应用：
(一)试验材料：百年蔗红糖多糖
(二)试验对象：嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、两歧双歧杆菌(均
为标准菌，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供)
(三)试验方法
1、益生菌的活化
乳酸菌的活化：取适量冻干管中的保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌分别于1mL无菌离心管中，取0.3mL无菌水充分溶解菌粉制成菌悬液，取100μl菌悬液加入无菌平皿中，迅速倒入灭好菌的MRS琼脂培养基，充分混匀菌液，待培养基凝固，将培养皿放入37℃培养箱中培养48小时。
两歧双歧杆菌的活化：用无菌吸管吸取0.5mL适宜的MRS(含0.5g/L的L-半胱氨酸)液体培养基，滴入安瓿瓶内，使冻干菌粉全部溶解。将溶解后的菌悬液转移至盛有4-5mL液体培养基的厌氧管中混匀，并取100μL转接到固体培养基上。将液体试管和斜面试管于37℃条件下静置培养48小时。
2、菌株的复壮
将培养48小时后的各菌培养皿进行挑菌试验。首先完成镜检，确定所需菌株，然后在超净工作台上将菌株挑出分别移入盛有10mLMRS液体培养基的厌氧管中，然后抽取厌氧管中多余的空气，移入培养箱中在37℃条件下培养48小时，得到活化且复壮后的菌种，即可用于多糖益生活性研究。
3、益生菌培养
本试验使用MRS肉汤作为基础培养基(含5mg/mL标准葡萄糖)研究了百年蔗红糖多糖的体外益生元活性。
研究方法如下：将适量的百年蔗红糖多糖用无菌蒸馏水溶解，多糖溶液过0.22微米滤膜。将百年蔗红糖多糖溶液与MRS肉汤在厌氧管中混合，使百年蔗红糖多糖的终浓度为0mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL。然后分别将双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌添加到上述五种梯度浓度的厌氧管中。此外，低聚果糖(FOS，Mw＝762Da)作为阳性对照。将厌氧管放入37℃培养箱中培养48小时。
4、益生菌培养液酸化程度测定
将培养48小时后的双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌培养体系从培养箱中取出置于超净工作台面，使用涡旋振荡器振荡厌氧管使菌悬液均匀，用无菌吸管从厌氧管中吸取约4mL的菌悬液于无菌离心管中，10000r/min离心10min，取上清液于pH仪处测定pH。根据测得的pH值大小判断益生菌在各碳源下的产酸能力。
5、益生菌的生物量测定
用无菌吸管从上述厌氧管中吸取约1mL菌悬液于无菌离心管中，10000r/min离心10min，去上清，加入4mL液体MRS培养基，随后充分振荡，在600nm处测定吸光度，并以灭菌的液体MRS培养基调零。测得的吸光值间接反应了菌悬液浓度的高低，所以通过测得的菌悬液的OD 600可以反映益生菌在各碳源下的生长繁殖能力。
(四)试验结果
本研究采用菌悬液OD 600nm和pH值来评估多糖对益生菌的益生作用。
如图13a、b、c所示，添加百年蔗红糖多糖和FOS后，双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵体系的OD 600nm随着添加量的增加而增加。然而，在浓度为10-20mg/mL范围内，益生菌的菌悬液浓度增加变得缓慢。图13d、e、f分别显示了两歧双歧杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌在相同浓度梯度下培养48小时后，发酵液pH值的变化情况。两歧双歧杆菌的pH值随着百年蔗红糖多糖和FOS添加量(0mg/mL-20mg/mL)的增加而持续下降，保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的pH在百年蔗红糖多糖和FOS浓度为5mg/mL时就达到了较低水平，但保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌菌悬液的pH值始终低于两歧双歧杆菌，这一结果反应了百年蔗红糖多糖和FOS更能促进保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的产酸。在10-20mg/mL时三种菌的菌悬液pH值基本持平，可能是因为在低pH条件下益生菌的生长受到抑制从而限制产酸。同时，可以看出，无论是哪种益生菌，在百年蔗红糖多糖中培养后其菌悬液的OD 600nm总是更高，pH总是下降更多，这一结果说明了百年蔗红糖多糖和FOS均具有良好的促进益生菌生长的活性，但百年蔗红糖多糖对益生菌的生长有更大的促进作用。
综上所述，本发明制备的百年蔗红糖多糖能有效促进嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和两歧双歧杆菌的增殖，并均能有效促进益生菌的产酸，表现出良好的益生元活性。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种百年蔗红糖多糖，其特征在于，包括葡萄糖，所述多糖分子量为2-2000KDa，百年蔗红糖多糖的的一级结构为：
2.一种权利要求1所述的百年蔗红糖多糖制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1溶解：将百年蔗红糖溶于少量蒸馏水中，离心去除杂质；
S2透析：将S1溶解的百年蔗红糖在透析袋内透析48小时；
S3去蛋白和脱色：将S2得到的百年蔗红糖溶液通过木瓜蛋白酶-等电点法、AB-8大孔吸附树脂在振荡器中进行脱蛋白和脱色，冷冻干燥后得到粗多糖；
S4多糖的分离纯化：将S3得到的多糖复溶于水，在DEAE-52纤维素柱中经过0-0.3M的NaCl溶液洗脱，根据苯酚硫酸法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收集多糖组分，将组分浓缩、透析、醇沉和冷冻干燥；再将组分复溶于水，离心，取上清液；
将上清液进行凝胶柱层析，采用葡聚糖凝胶G-75进行分离，洗脱液为去离子水，随后通过苯酚硫酸法绘制洗脱曲线，根据曲线收集组分，浓缩、透析、醇沉和冷冻干燥后得到百年蔗红糖多糖。
3.根据权利要求2所述的一种百年蔗红糖多糖制备方法，其特征在于，所述步骤S2中透析袋的规格为2-200kDa。
4.根据权利要求2所述的一种百年蔗红糖多糖制备方法，其特征在于，所述步骤S3中木瓜蛋白酶的用量为1-4％，等电点pH为2-3，脱色温度为20-60℃。
5.一种权利要求1-4中任一所述百年蔗红糖多糖的应用，其特征在于，所述百年蔗红糖多糖促进益生元生长的应用。
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