CN114230682B - 一种功能性香蕉多糖bpf2及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品、医药化工技术领域，具体公开了一种功能性香蕉多糖BPF2的制备方法，包括以下步骤：S1、将香蕉果肉打浆，使用体积浓度≤15％乙醇水溶液提取；S2、采用体积浓度≥95％的乙醇沉淀多糖；S3、对S2得到的多糖进行纯化，得到香蕉多糖BPF2。本发明还公开了上述制备方法获得的香蕉多糖BPF2，以及香蕉多糖BPF2在制备药品或食品上的应用。本发明提供的香蕉多糖BPF2对羟自由基、超氧阴离子自由基的清除能力和总抗氧化能力显著；能显著激活RAW264.7细胞的增殖活性和吞噬活性，诱导并促进抑炎细胞因子分泌，能够抑制炎症反应；能够通过抑制人视网膜色素上皮细胞ARPE‑19迁移，降低ARPE‑19细胞VEGF和ICAM‑1的表达，缓解视网膜病变。

Description

一种功能性香蕉多糖BPF2及其制备与应用
技术领域
本发明属于食品、医药化工技术领域，尤其涉及一种功能性香蕉多糖BPF2及其制备与应用。
背景技术
香蕉，属巴蕉科(Musaeae)巴蕉属(musa)，为草木果树。我国的香蕉资源丰富，食用和药用价值极高，目前对香蕉的研究开发主要集中在香蕉的生产和粗加工上，如香蕉饮料、香蕉酒和香蕉干等，对于香蕉的活性研究还较少。
香蕉多糖是存在于成熟香蕉中的一种含量较高的可溶性多糖物质，目前已有文献报道其具有一定的免疫调节作用，能够促进肠道有益菌的增殖，具有调节胃肠道健康和缓解疾病等功效。目前，越来越多的人由于工作和生活压力、快节奏的饮食作息而引起一些亚健康状态，例如代谢功能失衡、眼睛疲劳、视力受损和身体加速衰老等，这些亚健康状态的产生不仅会降低人们的生活质量，也可能是引起某些重大疾病的根源所在，所以研究香蕉多糖并基于其开发的产品，具有广阔的市场前景。
Yang,J等人(Yang,J,et al.,Identification of an immunostimulatorypolysaccharide in banana,Food Chemistry(2018))根据(Tong,et al.,2016；65Ye,etal.,2018)的文献报道对香蕉多糖进行提取，具体步骤如下：将香蕉果肉用80％(v/v)的乙醇水溶液提取，去除可溶于乙醇的化学物质，按重量将十倍的水加入到粒料中。在60℃孵育6h后，收集并浓缩上清液。加入乙醇至终浓度为60％，在4℃的冰箱中孵育过夜以沉淀粗多糖。第二天将粗多糖重新溶解，添加相同体积的Sevag试剂(氯仿/丁醇＝4:1,v/v)。保持烧瓶摇晃30min以去除蛋白质。使用装有DEAE Sepharose Fast Flow的中压玻璃柱(15×460mm)进行纯化。装入10mL 30mg/ml多糖进行洗脱，洗脱方法为：用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗脱80min，然后用NaCl溶液(0.2和0.8M NaCl，每个梯度80min)梯度洗脱，流速为4.0mL/min。采用磷酸盐缓冲液洗脱的部分通过Sephadex G-100柱(15×460mm)进行进一步纯化。装载2mL 30mg/mL的多糖。磷酸盐缓冲液(150mL)用作洗脱溶剂，流速为0.5mL/min。收集主峰，浓缩，冻干得到香蕉多糖NBPP，经鉴定为α-(1→6)-D-葡聚糖，分子量>2990KD。
Wei Guo等人分离纯化的香蕉多糖BPA为以β-D-(1→6)-半乳聚糖为骨架的阿拉伯半乳聚糖，该阿拉伯半乳聚糖由三种单糖组成，包括Ara(阿拉伯糖)、Gal(半乳糖)和GlcA(葡萄糖酸)，摩尔比为5.8:5.9:1.0，分子量测定为526.2KD。
上述文献报道的分离纯化方法或得到的香蕉多糖存在以下问题：通过过柱对香蕉多糖分离纯化，步骤较为繁琐；获得的香蕉多糖分子量范围较大，不均一；去除多糖中蛋白杂质采用是Sevag试剂(Sevag方法)，所用的有机试剂毒性大且操作复杂，不适用于食品、药品及保健品的生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种功能性香蕉多糖BPF2及其制备与应用，以至少解决上述技术问题之一。
本发明的目的之一在于提供：一种功能性香蕉多糖BPF2的制备方法，包括以下步骤：
S1、将香蕉果肉打浆，使用体积浓度≤15％乙醇水溶液提取；
S2、采用体积浓度≥95％的乙醇沉淀S1得到的多糖，得到多糖沉淀；
S3、对S2得到的多糖进一步纯化，得到香蕉多糖BPF2。
优选地，S1中还使用弱碱性阴离子大孔树脂吸附多糖中的蛋白和色素杂质，过滤除去吸附杂质后的弱碱性阴离子大孔树脂。
优选地，S1中，在80-95℃热水浴中使用体积浓度≤15％乙醇水溶液提取。
优选地，S1中，提取时，香蕉果肉打浆得到的香蕉浆和乙醇水溶液的料液比为1:(10-30)。
优选地，S3采用10-100KD超滤管和分子量为3500Mw透析袋对多糖进行纯化。
本发明的目的之二在于提供：根据上述制备方法得到的功能性香蕉多糖BPF2。
优选地，电镜扫描表面分布大量规律性褶皱。
优选地，包括葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖和木糖。
优选地，甘露糖和半乳糖醛酸所占百分比和≥30％。
本发明的目的之三在于提供：上述香蕉多糖BPF2在制备药品或食品上的应用。
本发明的原理和有益效果在于：
(1)本发明提供的香蕉多糖命名为“香蕉多糖BPF2”。
本发明提供的香蕉多糖BPF2分子量小，分子量范围窄，水溶性强，通过电镜扫描结果显示其表面分布大量规律性褶皱。
与现有文献分离纯化的香蕉多糖相比，本发明提供的香蕉多糖BPF2的相对分子质量为193607道尔顿，分子量较低，并且与之前文献报道的香蕉多糖的分子结构不同，具体地，本发明提供的香蕉多糖BPF2包括葡萄糖(GLC)、半乳糖醛酸(GalUA)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)和半乳糖(Gal)，其中主要单糖构成为葡萄糖(GLC)、半乳糖醛酸(GalUA)和甘露糖(Man)。
(2)本发明提供的香蕉多糖BPF2具有十分显著的生物活性，无毒无害，且对细胞的生长无抑制活性，因而具备被开发为保健功能性食品和药物的前景。
本发明提供的香蕉多糖BPF2在以下三个方面具有显著生物活性：
①具有显著的抗氧化活性：本发明提供的香蕉多糖BPF2具有显著的对超氧阴离子自由基的清除活性、对羟自由基的清除活性和总抗氧化能力。
②在免疫调节活性更强：与Yang等报道(Yang JL,Tu JM,Liu HL,etal.Identification of an immunostimulatory polysaccharide in banana[J].Foodchemistry,277:46-53.)的香蕉多糖NBPP相比，在相同质量浓度下诱导RAW264.7细胞对TNF-α的分泌能力更强，并且具有对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型炎症的抑制作用，通过降低小鼠单核巨噬细胞RAW264.7一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达，升高NF-κB p65、ERK、MyD88和p38 mRNA的表达，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞促炎因子IL-6等的分泌。
③在缓解视网膜病变方面：本发明提供的香蕉多糖BPF2能够显著抑制人视网膜色素上皮ARPE-19细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的分泌，同时降低ICAM-1的mRNA表达，有效修复视网膜病变引起的血-视网膜屏障损伤，起着缓解视网膜病变的功效。
基于以上三个方面的显著生物活性，本发明提供的香蕉多糖BPF2能够作为保健功能性食品的原材料被开发和利用，用于生产提升免疫、抗氧化抗衰老、预防视网膜病变等相关的药品或功能性食品，对于由不良生活习惯诱发的亚健康症状均会有显著改善效果。
(3)不同的制备方法所得到的香蕉多糖BPF2的成分和结构不同，采用本发明所述制备方法可制得具有显著生物活性的香蕉多糖BPF2。本发明所采用的提取香蕉多糖BPF2方法与传统热水浸提不同，传统方法(例如用纯水提取)提取的多糖分子量范围大，本发明采用体积浓度范围≤15％乙醇水溶液提取，除去香蕉果肉中分子量过大的粘性多糖组分，提升多糖的纯度。分子量过大部分的多糖往往带有较大的色素杂质，降低所需多糖组分中含有的色素，对于后续进一步分离纯化得到本发明所述的香蕉多糖BPF2十分关键。
附图说明
图1是香蕉多糖BPF2使用BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)和示差检测器RI-10A检测的分子量图谱；
图2为香蕉多糖BPF2的190nm-800nm紫外全波长扫描图；
图3为香蕉多糖BPF2在100、300、1000倍扫描电镜下的微观图像；
图4为依据FRAP法测得的香蕉多糖BPF2、香菇多糖、虾青素在物质的量浓度依次为5.17*10-3、1.03*10-2、2.06*10-2μmol/mL时的总抗氧化能力；
图5为香蕉多糖BPF2、香菇多糖、虾青素物质的量浓度依次为5.17*10-3、1.03*10-2、2.06*10-2μmol/mL时对超氧阴离子自由基的清除活性；
图6为香蕉多糖BPF2、香菇多糖、虾青素物质的量浓度依次为5.17*10-3、1.03*10-2、2.06*10-2μmol/mL时对羟自由基的清除活性；
图7为香蕉多糖BPF2样品对RAW264.7细胞活性的影响；
图8为香蕉多糖BPF2样品对RAW264.7细胞吞噬活性的影响；
图9-13为香蕉多糖BPF2在25-400μg/mL浓度范围内对小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌NO和细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-γ的影响；
图14为香蕉多糖BPF2干预后细胞内NF-κB通路关键基因的mRNA表达情况；
图15为香蕉多糖BPF2对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19的VEGF、ICAM-1、p38、NF-κB p65mRNA表达的影响。
图16为葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1：一种功能性香蕉多糖BPF2的制备方法
具体包括以下步骤：
S1、提取：将香蕉果肉打浆，在80-95℃(本实施例优选90℃)热水浴中使用体积浓度≤15％乙醇水溶液以料液比(香蕉果肉打浆得到的香蕉浆的质量和乙醇水溶液的体积比)为1:(10-30)搅拌浸提2h，过滤除渣且将滤液回收。以上浸提过程重复2次，将浸提液与滤液混合。以8000rpm/min离心10min除去多余杂质和蛋白，在旋转蒸发仪温度60℃、转速140r/min条件下浓缩浸提液与滤液。
本实施例优选提取时，香蕉果肉打浆得到的香蕉浆和乙醇水溶液的料液比为1:30。
本实施例所用的相应体积浓度的乙醇水溶液均采用AR分析纯乙醇和超纯水按体积配置得到，具体可以购买自西陇科学股份有限公司，CAS：64-17-5。
将预处理好的D301R弱碱性阴离子大孔树脂放入三角烧瓶中，加入多糖溶液，多糖:弱碱性阴离子大孔树脂体积＝1:(1-3)，(140-155)r/min，(40-55)℃条件下，在恒温摇床中恒温震荡静态吸附多糖中的蛋白和色素杂质，过滤除去吸附杂质后的弱碱性阴离子大孔树脂，本实施例所采用的D301R弱碱性阴离子大孔树脂可以购买自天津南开大学。
本实施例优选的恒温震荡吸附条件为多糖:弱碱性阴离子大孔树脂体积比＝1:1.5，150r/min，45℃。
S2、分离：将经过S1处理的多糖溶液，通过恒流蠕动泵恒流滴入体积浓度≥95％的乙醇至乙醇体积浓度在多糖溶液中占比为0～25％，利用S1中离心条件除去这部分多糖组分后，在上清液中继续滴入体积浓度≥95％的乙醇至乙醇体积浓度在多糖溶液中占比为25～55％。将沉淀加入超纯水复溶，通过旋转蒸发仪除去乙醇，冷冻干燥后得到絮状粗糖粉末。
S3、使用分子截留为10-100kD超滤管(Millipore公司，货号：UFC905096)和分子量为3500Mw透析袋(上海吉至生化科技有限公司，货号：YA1077)纯化，冷冻干燥得到香蕉多糖BPF2。
具体地，称量1mg絮状粗糖粉末溶于1mL超纯水中经过透析袋纯化处理后，真空浓缩，冷冻干燥后，加入超纯水复溶，经100KD超滤管4000g离心10min后收集滤膜下部液体，后经10KD超滤管离心收集上部液体纯化后，装入经过处理的3500Mw透析袋中进行透析3天。通过图1发现，经纯化后的多糖出现在36.051min时，色谱峰峰型较好且对称，基本符合均一多糖的要求。
目前文献常采用过柱方法分离多糖，过柱操作步骤繁琐，多糖损耗大，不利于大规模生产。与分离多糖所采用的过柱方法不同，本实施例中，S1提取时，通过乙醇沉淀的多糖部分为分子量过大的组分，通过离心去除，接着采用乙醇分级沉淀进行分离，免去了需要通过离子柱纯化多个组分多糖的步骤，操作简便，得率高，且使用该方法能够得到分子量较为均一的多糖组分。
目前文献报道的去除多糖中蛋白杂质主要是采用Sevag方法，所用试剂毒性大且操作复杂，不适用于食品、药品及保健品的生产。
本实施例提取后，进一步加入乙醇沉淀，当乙醇在多糖溶液中体积比为25～55％区间时，将沉淀的组分离心，通过超滤去除分子量大于100KD的蛋白和多糖组分，同时除去分子量小于10KD的多糖组分和寡糖，经过透析除去分子量小于3500Mw的盐等杂质，并最终得到本发明所述的香蕉多糖BPF2。
实施例2-5
与实施例1相比，实施例2-5制备香蕉多糖BPF2的主要区别如下表1所示：
表1实施例1-5制备香蕉多糖BPF2的步骤区别
Figure GDA0003520804280000051
表征实验1：单糖组成分析
GC色谱条件：色谱系统采用的是Thermo ICS5000+离子色谱系统(ICS500+，ThermoFisher Scientific，USA)，采用DionexTMCarboPacTMPA20液相色谱柱，进样量为20μL。流动相A(H2O)，流动相B(100mM NaOH)，柱温为30℃，利用电化学检测器对单糖组成进行分析。
实验结果：香蕉多糖BPF2主要由葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖、甘露糖组成，具体组分如下表2所示：
表2香蕉多糖BPF2的组分
Figure GDA0003520804280000061
由表3可以看出，香蕉多糖BPF2包括葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖和木糖，实施例1-5制得的香蕉多糖BPF2的组分相似，并且甘露糖和半乳糖醛酸质量所占百分比和≥30％。
表征实验2：香蕉多糖BPF2纯度测定
由于多糖已经过透析等纯化步骤，因而其不含有葡萄糖等小分子量还原糖。因而采用苯酚-硫酸法(苯酚：西陇科学股份有限公司，CAS：108-95-2，AR分析纯；硫酸：广州化学试剂厂，批号：20180905-1，纯度98.08％)进行检测即可得到粗多糖含量。称取实施例1制得的香蕉多糖BPF2样品1mg溶于100mL蒸馏水制成待测液，取1.0mL待测液于25mL比色管中，补加蒸馏水至2.00mL，再加入5％苯酚溶液1mL，混合摇匀后迅速加入5.00mL浓硫酸，沸水浴30min，静置冷却，以不加葡萄糖标准溶液的管为空白，于490nm波长处测吸光度值，待测液做五个平行组。实施例1制得的香蕉多糖BPF2按照葡萄糖(北京索莱宝科技有限公司，货号：G8150)标准曲线计算多糖含量。
如图16所示，将多糖BPF2检测吸光度值代入曲线计算得到BPF2中的多糖含量为0.86mg/mg。
表征实验3：香蕉多糖BPF2分子量测定
GPC色谱条件：精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μL；检测器：示差检测器RI-10A。实验结果如下表3所示：
表3多糖BPF2的平均分子量
Sample ID RT(min) lgMp lgMw lgMn Mp Mw Mn 峰面积比％
36.051 5.2 5.3 5.1 143395 193607 117284 100
另外，通过多角度激光光散射仪检测分析得到的香蕉多糖BPF2具有似球状螺旋结构。
表征实验4：紫外光谱分析
称取实施例1制得的香蕉多糖BPF2样品5mg，用蒸馏水溶解，配制成浓度为1mg/mL的多糖溶液，以蒸馏水为对照，190～800nm波长范围内进行扫描分析。
紫外扫描结果如图2所示，在200nm处有强吸收峰，在260和280nm处无特征吸收峰。
表征实验5：红外光谱分析
称取实施例1制得的香蕉多糖BPF2样品2mg，加入适量已干燥溴化钾(KBr)粉末，研磨均匀压片，使用FT-IR仪器400～4000cm-1区间内进行扫描分析。
实验结果如下：在3384cm-1处有一个密集和宽的峰，是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰，表明香蕉多糖BPF2存在自由羟基。在2927cm-1处的弱吸收带为糖环的C-H伸缩振动。在1754cm-1处的吸收峰表明，多糖含有酯羰基(COOR)基团。在1631cm-1处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。1236cm-1处的吸收带是由S＝O的伸缩振动引起的，这表明该多糖中含有磺酸基团。在1066cm-1处是醚C-O-C中C-O键的伸缩振动；在917cm-1处的吸收峰是糖类分子振动的特征吸收峰，是呋喃环的A型吸收峰，由呋喃环对称伸缩振动造成。
表征实验6：扫描电镜SEM
称取实施例1制得的干燥后香蕉多糖BPF2样品5mg，粘附于含有双面粘合剂的导电碳膜上，置于离子溅射仪(MC1000型离子溅射仪(HITACHI公司，日本))样品舱中，进行喷金40s左右。样品取出后，置入扫描电镜(SU8100型扫描电子显微镜(HITACHI公司，日本))观察室，加速电压为2KV，进行观察。
实验结果如图3所示：100倍扫描电镜下，多糖样品呈块状形态，表面呈褶皱状，无孔隙；300倍扫描电镜条件下，多糖表面褶皱结构被放大，未发现孔隙，质地较为密集；1000倍扫描电镜条件下，多糖呈现致密的褶皱状态，可能是由于结合水导致。
活性实验1-香蕉多糖BPF2体外抗氧化活性的检测
(1)使用总抗氧化能力(FRAP法)试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司，货号：FRAP-1-G)对相同质量摩尔浓度下的香蕉多糖BPF2样品(200-1000μg/mL)、香菇多糖(购买于标准物质中心网，CAS NO 37339-90-5，纯度98％)、虾青素(购买于sigma，≥97％HPLC,fromBlakeslea trispora)和阳性对照Vc溶液(0.1-1.0mg/mL)的总抗氧化能力进行测定。
总抗氧化能力(采用FRAP法)的测定采用苏州科铭生物技术有限公司提供的总抗氧化能力(FRAP法)试剂盒进行检测，测定原理：在酸性环境下，抗氧化物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力反映了总抗氧化能力。按照说明书配置相关实验试剂，在波长593nm下检测空白管和测定管的吸光度值。
总抗氧化能力(μmol Trolox/g鲜重)＝0.8054×(ΔA-0.0134)÷W
式中，ΔA＝A测定-A空白，W：样品质量g。
实验结果如图4所示：依据FRAP法测得的香蕉多糖BPF2、香菇多糖、虾青素在摩尔浓度分别为5.17*10-3μmol/mL、1.03*10-2μmol/mL和2.06**10-2μmol/mL时的总抗氧化能力。结果显示，香蕉多糖BPF2的总抗氧化能力强于相同质量摩尔浓度下的香菇多糖和虾青素。香蕉多糖BPF2的总抗氧化能力随质量浓度增加呈梯度递增，当浓度为2.06**10-2μmol/mL时，香蕉多糖BPF2的总抗氧化能力为369μmol Trolox/g，为相同浓度下香菇多糖总抗氧化能力的2.05倍，为虾青素的1.68倍。
(2)使用羟自由基清除能力试剂盒(苏州格锐思生物科技有限公司，货号：G0125W)对香蕉多糖BPF2、香菇多糖、虾青素在摩尔浓度分别为物质的量浓度依次为5.17*10-3、1.03*10-2、2.06*10-2umol/ml时羟自由基的清除能力进行测定。
羟基自由基(·OH)清除活性测定使用羟自由基清除能力试剂盒(苏州格锐思生物科技有限公司，货号：G0125W)，向反应体系中依次加入9mmol/L FeSO4溶液2mL和9mmol/L水杨酸溶液2mL，再加入不同浓度待测样品溶液2mL，最后加入8.8mmol/L双氧水2mL启动整个反应，37℃水浴恒温反应30min。以蒸馏水为参比，在510nm波长处测定各反应液吸光度值A测定，平行实验三次。以Vc为阳性对照。
羟基自由基清除率(％)＝[A空白－(A测定－A对照)]/A空白×100％
式中，A空白—蒸馏水代替样品溶液的吸光度值；A测定—样品溶液的吸光度值；A对照—蒸馏水代替水杨酸的本底吸光度值。
实验结果如图5所示：图5中香蕉多糖BPF2、香菇多糖、虾青素浓度依次为5.17*10-3μmol/mL、1.03*10-2μmol/mL和2.06**10-2μmol/mL下对超氧阴离子自由基的清除活性。结果显示，香蕉多糖BPF2组对超氧阴离子的抑制活性随质量浓度增加呈梯度升高，香蕉多糖BPF2对超氧阴离子自由基的抑制活性强于相同质量摩尔浓度下的虾青素。在质量浓度为2.06**10-2μmol/mL时，香蕉多糖BPF2的超氧阴离子活力单位检测值为72.92U/g，为相同浓度下虾青素的1.22倍。
(3)测定超氧阴离子自由基(O2·-)清除活性
超氧阴离子自由基(O2·-)清除活性测定使用抑制与产生超氧阴离子自由基(O2·-)测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：A052-1-1)原理：在反应系统中，每升(克)物质在37℃反应40分钟所产生的超氧阴离子自由基相当于1mg的维生素C所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位。
以0.15mg/mL Vc为标准管，双蒸水为对照管，按照说明书加入各试剂后，用漩涡混匀器混匀，置37℃恒温水浴中反应40min，静置10min，分别检测波长550nm下各管的值:
Figure GDA0003520804280000091
实验结果如图6所示：图6为香蕉多糖BPF2、香菇多糖、虾青素浓度依次为5.17*10-3μmol/mL、1.03*10-2μmol/mL和2.06**10-2μmol/mL条件下对羟自由基的清除活性。结果显示，香蕉多糖BPF2对羟自由基清除率随质量浓度增加呈梯度升高，清除活性强于相同摩尔浓度下的虾青素。当质量浓度为2.06**10-2μmol/mL时，香蕉多糖BPF2的羟自由基清除率是46.21％，为相同浓度下虾青素的1.09倍。
综上，本活性实验对香蕉多糖BPF2的总抗氧化能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力进行测定，发现香蕉多糖BPF2具有强还原能力，其总抗氧化能力及对超氧阴离子自由基(O2 ·-)、羟自由基(·OH)均表现出强的清除活性，且呈剂量依赖性。
活性实验2：香蕉多糖BPF2对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的影响
基于小鼠单核巨噬细胞RAW264.7考察香蕉多糖BPF2的免疫调节作用：分别通过ELISA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号：M1020-500T)检测香蕉多糖BPF2干预对RAW264.7细胞增殖、吞噬和分泌促炎、抑炎细胞因子水平的影响。
采用LPS(美国Sigma公司，货号：SMB00704)诱导炎症化细胞，考察香蕉多糖BPF2对LPS诱导的炎症反应的影响：首先使用LPS预刺激RAW264.7细胞4h诱导炎症化细胞，使用香蕉多糖BPF2孵育细胞，通过荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹技术对下游免疫通路基因mRNA表达水平的变化进行检测，探究香蕉多糖BPF2发挥炎症抑制作用的分子机制。
(1)对RAW264.7细胞增殖影响
配制样品溶液：香蕉多糖BPF2样品分别以DMEM高糖基础培养基(海口美丽海洋化工有限公司，货号：C11995500BT)配制成1mg/mL母液，无菌环境下用0.22μm滤膜(广州洁特生物过滤股份有限公司，批号：P1606461)过滤除菌，稀释成不同浓度梯度溶液待用。
细胞培养以含10％胎牛血清(Gibco公司，货号：10099141)的DMEM完全培养基培养小鼠巨噬细胞RAW264.7；取对数生长期RAW264.7细胞，细胞计数器调整悬液密度约2×105个/mL，反复吹打均匀后100μL/孔体积接种于96孔细胞培养板(广州洁特生物过滤股份有限公司，货号：TCP012096)，置于37℃、含5％CO2培养箱内培养24h后，吸去培养液，依照以下实验分组进行给药处理：
Control组：细胞培养基100μL；
LPS组：LPS终浓度为1μg/mL的细胞培养基100μL；
多糖样品组(BPF2)：25-400μg/mL浓度梯度多糖样品的细胞培养基100μL。
每组样本设平行5个复孔。封板后置于培养箱内孵育24h，收集上清液。
细胞增殖测定：
采用MTT比色法(北京索莱宝科技有限公司，货号：M1020-500T)分析香蕉多糖BPF2对小鼠巨噬细胞RAW264.7生长的作用。取对数生长期的细胞100μL接种至96孔板(广州洁特生物过滤股份有限公司，货号：TCP012096)中，置于培养箱内培养48h。分别加入浓度为25-400μg/mL的梯度香蕉多糖BPF2样品，每孔200μL，设置空白培养基为对照，每个样品均设3个复孔，置于培养箱内继续培养48h。PBS洗板，加入5mg/mL的MTT溶液20μL和相应基础培养液180μL，再于培养箱内培养4h。吸去含有MTT的培养液，加入DMSO(北京索莱宝科技有限公司，货号：D8371，纯度>99.5％)150μL振荡15min，于490nm处测定吸光度值。
细胞增殖抑制率(％)＝(1－OD给药/OD对照)×100％
实验结果如图7所示：香蕉多糖BPF2在25-400μg/mL浓度范围内对小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖体现出促进作用，随多糖浓度的增加对细胞的增殖促进作用具有一定递增趋势，相对增殖率依次是116.73％、156.73％和158.76％，在25-400μg/mL浓度范围内，与空白对照组比较均具有极显著性差异。图7中与空白对照组比较，*代表差异显著(p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。
(2)浓度为25-400μg/mL的香蕉多糖BPF2样品对RAW264.7细胞吞噬活性的影响
以2.0×105个/mL的细胞密度铺板，加入多糖样品，及空白对照(DMEM培养基)孵育细胞12h后，加入20μL/孔中性红染色液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0125)，在培养箱培养继续培养4小时。PBS溶液2次清洗，弃去残留中性红。加入200μL裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0013)，震荡裂解10min，于540nm下测定各孔中吸光值。香蕉多糖BPF2对巨噬细胞的吞噬活性用如下公式表示：细胞吞噬指数＝处理组A540/对照组A540×100％。
实验结果如图8所示，香蕉多糖BPF2对RAW264.7细胞的吞噬促进作用随多糖浓度的增加呈现递增趋势，在100-400μg/mL浓度范围内，与空白对照组比较，香蕉多糖BPF2对小鼠RAW264.7细胞吞噬活性具有极显著促进作用，浓度为25-400μg/mL范围内，吞噬指数依次是1.07，1.65和1.98。图8中与空白对照组比较，*代表差异显著(p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。
(3)25-400μg/mL浓度梯度的香蕉多糖BPF2样品对细胞RAW264.7分泌细胞因子的影响
用96孔板以2.0×105个/mL密度培养细胞，培养12h后，移去培养基，隔夜饥饿培养。加入多糖样品孵育细胞12h后，用1.5mL EP管(广州洁特生物过滤股份有限公司，货号：CFT000015)收集96孔板中的上清液。4℃下离心，转速为5000r/min，时间为5min。取上清放于EP管中，于-20℃保存备用。香蕉多糖BPF2对RAW264.7细胞分泌促炎细胞因子IL-6(sigma公司，货号：RAB0306-1KT)、TNF-α(欣博盛生物科技有限公司，货号：EMC102a)、IL-1β(欣博盛生物科技有限公司，货号：EMC001b)、NO(上海碧云天生物技术有限公司，货号：S0023)及抑炎细胞因子IFN-γ(欣博盛生物科技有限公司，货号：EMC101g(H))的含量采用ELISA试剂盒测定，按照说明书操作。
实验结果如图9-13所示，香蕉多糖BPF2在25-400μg/mL浓度范围内对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞因子的分泌体现出促进作用，能显著促进小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放细胞因子NO、IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-γ，与阳性对照组比较则显著抑制NO、IL-6、TNF-α和IL-1β的分泌(p＜0.05)，显著促进IFN-γ的分泌(p＜0.05)，具有显著的免疫调节作用。图9-13中*代表差异显著(p＜0.05)，**表示差异极显著(p＜0.01)。图9～图13中，横坐标从左到右分别为空白对照组(CON)，阳性LPS模型组(LPS)，香蕉多糖BPF2干预组(BPF2)，图9～图13中纵坐标分别为NO(μmol/mL)、IL-6(pg/mg)、TNF-α(pg/mg)、IL-1β(pg/mg)和IFN-γ(pg/mg)的含量。
(4)体外抗炎活性实验
实验分组如下：
添加LPS+多糖样品组：使用终浓度为1μg/mL LPS预处理孔内细胞4h后，移除孔内培养基加入400μg/mL浓度香蕉多糖BPF2酸性多糖干预12h；
空白组：添加相同量的DMEM培养基；
LPS阳性对照组：添加终浓度为1μg/mL LPS预处理细胞4h诱导炎症细胞模型后，移去孔内培养基，换成相同量的DMEM培养基继续培养12h。各组样本设平行5个复孔。封板后置于培养箱内孵育12h，收集上清液。
NF-κB通路关键基因mRNA表达的影响：
提取RNA，测定RNA浓度和纯度。采用逆转录试剂盒(全式金Transgen反转录试剂盒，货号：AE-311)进行RNA逆转录，逆转录的cDNA于-20℃保存。采用RT-PCR试剂盒(康为世纪MagicSYBR Mixture货号：CW3008H)进行反应，按照程序进行PCR扩增。以GAPDH为内参，NF-κB通路关键基因表达计算采用2-ΔΔCT方法。
实验结果：在96孔板内对RAW264.7细胞使用LPS预孵育一段时间后，使用高剂量浓度香蕉多糖BPF2(400μg/mL)干预细胞，考察香蕉多糖BPF2对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型的抑制作用，通过检测香蕉多糖BPF2干预后细胞内NF-κB通路关键基因的mRNA表达情况(附图14)。与未使用多糖干预的阳性模型组比较，香蕉多糖BPF2干预组对iNOS mRNA的相对表达量抑制率为8.85％，而对NF-κB p65、ERK、MyD88和p38的相对表达量促进率依次为1414.29％、812.50％、111.63％、1583.33％，表明香蕉多糖BPF2能够抑制LPS诱导的炎症反应，且可能是通过激活NF-κB通路。图14中横坐标从左到右分别为空白对照组(control)，LPS炎症模型组(lps)，香蕉多糖BPF2干预组(BPF2-lps)，纵坐标依次为iNOS、NF-κB p65、ERK、MyD88和p38基因mRNA的相对表达量。
活性实验3-香蕉多糖BPF2对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19迁移和mRNA表达水平的影响
将香蕉多糖BPF2与人视网膜色素上皮细胞APRE-19共培养，首先使用高糖培养基诱导高糖环境，利用不同剂量的香蕉多糖BPF2分别对各实验组进行干预，分别考察多糖孵育下APRE-19细胞迁移的变化趋势，同时考察香蕉多糖BPF2对高糖诱导视网膜色素上皮细胞ARPE-19纤维化及炎症的影响，通过检测血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达分析其抑制视网膜病变的作用，具体实验设置如下：
(1)香蕉多糖BPF2对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19迁移能力的影响
将ARPE-19细胞从培养瓶上消化、离心、弃上清液，调整细胞密度为4x104个/mL，接种细胞到上室；取200μL细胞悬液加入上室，使用30mmol/L葡萄糖浓度的培养基诱导高糖环境4h，分别使用(含体积分数10％FBS)的5.5mmol/L葡萄糖浓度培养基配置的香蕉多糖浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL加入板孔内，孵育16h。终止孵育：取出小室，轻轻甩去上室培养液，用棉签轻轻擦去薄膜上的上室细胞，将小室置于PBS中漂洗2次。
固定、染色：以4％多聚甲醛(biosharp公司，货号：BL539A)于室温下固定10min，自然晾干后置于0.1％结晶紫染液(上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0121)中染色5min，待薄膜上的下室细胞被染色后，PBS(Gibco公司，货号：C10010500BT)再次漂洗2次。观察、拍照：以100×普通倒置显微镜下随机选取薄膜上10个视野进行拍照。计算迁移率：计数细胞个数及计算细胞迁移率。计算公式为：细胞迁移率＝细胞迁移个数实验组/细胞迁移个数对照组。
实验结果：由Transwell实验结果所示，在受到高糖诱导时人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞迁移至transwell小室下部的细胞数显著增多(p＜0.05)，表明高糖能促进细胞垂直迁移能力的增强；在使用不同浓度香蕉多糖BPF2孵育细胞，能够明显减弱高糖诱导的视网膜色素上皮细胞迁移能力的增强。与高糖处理组比较，香蕉多糖BPF2浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL时均有不同程度的抑制迁移作用，且抑制作用随浓度增加呈增强趋势。
(2)对ARPE-19细胞VEGF、ICAM-1和NF-κB P65 mRNA表达的影响
细胞准备：待细胞长至80～90％融合状态时，浆细胞从皿内消化、离心、弃上清，并将细胞传至6孔板培养皿内，37℃，5％CO2下的培养箱内孵育24h，直至细胞完全贴壁并长满。
细胞分组：弃去原培养液，加入使用高糖DMEM(海口美丽海洋化工有限公司，货号：C11995500BT)配制的香蕉多糖浓度为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL培养液作为实验组、高糖组、低糖组和对照组，继续37℃，5％CO2细胞培养箱孵育24h。
细胞收集：将细胞培养上清液弃掉，加入胰酶(Gibco公司，货号：25200056)消化细胞，快速将细胞收集如1.5mL离心管内，并用PBS(Gibco公司，货号：C10010500BT)洗涤2次，1500rpm离心5min，弃上清，保留离心管底部细胞。
PCR引物：使用Oligo 6.0进行引物分析，引物设计列表见表4：
表4 PCR primer sequence
Figure GDA0003520804280000131
收集RNA，进行后续的QPCR反应和Real-Time PCR反应。待测基因的相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。
实验结果：图15为香蕉多糖BPF2对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19的VEGF、ICAM-1、p38和NF-κB p65 mRNA表达的影响，在25～800μg/ml范围内均对VEGF、ICAM-1mRNA表达的下调作用显著，对NF-κB p65、p38 mRNA表达的上调作用显著，且差异具有统计学意义(p<0.05)。表明香蕉多糖BPF2能够降低VEGF、ICAM-1的表达从而缓解视网膜病变可能与NF-κB和p38 MAPK通路相关。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种功能性香蕉多糖BPF2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将香蕉果肉打浆，使用体积浓度≤15％乙醇水溶液提取；
S2、采用体积浓度≥95％的乙醇沉淀S1得到的多糖至乙醇体积浓度在多糖溶液中占比为0～25％，离心后，在上清液中继续滴入体积浓度≥95％的乙醇至乙醇体积浓度在多糖溶液中占比为25～55％，得到多糖沉淀；
S3、采用分子量为3500Mw透析袋和10-100KD超滤管对S2得到的多糖进行纯化，得到香蕉多糖BPF2。
2.根据权利要求1所述的功能性香蕉多糖BPF2的制备方法，其特征在于，S1中还使用弱碱性阴离子大孔树脂吸附多糖中的蛋白和色素杂质，过滤除去吸附杂质后的大孔树脂。
3.根据权利要求1或2所述的功能性香蕉多糖BPF2的制备方法，其特征在于，S1中，在80-95℃热水浴中使用体积浓度≤15％乙醇水溶液提取。
4.根据权利要求1或2所述的功能性香蕉多糖BPF2的制备方法，其特征在于，S1中，提取时，香蕉果肉打浆得到的香蕉浆和乙醇水溶液的料液比为1:(10-30)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法的得到的功能性香蕉多糖BPF2，其特征在于，包括葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖和木糖，甘露糖和半乳糖醛酸质量所占百分比和≥30％。
6.根据权利要求5所述的功能性香蕉多糖BPF2，其特征在于，电镜扫描结果显示表面分布大量规律性褶皱。
7.根据权利要求5所述的功能性香蕉多糖BPF2在制备药品或食品上的应用。
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