CN117143260A - 一种樟树籽仁多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然提取物技术领域，具体涉及一种樟树籽仁多糖及其制备方法和应用。本申请提供的樟树籽仁多糖，所述樟树籽仁多糖包括以下单糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和盐酸氨基葡萄糖，且摩尔比为(0.88～0.92)：(0.06～0.1)：(0.015～0.02)：(0.003～0.004)：(0.003～0.004)；所述樟树籽仁多糖的重均分子量为1000Da～20000Da。本发明还提供上述樟树籽仁多糖的制备方法及所述多糖的应用。结果显示，樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1‑A具有较好的体外抗消化性，且可以促进嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌的生长繁殖，并产生相应的SCFAs，具有潜在的益生元活性，有利于提高樟树籽资源的综合利用效率和附加值。

Description

一种樟树籽仁多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然提取物技术领域，具体涉及一种樟树籽仁多糖及其制备方法和应用。
背景技术
樟树籽是樟科植物樟树的果实，樟树籽仁是樟树籽最主要和最具有价值的部分，其中含有丰富的油脂、蛋白和膳食纤维等物质。现有文献对樟树籽的研究主要集中在樟树籽仁油的提取方法、生理活性或以樟树籽仁油为原料合成结构脂质产品等。
植物多糖又称植物多聚糖，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，它是生物体内重要的生物大分子，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。科学实验研究显示，许多植物多糖具有生物活性，具有包括免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌抗病毒、保护肝脏等保健作用。
目前关于樟树籽仁多糖的提取、结构研究以及生物活性还未见公开文献报道。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种樟树籽仁多糖。
本发明的另一目的在于提供上述樟树籽仁多糖的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述樟树籽仁多糖的应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种樟树籽仁多糖，所述樟树籽仁多糖包括以下单糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和盐酸氨基葡萄糖，且摩尔比为(0.88～0.92)：(0.06～0.1)：(0.015～0.02)：(0.003～0.004)：(0.003～0.004)；
所述樟树籽仁多糖的重均分子量为1000Da～20000Da。
进一步地，所述樟树籽仁多糖的重均分子量为4000Da～15000Da；
所述多糖的平均粒径为350nm～1200nm。
进一步地，所述樟树籽仁多糖是将樟树籽仁水酶法提取樟树籽仁油的水相进行脱蛋白、脱色得到脱色后溶液，对脱色后溶液进行浓缩、醇沉、透析、冻干得到樟树籽仁多糖CCSKP。
进一步地，将樟树籽仁多糖CCSKP采用阴离子交换色谱柱分离后采用葡聚糖SephadexG-50凝胶吸附法纯化得到樟树籽仁多糖CCSKP1-A。
进一步地，所述樟树籽仁多糖CCSKP为多分散性的多糖-蛋白复合物：
总糖、蛋白及糖醛酸含量分别为64.70±1.27％、11.33±1.12％和9.45±0.33％，平均分子量为14080Da、7934Da、5361Da；
单糖组成中葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖及盐酸氨基葡萄糖的摩尔比为0.911：0.065：0.018：0.004：0.003；
粒径为354.85nm，Zeta电位值-4.64mV。
进一步地，所述樟树籽仁多糖CCSKP1-A为中性多糖：
总糖含量为89.50±0.46％，蛋白含量为3.15±0.54％；
单糖组成中葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖及盐酸氨基葡萄糖的摩尔比为0.883：0.094：0.016：0.003：0.004；
粒径为1158.00nm，Zeta电位值-0.03mV。
本发明还提供上述樟树籽仁多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用高速粉碎机研磨樟树籽仁，加入蒸馏水将其配成体积比为1：6的悬浮液，调节pH为5.0～6.0，再加入纤维素酶使其配置成3000U/ml的溶液，在55℃的恒温水浴锅中加热2h，高温灭酶10min后，离心收集上清液，将收集的上清液置于4℃冰箱12h，进一步除去游离油；
(2)脱蛋白及脱色：向处理后的水相中加入重量体积百分数2％的木瓜蛋白酶，在55℃酶解2h，经高温灭酶10min后，离心去除沉淀，收集上清液，向上清液加入预处理活化的重量体积百分数10％AB-8大孔树脂，在40℃的摇床中脱色1h，减压抽滤除去大孔树脂，收集脱色后溶液；
(3)乙醇沉淀：用旋转蒸发器在60℃下将脱色后溶液浓缩至原体积的25％，收集浓缩液，加入3倍体积的无水乙醇置于4℃的冰箱进行过夜，离心去掉上清液，向沉淀组分加入适当的蒸馏水进行复溶；
(4)透析除杂：将上述收集到的樟树籽仁多糖溶液置于1000Da透析袋中进行流水透析1～2天，透析完成后，浓缩冷冻干燥即获得樟树籽仁多糖CCSKP。
进一步地，所述方法还包括：
(5)DEAE-52纤维素阴离子交换法分离
预处理：将称取的DEAE-52纤维素，进行碱-酸-碱的预处理，最后再取适量的蒸馏水清洗DEAE-52纤维素3～4次直至pH为7.0～7.4；
配制10mg/mL樟树籽仁多糖CCSKP水溶液，多糖溶液过0.45μm的滤膜，将CCSKP溶液逐滴加入到预先装好的阴离子交换色谱柱，并以0～0.5mol/L的梯度NaCl溶液为洗脱剂进行洗脱，设置流速为1mL/min，以10min/管的速度自动收集流出的洗脱液，每个梯度的洗脱液收集30管，在OD490nm处测量其吸光值，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线进行透析、浓缩并进行真空冷冻干燥得到樟树籽仁多糖组分CCSKP1、CCSKP2、CCSKP3；
(6)葡聚糖SephadexG-50凝胶吸附法纯化
精确称取樟树籽仁多糖组分CCSKP1配置成10mg/ml的多糖溶液，用0.45μm滤头过滤后，将其加到葡聚糖SephadexG-50凝胶柱上，以超纯水为洗脱剂进行洗脱，洗脱液分管自动收集，设置流速为0.2mL/min，4mL/管，收集洗脱液直至多糖全部流出才结束，测量其吸光值并绘制葡聚糖凝胶洗脱曲线，合并收集，进行浓缩，冷冻干燥，得到樟树籽仁多糖组分CCSKP1-A。
本发明还提供所述樟树籽仁多糖在制备促进益生菌增殖作用食品、保健品中的应用。
进一步地，所述益生菌为嗜酸乳杆菌Lacrobacillus acidophilus、长歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、婴儿双歧杆菌Bifidobacteriuminfantis和青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis中至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用水酶法提取樟树籽仁油后的工艺废水为原料，优化提取分离条件成功分离获得樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A，并对所得多糖的分子量、单糖组成、粒径形态、结构等进行了分析鉴定，确定了其粒径、重均分子量和结构组成。体外实验表明，樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A具有较好的体外抗消化性，且可以促进嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌的生长繁殖，并产生相应的SCFAs，具有潜在的益生元活性，有利于提高樟树籽资源的综合利用效率和附加值。
附图说明
图1为CCSKP在DEAE-52纤维素阴离子交换柱上的洗脱曲线；
图2为CCSKP1-A在SephadexG-50凝胶柱上的洗脱曲线；
图3为CCSKP和CCSKP1-A的分子量分布色谱图；
图4为CCSKP的单糖组成色谱图；
图5为CCSKP1-A单糖组成色谱图；
图6为CCSKP、CCSKP1-A红外光谱分析图；
图7为CCSKP、CCSKP1-A的粒径分布与电位大小；
图8为CCSKP、CCSKP1-A的扫描电镜图；
其中，A,B,C分别CCSKP的100倍、500倍和1000倍电镜图；D,E,F分别为CCSKP1-A的100倍、500倍和1000倍电镜图；
图9为CCSKP对模拟胃液的水解度曲线；
图10为CCSKP1-A对模拟胃液的水解度曲线；
图11为FOS对模拟胃液的水解度曲线；
图12为α淀粉酶水解CCSKP对α淀粉酶的水解度曲线；
图13为α淀粉酶水解CCSKP1-A对α淀粉酶的水解度曲线；
图14为α淀粉酶水解FOS对α淀粉酶的水解度曲线；
图15为CCSKP、CCSKP1-A和FOS对无糖MRS培养基中嗜酸乳杆菌的生长增殖和培养液基pH的影响；
图16为CCSKP、CCSKP1-A和FOS对无糖MRS培养基中长歧双歧杆菌的生长增殖和培养液基pH的影响；
图17为CCSKP、CCSKP1-A和FOS对无糖MRS培养基中婴儿双歧杆菌的生长增殖和培养液基pH的影响；
图18为CCSKP、CCSKP1-A和FOS对无糖MRS培养基中青春双歧杆菌的生长增殖和培养液基pH的影响；
图19为CCSKP、CCSKP1-A及FOS对嗜酸乳杆菌的生长速率影响；
图20为CCSKP、CCSKP1-A及FOS对长歧双歧杆菌的生长速率影响；
图21为CCSKP、CCSKP1-A及FOS对婴儿双歧杆菌的生长速率影响；
图22为CCSKP、CCSKP1-A及FOS对青春双歧杆菌的生长速率影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
樟树籽仁：新鲜成熟樟树果实采自南昌大学青山湖校区。木瓜蛋白酶、大孔树脂AB-8(分析纯)，购自北京索莱宝科技有限公司。DEAE-52纤维柱和SephadexG-50色谱柱购自上海源叶生物科技有限公司。牛血清白蛋白(BSA)、d-半乳糖醛酸、BCA蛋白浓度检测试剂盒，购自阿拉丁试剂有限公司。葡萄糖标品、没食子酸、半乳糖醛酸，色谱级，购自上海源叶生物有限公司。所有其他试剂均为HPLC或分析级。
低聚果糖(FOS)和α-淀粉酶A3178-500KU，购自美国Sigma-Aldrich公司，无糖MRS肉汤来自青岛海波生物有限公司。乙酸、丙酸和正丁酸来自阿拉丁试剂有限公司，乳酸测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。嗜酸乳杆菌(BNCC 336636)和青春双歧杆菌(CICC6070)，购自商城北纳创联生物科技有限公司，长双歧杆菌(BB 536)和婴儿双歧杆菌(M-63)源于中国上海永森乳业有限公司。所有其他试剂均为HPLC或分析级。
所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1：樟树籽仁多糖CCSKP的制备
采摘南昌大学青山湖校区的新鲜成熟樟树籽，将樟树籽去除果皮和果肉，在(40±1)℃烘至恒重，采用脱壳机脱壳得到樟树籽仁实体。
(1)首先使用高速粉碎机研磨樟树籽仁，然后加入蒸馏水将其配成1：6(v/v)的悬浮液，调节pH为5.0～6.0，再加入纤维素酶使其配置成3000U/ml的溶液，在55℃的恒温水浴锅中加热2h。高温灭酶10min后，离心收集上清液。将收集的上清液置于4℃冰箱12h，进一步除去游离油得到水相，分析水相中固相中的蛋白含量为46.12±0.31％，总糖含量为26.54±0.48％，糖醛酸含量为11.01±0.64％，多酚含量为4.21±0.24％。
(2)脱蛋白及脱色：向处理后的水相中加入木瓜蛋白酶(2％，w/v)，在55℃酶解2h，经高温灭酶10min后，离心去除沉淀，收集上清液。向上清液加入的预处理活化的AB-8大孔树脂(10％，w/v)，在40℃的摇床中脱色1h，减压抽滤除去大孔树脂，收集脱色后溶液。
(3)乙醇沉淀：用旋转蒸发器在60℃下将脱色后溶液浓缩至原体积的25％，收集浓缩液，加入3倍体积的无水乙醇置于4℃的冰箱进行过夜。离心去掉上清液，向沉淀组分加入适当的蒸馏水进行复溶。
(4)透析除杂：将上述收集到的樟树籽仁多糖溶液置于1000Da透析袋中进行流水透析，一般为1～2天，特殊情况下可再用蒸馏水进行透析。透析完成后，浓缩冷冻干燥即获得樟树籽仁多糖CCSKP样品，计算得率为5.34％。
实施例2：樟树籽仁多糖CCSKP1-A的制备
以实施例1制备获得的樟树籽仁多糖CCSKP样品为原料制备樟树籽仁多糖CCSKP1-A，具体步骤是：
(1)DEAE-52纤维素阴离子交换法分离
预处理：将称取的DEAE-52纤维素，进行碱-酸-碱的预处理。最后再取适量的蒸馏水清洗DEAE-52纤维素3～4次直至pH为7.0～7.4。
配制10mL樟树籽仁多糖CCSKP水溶液(10mg/mL)，多糖溶液过0.45μm的滤膜。将CCSKP溶液逐滴加入到预先装好的阴离子交换色谱柱(2.6×30cm)，并以0～0.5mol/L的梯度NaCl溶液为洗脱剂进行洗脱，设置流速为1mL/min，以10min/管的速度自动收集流出的洗脱液，每个梯度的洗脱液收集30管，在OD490nm处测量其吸光值，并绘制洗脱曲线。洗脱曲线如图1所示，从图1可以看出洗脱曲线呈现的三个峰，其中以蒸馏水洗脱组分所占比例最大，其次是0.10、0.20mol/LNaCl洗脱的组分，分别收集三种组分的洗脱液，再透析、浓缩、冷冻干燥后初步分离得到CCSKP1、CCSKP2和CCSKP3三个组分，并计算各组分的得率分别为25.65％、2.53％和1.08％。
(2)葡聚糖SephadexG-50凝胶吸附法纯化
精确称取10mg左右的樟树籽仁多糖组分CCSKP1，配置成10mg/ml的多糖溶液，用0.45μm滤头过滤后，将其加到葡聚糖SephadexG-50凝胶柱(1.0×60cm)上，以超纯水为洗脱剂进行洗脱，洗脱液分管自动收集，设置流速为0.2mL/min，4mL/管，收集洗脱液直至多糖全部流出才结束。测量其吸光值并绘制葡聚糖凝胶洗脱曲线，洗脱曲线如图2所示，峰形对称，说明该组分不含有明显的杂质且纯度较高。收集洗脱峰，经过浓缩、冷冻干燥等步骤得到樟树籽仁多糖CCSKP1-A。
实施例3：樟树籽仁多糖CCSKP样品化学组成测定与分析
1.测定方法
1)将上述实施例1所得樟树籽仁多糖CCSKP样品和实施例2所得樟树籽仁多糖CCSKP1-A采用苯酚-硫酸法进行多糖含量的测定、采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测多糖样品中蛋白质含量、采用咔唑—硫酸法测定多糖样品中糖醛酸含量。
2)樟树籽仁多糖的分子量测定
采用高效液相凝胶渗透色谱法测定多糖样品的分子量分布。
精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。
色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μl；检测器：示差检测器RI-10A。
3)樟树籽仁多糖的单糖组成测定与分析
精密称量5mg样品置于安瓿瓶中，加入3M TFA 2mL，120℃水解3h。将酸水解液氮气吹干，加入5mL水涡旋混匀，吸取50uL加入950μL去离子水，12000rpm离心5min。取上清进IC分析。
色谱柱：Dionex Carbopac TMPA20(3*150mm)；流动相为：A(H2O)；B(15mMNaOHC：15mM NaOH&100mMNaOAC)；流速：0.3ml/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。
4)樟树籽仁多糖的基团结构光谱测定与分析
以蒸馏水溶解樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A，制备成样品浓度为1mg/mL的待测溶液。
采用傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)鉴定对樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的有机官能团进行了鉴定。，即样品以1:100(w/w)的比例与KBr混合，并使用Nicolet 5700FT-IR光谱仪在4000-400cm-1波长下测定并记录樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的红外光谱进行测量，对其红外光谱进行分析。
5)樟树籽仁多糖的粒径及电位测定
用Zetasizer Nano-ZS90在25℃下测量樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的粒径分布和zeta电位(1mg/mL)。样品和蒸馏水的色散折射率分别为1.45和1.33。
6)扫描电镜樟树籽仁多糖的微观形态测定与分析
采用SU8020扫描电子显微镜对扫描金薄膜制备的冻干樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A样品进行扫描，在不同的放大倍率(×100、×500和×1000)下观察和记录样品的微观形态。
2.测定结果
本实验中采用Excel对实验数据进行分析，数值均表示为平均值±SD。采用OriginPro 9.0软件进行图表的处理，结果如下：
1)樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A量总糖、蛋白及糖醛酸
CCSKP的总糖、蛋白及糖醛酸含量分别为64.70±1.27％、11.33±1.12％和9.45±0.33％，表明CCSKP可能是一种多糖-蛋白复合物。多糖组分CCSKP1-A，其总糖含量为89.50±0.46％，蛋白含量为3.15±0.54％，未检测到糖醛酸含量，表明CCSKP1-A是一种中性糖。
2)樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的分子质量
采用高效凝胶渗透色谱法测定多糖CCSKP、CCSKP1-A的分子质量，以分子量对数(lgMw)对保留时间(t)绘制标准曲线，线性回归方程为logMw＝-0.1932x-12.21，R2＝0.9934。将CCSKP及CCSKP1-A在相同条件进行分子量测定，分子量标准色谱图如图3所示，从图3可以看出CCSKP的色谱图出现了三个峰值，其保留时间(t)为40.99min、42.38min及43.33min代入回归方程，计算得分子量分别为14080Da、7934Da、5361Da，表明CCSKP是非均一的组分；CCSKP1-A的色谱图只出现单一色谱峰，峰形对称良好，说明精制多糖CCSKP1-A的纯度比较高，计算其分子量为4219Da，多分散性指数(Mw/Mn)为1.26，表明CCSKP1-A在分子量上是一种相对均匀的多糖。
3)樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的单糖组成
采用离子交换色谱法(IC)对樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的单糖组成进行检测，与对照单糖混合标准品的保留时间比较，结果图4～5所示，图4为樟树籽仁多糖CCSKP单糖组成色谱图，图5为樟树籽仁多糖CCSKP1-A单糖组成色谱图。
可以看出，CCSKP和CCSKP1-A的单糖组成种类均一致，都含有阿拉伯糖(Ara)、盐酸氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)等单糖组成。通过面积归一化法计算得到CCSKP的单糖组成为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖及盐酸氨基葡萄糖，其摩尔比为0.911：0.065：0.018：0.004：0.003；CCSKP1-A的单糖组成为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖及盐酸氨基葡萄糖，其摩尔比为0.883：0.094：0.016：0.003：0.004。初步推断樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A的碳链骨架主要由葡萄糖组成，少量的阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖可能零散地穿插在主链中，或作为支链存在。此外，值得一提的是，CCSKP基本化学成分测定的糖醛酸含量为9.45±0.33％，而单糖组成分析中未检测出含有糖醛酸的单糖组成，这可能是因为硫酸-咔唑法受中性糖的干扰较大，尤其是葡萄糖和半乳糖，而CCSKP中葡萄糖含量较高，因此导致化学测量结果产生误差。
4)樟树籽仁多糖的红外光谱分析
樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的红外光谱如图6，在4000-500cm-1的范围内，CCSKP及CCSKP1-A均具有相似的多糖特征吸收峰，说明两者有相似的特征结构。通常，在3600cm-1～3300cm-1的范围内有较强且较宽的吸收峰是分子内和分子间的-OH伸缩振动，在2920cm-1左右的吸收峰通常被认为是多糖的特征吸收峰(归因于C-H的伸缩振动)，表明两者均是糖类化合物[69]。在1650cm-1～1600cm-1范围内的吸收峰被认为是羰基的伸缩振动，以及1400cm-1处观察到的吸收峰归因于是C＝O的不对称和对称伸缩振动，这说明可能有醛酸基的存在。1020cm-1左右的吸收峰是多糖的分子指纹区，是由于吡喃糖环C-O-C中的C-O伸缩振动形成的，说明CCSKP及CCSKP1-A有吡喃糖的存在，分别代表了葡萄糖、半乳糖和甘露糖。此外，932cm-1/846cm-1和931cm-1/848cm-1处的吸收峰证实CCSKP和CCSKP1-A既含有β和α-糖苷键。
5)樟树籽仁多糖的粒径与电位
如图7所示，CCSKP1-A的粒径大小值从CCSKP的354.85nm显著增加到1158.00nm，分散系数(PDI)值为0.55，小于0.6，表明CCSKP1-A溶于水中不是以单个分子体系存在，而是以分子间聚集形成的聚合体形式存在聚集形成。推测可能是因为CCSKP1-A经纯化处理后多糖分子之间的分子间的交联变得非常紧密，增强了水溶液中大颗粒多糖分子的相互作用，而CCSKP因杂质的存在，可能会干扰多糖分子之间的相互作用。由于CCSKP及CCSKP1-A的大部分粒径均大于100nm，因此粒径强度能够准确的表达樟树籽仁多糖在水溶液中的大小。CCSKP1-A与CCSKP的Zeta电位值分别为-0.03mV和-4.64mV，证实樟树籽仁多糖为中性多糖，该结果与单糖组成分析的结论一致。由于电位较低，所以在溶液中稳定性较差，易发生聚集。
6)扫描电镜樟树籽仁多糖的微观形态
扫描电子显微镜可以观察樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的表面形貌，如图8所示，图8中A,B,C分别为100倍、500倍和1000倍CCSKP电镜图；D,E,F分别为100倍、500倍和1000倍CCSKP1-A的电镜图。可以看出，在×100倍的低倍率下，CCSKP表现为不规则的、粗糙的、部分区域高度分枝的结构，这与大多数多糖呈颗粒状不同，在较高倍率(×1000)下，在CCSKP表面观察到许多聚合物的多边形片段，但CCSKP1-A呈现片状体积较大，表面相对光滑平整。
实施例4：樟树籽仁多糖CCSKP及和CCSKP1-A对益生菌的体外增殖作用
1.1实验方法
1.1.1还原糖测定的标准曲线制作
以葡葡萄糖为标准，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定还原糖。
DNS试剂配制：精准称取3，5-二硝基水杨酸6.35g，用少量的蒸馏水进行溶解后，加入262ml的2M NaOH溶液及含有185g的酒石酸钠溶液(适当用热水进行溶解)，再分别加入5g的苯酚和无水硫酸钠，搅拌溶解后转移入1000ml棕色容量瓶进行定容，充分混合，静置一周后方可使用。
标准曲线的制作：分别移取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL及1.0mL的葡萄糖标准溶液于50mL的离心管中并加超纯水补至2.0mL，再加入2.0mL DNS试剂，混合摇匀，置于沸水中孵育5min后取出，静置冷却至室温，加超纯水补至25mL，充分摇匀，利用紫外分光光度计测定溶液的OD540，并绘制标准曲线。
1.1.2樟树籽仁多糖的体外模拟消化
1.1.2.1樟树籽仁多糖模拟胃液的抗消化性分析
用5M HCl分别将SGF的pH值调整为1、2、3、4和5。随后，将5.0mL CCSKP、CCSKP1-A和FOS溶液(10mg/mL)分别与5mL不同pH值的SGF混合。混合物在37℃的震动培养箱中孵育6小时(130rpm)。分别在0、1、2、4、6h测定混合物的还原糖和总糖含量。还原糖的测定采用DNS方法，总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法。根据下述公式计算样品的水解度。
其中，T0是最初的还原糖质量，Ti是指某时间点取样测得的还原糖质量与最初的还原糖质量之差。
1.1.2.2樟树籽仁多糖对α-淀粉酶的抗消化性分析
分析樟树籽仁CCSKP和CCSKP1-A样品对α-淀粉酶的抗性，并以FOS为阳性对照组。首先将20mgα-淀粉酶溶解于500ml磷酸钠缓冲液(20mM，pH7.4)中制备2U/ml的酶液，调整pH值分别为5、6、7和8。然后分别取5mLCCSKP和CCSKP1-A的磷酸钠缓冲液溶液(10mg/mL)与5mL不同pH的酶溶液混合。最后，将得到的不同pH的混合溶液在37℃的水浴锅中孵育6h，并分别在反应时间为0、1、2、4和6h时取出样品，按上述公式(3-1)确定水解程度。
1.1.3樟树籽仁多糖对体外益生菌的增殖作用
1.1.3.1菌种活化
将长歧双歧杆菌(B.longum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)四种冻干菌粉溶于1.0％无菌蛋白水溶液中，分别接种于121℃灭菌20min的活化培养基中。菌株在37℃下连续培养两代48h获得。培养条件为37℃厌氧条件下(85％N2，10％CO2和5％H2)使用厌氧室进行培养菌种。
1.1.3.2樟树籽仁多糖对体外益生菌的增殖作用
研究在CCSKP、CCSKP1-A和FOS存在下，对益生菌(长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌)的生长特征。通过测量600nm光密度(OD600)测量细菌浓度来评估CCSKP、CCSKP1-A及FOS的细菌生长情况，发酵48h后确定培养基的pH值。首先取适量试管，分别装入10ml液体培养基，然后分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0及3.0％CCSKP、CCSKP1-A和FOS，微热溶解。然后，在4000r/min下离心10min。取上清液配置成增殖培养基。培养基于121℃下灭菌20min，按照5％的比列接种已活化的四种菌种，在37℃下恒温厌氧培养48h之后。测定各培养液在DO600及培养基pH。
1.1.3.3樟树籽仁多糖对益生菌的生长速率的影响
在无糖MRS培养基中分别加入了2％(w/v)多糖样品，再接种2％(v/v)益生菌悬液在37℃下厌氧培养48h。分别在0h、6h、12h、24h、30h、36h和48h取样，测定培养液的OD600值及pH，并绘制四种有益菌在添加CCSKP、CCSKP1-A和FOS的培养基的生长曲线，考察樟树籽仁多糖对嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌及青春双歧杆菌的生长速率的影响。
1.1.4樟树籽仁多糖对益生菌发酵产生短链脂肪酸的影响
在无糖MRS培养基中加入2％(w/v)不同的碳源，然后接种2％(v/v)益生菌悬液培养物在37℃下厌氧培养48h。发酵完成后，将发酵培养物以4000rpm离心20min，上清液经0.22μm膜过滤后进行气相分析(GC)。
色谱分析条件为：采用Agilent 7890A气相色谱系统，配备DB-WAX色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)和火焰电离检测器(FID)。载气(氮气)流量5mL/min；空气、氢气和氮气在检测器中的流速分别为400、30和30mL/min；进样量0.5μL；注射器温度250℃；探测器温度260℃；升温程序为初始温度90℃保持0.5min，以3℃/min的速度提高到140℃，然后以4℃/min的速度升温到250℃。本研究采用乳酸测定试剂盒，按照试剂盒说明书中的步骤测定乳酸含量。
1.2数据处理及分析
本实验中所得到的数值均表示为平均值±标准偏差。采用SPSS22.0对实验进统计学分析，显著性差异表示方法详见各图注或表注。采用Origin Pro 9.0软件进行图表的处理。
1.3结果与分析
1.3.1樟树籽仁多糖模拟胃酸的抗消化性
樟树籽仁多糖CCSKP、CCSKP1-A及FOS在不同pH值的模拟胃液中分析水解程度分别如图9、图10和图11所示，可以看出，樟树籽仁多糖CCSKP、CCSKP1-A及FOS对模拟胃液水解度随水解时间的增加而逐渐增大，这是由于长时间的反应有利于多糖在酸性条件下被水解为单糖和双糖。pH对多糖的水解度有显著的影响，在pH较低时多糖的水解程越大。在pH值为1～5孵育6h后，FOS的水解度分别为2.13±0.08％、1.75±0.04％、1.40±0.06％、1.18±0.08％、1.07±0.06％；CCSKP水解度分别为4.45±0.18％、4.66±0.13％、3.36±0.06％、3.32±0.20％、2.84±0.03％；CCSKP1-A的水解度为1.69±0.03％、1.66±0.03％、1.47±0.05％、1.32±0.02％、1.09±0.03％。在pH为1时孵育了6h后，樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A水解度达到最大值分别4.66±0.13％和1.69±0.03％，这可能是因为多糖CCSKP的分子量分布较为分散，部分多糖在低pH值下的糖苷键结构不稳定容易被分解。樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A在模拟胃液中的最大水解度均小于5％，说明CCSKP和CCSKP1-A在胃酸中具有较好的稳定性，可能都能够到达肠道。CCSKP和CCSKP1-A对模拟胃液的抵抗性均超过95％，这意味着它们可以被视为潜在的益生元。
1.3.2樟树籽仁多糖对α-淀粉酶的抗消化性
CCSKP、CCSKP1-A及FOS在不同pH值的α-淀粉酶水解抗性变化分别如图12、图13和图14所示，可以看出，水解时间和pH值对樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A的水解程度均有显著影响，随着孵育时间延长樟树籽仁多糖的水解度增大。在pH＝7时孵育6h后CCSKP和CCSKP1-A的水解度最大值分别为5.90±0.13％和5.74±0.23％，略高于FOS的3.56％，表明两种CCSKP对α-淀粉酶具有较高的抗性，樟树籽多糖CCSKP及CCSKP1-A能够很好耐受上消化道的消化，到达大肠被肠道菌群利用。此外，两种样品的水解率无显著性差异(p>0.05)，说明两种CCSKP样品对α-淀粉酶的抗性没有受到本研究中使用的纯化过程的影响，这种强烈的酶抗性可能是由于樟树籽仁多糖分子内β型糖苷键的配置。
1.3.3樟树籽仁多糖对益生菌的增殖作用
为了研究樟树籽仁多糖对益生菌生长繁殖的影响，进行了浓度依赖性分析和酸化活性研究。采用樟树籽仁多糖CCSKP、CCSKP1-A作为唯一的碳源的培养基对双歧杆菌和嗜酸乳酸菌进行厌氧培养，并以FOS为对阴性或阳性照，无糖MRS培养基中CCSKP、CCSKP1-A和FOS对无糖MRS培养基中不同益生菌的生长增殖和培养液基pH的影响，见图15、图16、图17、图18所示。图15～图18所示益生菌分别为嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌；a、b、c、d、e、f代表的是相同颜色的每一列显著差异(n＝3)。
显然，CCSKP、CCSKP1-A和FOS在孵育48h后，四株益生菌的增殖效果均显著高于空白对照，说明益生菌可以利用樟树籽仁多糖CCSKP、CCSKP1-A作为碳源，促进自身生长增殖。对于嗜酸乳酸菌(图15)，随着CCSKP、CCSKP1-A及FOS浓度的增加，嗜酸乳杆菌OD600值也逐渐升高，在3％浓度时FOS对嗜酸乳杆菌的增殖刺激作用最强，其次为CCSKP和CCSKP1-A(p<0.05)。同样，CCSKP和CCSKP1-A在测试浓度范围内对长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌均有正向生长作用(图16-18)。然而，随着FOS浓度从1.5％增加到3.0％，长歧双歧杆菌的OD600值随之显著降低(p<0.05)，在FOS和CCSKP浓度为2.0％～3.0％时对青春双歧杆菌的OD600值均有负向影响。总体而言，FOS对嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌的增殖作用最为明显，其次为CCSKP(p<0.05)。
如图15-18所示，CCSKP、CCSKP1-A和FOS样品均提高了被测益生菌的酸化活性(p<0.05)，其中，添加CCSKP的培养基pH值呈下降趋势，相对于添加CCSKP1-A的培养基效果更好。上述结果表明，四种益生菌对CCSKP和CCSKP1-A的培养基消耗效率不同，导致pH值降低程度不同。然而，对于所有测试菌株，添加FOS的培养基增殖效果及酸化情况较好，该结果与巨球藻多糖一致。这种效应可能与不同生长介质中消化底物的多种代谢途径有关，可能是因为菌株会优先选择较为简单的单糖组成作为碳源，进行代谢分解产生更多的有机酸。
总的来说，pH值的下降反映了益生菌能够利用樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A作为碳源，从而代谢产生了一些短链脂肪酸，因此培养基pH值不可避免地下降。综上所述，四种测试菌株的增殖效应和酸化活性结果表明CCSKP和CCSKP1-A是一种潜在的益生元，但CCSKP表现出比CCSKP1-A更强的益生特性。
1.3.4樟树籽仁多糖对益生菌的生长速率
为了考察樟树籽仁多糖对嗜酸乳酸菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌生长速率的影响，将菌株接种于分别添加2％(w/v)样品的培养基中，37℃厌氧培养，在不同时间点测定培养基的吸光度值和pH值，绘制菌株的生长曲线，结果见图19、图20、图21、图22所示。CCSKP、CCSKP1-A及FOS对益生菌的生长速率影响；图19：嗜酸乳杆菌、图20：长歧双歧杆菌、图21婴儿双歧杆菌、图22：青春双歧杆菌；
由图19～22可以看出CCSKP、CCSKP1-A及FOS对四种菌株的生长和增殖均有促进作用。在添加CCSKP的培养基中，嗜酸乳杆菌培养24h后，OD600值达到最大值(0.97±0.03)，pH值降低至最小值(4.78±0.04)；长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌在CCSKP的培养基中均培养30h后进入稳定期；继续增加培养时间，培养基中的细菌数和pH基本保持不变。而在添加CCSKP1-A的培养基中，嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌分别在培养24h、30h、30h及36h后进入稳定期；嗜酸乳杆菌培养30h后，OD600值达到最大值(0.43±0.04)，pH值降低至最小值(5.33±0.02)。在相同时间下，添加FOS的培养基中，益生菌对FOS的适应性好于樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A，益生菌的OD600值均更大，相应的pH值较低。总而言之，CCSKP、CCSKP1-A及FOS培养基随着时间延长培养基吸光度值随之增加和pH相应降低，说明了益生菌能够利用CCSKP、CCSKP1-A及FOS促进自身的生长繁殖，同时产生酸性代谢产物。然而，在相同浓度的CCSKP和CCSKP1-A培养下，在CCSKP培养基下的益生菌菌数达到稳定期的时间由30-36h，缩短到24～30h，这说明CCSKP1-A对益生菌的促进作用要比CCSKP较弱。以上结果可以证实樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A是一种潜在的益生元。
1.3.5樟树籽仁多糖对益生菌发酵产生短链脂肪酸的结果
短链脂肪酸是益生菌代谢的主要终产物，短链脂肪酸的水平不仅可以反映益生菌的增殖活性，还可以反映益生菌对樟树籽仁多糖CCSKP、CCSKP1-A及FOS的利用率情况。结果如表1所示，体外发酵培养48h后樟树籽仁多糖CCSKP、CCSKP1-A及FOS的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸浓度均显著高于对照组(p<0.05)，说明在一定程度下樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A能够促进SCFAs的产生，即CCSKP及CCSKP1-A组分可以被嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌利用或发酵作为碳源。此外，在测试益生菌发酵48h期间，CCSKP、CCSKP1-A和FOS均显著提高了SCFAs的浓度，尤其是乙酸和乳酸浓度(p<0.05)，而丙酸与丁酸的无显著差异(p>0.05)。此外，观察到FOS组的总SCFAs浓度显著高于樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A的总SCFAs浓度(p<0.05)，且CCSKP1-A组的总SCFAs浓度均低于CCSKP组(p<0.05)，培养基所产生的SCFAs总浓度顺序为FOS>CCSKP>CCSKP1-A。该结果与体外增殖实验结果一致，CCSKP表现出比CCSKP1-A更强的增殖作用，但不如FOS。
表1不同碳源的液体培养基的短链脂肪酸分布
注：(Aa：醋酸；Pa：丙酸；Ba：丁酸；La：乳酸)；Control：无碳源培养(无糖MRS基培养基)；abcdefg表示同一列有显著差异(p<0.05)；ABCD在同一行差异显著(p>0.05)；平均值±SD(n＝3)。
1.4本章小结
1、樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A的抗消化性研究。结果发现CCSKP和CCSKP1-A在pH1～5的模拟胃液中水解6h后最大水解度分别为4.66±0.13％和1.69±0.03％，α-淀粉酶的最大水解度分别为5.90±0.13％和5.74±0.23％，表明两者均能够较好地抵抗胃酸和α-淀粉酶的水解，不易被消化。
2、樟树籽仁多糖CCSKP及CCSKP1-A对益生菌的体外增殖作用研究。结果发现CCSKP和CCSKP1-A对嗜酸乳杆菌、长歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌的增殖效果在厌氧培养48h后均显著高于空白对照，表明两者对益生菌株的生长和增殖均有促进作用，但CCSKP对益生菌的促进作用更强。
3、考察樟树籽仁多糖CCSKP和CCSKP1-A对测试菌株的生长速率及培养基的pH变化影响。结果发现嗜酸乳酸菌在含有樟树籽仁多糖的培养基中培养24h后OD600值达到最大值，三株双歧杆菌在培养时间均在32～36h达到最大生长量。此外，益生菌对CCSKP的适应性更好。
4、考察了樟树籽仁多糖CCSKP、CCSKP1-A对益生菌发酵产生短链脂肪酸的影响。结果发现CCSKP、CCSKP1-A对四株益生菌发酵产生乙酸、丙酸钠、丁酸和乳酸，其中主要为乙酸和乳酸，以乙酸最多。表明了四株益生菌能够利用CCSKP和CCSKP1-A组分促进自身增殖并产生有机酸，是一种潜在的益生元。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本申请进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本申请的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，其均应涵盖在本申请请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种樟树籽仁多糖，其特征在于，所述樟树籽仁多糖包括以下单糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和盐酸氨基葡萄糖，且摩尔比为(0.88～0.92)：(0.06～0.1)：(0.015～0.02)：(0.003～0.004)：(0.003～0.004)；
所述樟树籽仁多糖的重均分子量为1000Da～20000Da。
2.根据权利要求1所述樟树籽仁多糖，其特征在于，所述樟树籽仁多糖的重均分子量为4000Da～15000Da；
所述多糖的平均粒径为350nm～1200nm。
3.根据权利要求1所述樟树籽仁多糖，其特征在于，所述樟树籽仁多糖是将樟树籽仁水酶法提取樟树籽仁油的水相进行脱蛋白、脱色得到脱色后溶液，对脱色后溶液进行浓缩、醇沉、透析、冻干得到樟树籽仁多糖CCSKP。
4.根据权利要求3所述樟树籽仁多糖，其特征在于，将樟树籽仁多糖CCSKP采用阴离子交换色谱柱分离后采用葡聚糖SephadexG-50凝胶吸附法纯化得到樟树籽仁多糖CCSKP1-A。
5.根据权利要求3所述樟树籽仁多糖，其特征在于，所述樟树籽仁多糖CCSKP为多分散性的多糖-蛋白复合物：
总糖、蛋白及糖醛酸含量分别为64.70±1.27％、11.33±1.12％和9.45±0.33％，平均分子量为14080Da、7934Da、5361Da；
单糖组成中葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖及盐酸氨基葡萄糖的摩尔比为0.911：0.065：0.018：0.004：0.003；
粒径为354.85nm，Zeta电位值-4.64mV。
6.根据权利要求4所述樟树籽仁多糖，其特征在于，所述樟树籽仁多糖CCSKP1-A为中性多糖：
总糖含量为89.50±0.46％，蛋白含量为3.15±0.54％；
单糖组成中葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖及盐酸氨基葡萄糖的摩尔比为0.883：0.094：0.016：0.003：0.004；
粒径为1158.00nm，Zeta电位值-0.03mV。
7.一种权利要求1～6任一项所述的樟树籽仁多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用高速粉碎机研磨樟树籽仁，加入蒸馏水将其配成体积比为1：6的悬浮液，调节pH为5.0～6.0，再加入纤维素酶使其配置成3000U/ml的溶液，在55℃的恒温水浴锅中加热2h，高温灭酶10min后，离心收集上清液，将收集的上清液置于4℃冰箱12h，进一步除去游离油；
(2)脱蛋白及脱色：向处理后的水相中加入重量体积百分数2％的木瓜蛋白酶，在55℃酶解2h，经高温灭酶10min后，离心去除沉淀，收集上清液，向上清液加入预处理活化的重量体积百分数10％AB-8大孔树脂，在40℃的摇床中脱色1h，减压抽滤除去大孔树脂，收集脱色后溶液；
(3)乙醇沉淀：用旋转蒸发器在60℃下将脱色后溶液浓缩至原体积的25％，收集浓缩液，加入3倍体积的无水乙醇置于4℃的冰箱进行过夜，离心去掉上清液，向沉淀组分加入适当的蒸馏水进行复溶；
(4)透析除杂：将上述收集到的樟树籽仁多糖溶液置于1000Da透析袋中进行流水透析1～2天，透析完成后，浓缩冷冻干燥即获得樟树籽仁多糖CCSKP。
8.根据权利要求7所述的樟树籽仁多糖的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
(5)DEAE-52纤维素阴离子交换法分离
预处理：将称取的DEAE-52纤维素，进行碱-酸-碱的预处理，最后再取适量的蒸馏水清洗DEAE-52纤维素3～4次直至pH为7.0～7.4；
配制10mg/mL樟树籽仁多糖CCSKP水溶液，多糖溶液过0.45μm的滤膜，将CCSKP溶液逐滴加入到预先装好的阴离子交换色谱柱，并以0～0.5mol/L的梯度NaCl溶液为洗脱剂进行洗脱，设置流速为1mL/min，以10min/管的速度自动收集流出的洗脱液，每个梯度的洗脱液收集30管，在OD490nm处测量其吸光值，并绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线进行透析、浓缩并进行真空冷冻干燥得到樟树籽仁多糖组分CCSKP1、CCSKP2、CCSKP3；
(6)葡聚糖SephadexG-50凝胶吸附法纯化
精确称取樟树籽仁多糖组分CCSKP1配置成10mg/ml的多糖溶液，用0.45μm滤头过滤后，将其加到葡聚糖SephadexG-50凝胶柱上，以超纯水为洗脱剂进行洗脱，洗脱液分管自动收集，设置流速为0.2mL/min，4mL/管，收集洗脱液直至多糖全部流出才结束，测量其吸光值并绘制葡聚糖凝胶洗脱曲线，合并收集，进行浓缩，冷冻干燥，得到樟树籽仁多糖组分CCSKP1-A。
9.权利要求1～6任一项所述樟树籽仁多糖在制备促进益生菌增殖作用的食品、保健品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述益生菌为嗜酸乳杆菌Lacrobacillusacidophilus、长歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、婴儿双歧杆菌Bifidobacteriuminfantis和青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis中至少一种。
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