CN113651896B - 一种狄氏副拟杆菌胞外多糖及其提取方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞多糖技术领域，公开了一种狄氏副拟杆菌胞外多糖及其提取方法与应用。所述狄氏副拟杆菌胞外多糖为同多糖，其单糖组成为甘露糖，其主链由→2)‑D‑Man‑(1→，→3)‑D‑Man‑(1→和→6)‑D‑Man‑(1→组成，支链由→2，4)‑D‑Man‑(1→和D‑Man‑(1→组成。所述狄氏副拟杆菌胞外多糖是从狄氏副拟杆菌中分离得到的新多糖，可起到增强免疫力的作用，如通过促进吞噬细胞的生长、炎症因子的产生和活性氧、一氧化氮的生成释放，起到免疫增强的效果。

Description

一种狄氏副拟杆菌胞外多糖及其提取方法与应用
技术领域
本发明属于细胞多糖技术领域，尤其涉及一种狄氏副拟杆菌胞外多糖及其提取方法与应用。
背景技术
免疫系统是机体抵御外界病原体的第一道防线，对于维持机体的生理平衡具有重要的作用。但过强或过低的免疫力都可引起多种不良的免疫反应。免疫缺陷是免疫功能低下的最常见表现，是导致感染、肿瘤的主要因素之一。目前，治疗免疫缺陷最常见的方法是使用免疫增强剂，如多糖、胸腺肽、干扰素和卡介苗等，在这些药物中，多糖作为免疫增强剂已被证明是安全无毒的，具备良好的研究和应用前景。
微生物胞外多糖是指微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外的多糖，主要指粘液多糖。由于微生物胞外多糖具有免疫调节、抗炎、抗癌、抗氧化等多种生物活性等优点，且微生物胞外多糖的生产受地理、气候等因素的影响较小，生产周期短，产量及质量稳定。近些年来，对于微生物胞外多糖的研究和开发愈发受到人们的青睐。
狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis，简称Pd菌)，属于拟杆菌门，是一种严格厌氧的革兰氏阴性菌。近些年来的一些研究表明，Pd菌在改善胰岛素抵抗、治疗二型糖尿病、抑制结肠癌增殖等方面具有良好的作用。虽然Pd菌拥有众多的有益效果，但作为活体微生物，机体直接摄入Pd菌可能会引起诸如菌血症等严重的感染。
因此，希望对狄氏副拟杆菌所产生的胞外多糖展开研究，以期开发和制备得到具备良好功效活性的狄氏副拟杆菌胞外多糖。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种狄氏副拟杆菌胞外多糖及其提取方法与应用，所述狄氏副拟杆菌胞外多糖是从狄氏副拟杆菌中分离得到的新多糖，可起到增强免疫力的作用，如通过促进吞噬细胞的生长、炎症因子的产生和活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)的生成释放，起到免疫增强的效果。
本发明提供了一种狄氏副拟杆菌胞外多糖，所述狄氏副拟杆菌胞外多糖为同多糖，其单糖组成为甘露糖(Man)，其主链由→2)-D-Man-(1→，→3)-D-Man-(1→和→6)-D-Man-(1→组成，支链由→2，4)-D-Man-(1→和D-Man-(1→组成。
上述各组分甘露糖的摩尔比依次为3.03：1：1.2：1.27：6.37；所述狄氏副拟杆菌胞外多糖的总糖含量为102.90％，重均分子量为3396.78kDa。
本发明还提供了上述狄氏副拟杆菌胞外多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)对狄氏副拟杆菌进行培养，得到发酵液；
(2)将所述发酵液去除菌体后取上清液，经乙醇沉淀，蛋白酶酶解，Sevag试剂除蛋白，透析，脱色，得到粗多糖；
(3)所述粗多糖依次经阴离子交换柱和凝胶柱进行洗脱，透析，得到狄氏副拟杆菌胞外多糖。
优选的，步骤(1)中对狄氏副拟杆菌进行所述培养的方法为：将狄氏副拟杆菌接种于脑心浸出液液体培养基中进行厌氧培养。
优选的，步骤(2)所述去除菌体的方法为离心处理。
优选的，步骤(2)中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
所述Sevag试剂为三氯甲烷与正丁醇体积比为4：1混合的混合物。
优选的，步骤(2)和/或步骤(3)中采用3500Da透析袋进行所述透析。
优选的，步骤(2)中所述脱色的方法为过大孔吸附树脂。
优选的，步骤(3)中所述阴离子交换柱为DEAE Cellulose DE-52阴离子交换柱。
优选的，步骤(3)中采用经阴离子交换柱进行洗脱时，所用流动相为去离子水。
更优选的，所述流动相的流速约为1.0mL/min。
优选的，步骤(3)中所述凝胶柱为Sephacryl S-300HR凝胶柱。
优选的，步骤(3)中采用凝胶柱进行洗脱时，所用流动相为NaCl溶液。
更优选的，所述流动相选用0.1mol/L的NaCl溶液进行等度洗脱。
本发明还提供了上述狄氏副拟杆菌胞外多糖在制备免疫增强剂中的应用。
本发明还提供了一种组合物，包括上述狄氏副拟杆菌胞外多糖。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明所述狄氏副拟杆菌胞外多糖首次从狄氏副拟杆菌发酵液中分离获得，是一种具有全新结构的多糖分子，其提取工艺简单易行、操作方便、制备成本低。所述狄氏副拟杆菌胞外多糖可起到增强免疫力的作用，如通过促进吞噬细胞的生长、炎症因子的产生和活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)的生成释放，起到免疫增强的效果。
附图说明
图1为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A经DEAE Cellulose DE-52阴离子交换柱层析的洗脱曲线图；
图2为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A经Sephacryl S-300HR凝胶柱层析的洗脱曲线图；
图3为D-甘露糖标准曲线图；
图4为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的单糖组成测定色谱图；
图5为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的高效凝胶渗透色谱图；
图6为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的红外光谱图；
图7为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的一维核磁共振氢谱图；
图8为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的一维核磁共振碳谱图；
图9为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的COSY谱图；
图10为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的HSQC谱图；
图11为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的HMBC谱图；
图12中A为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A的GC-MS总离子流图；B为2，3，4，6-四-O-甲基-1，5-二乙酰基甘露糖醇的质谱图；
图13中A为3，4，6-三-O-甲基-1，2，5-三乙酰基甘露糖醇的质谱图；B为2，4，6-三-O-甲基-1，3，5-三乙酰基甘露糖醇的质谱图；
图14中A为2，3，4-三-O-甲基-1，5，6-三乙酰基甘露糖醇的质谱图；B为3，6-二-O-甲基-1，2，4，5-四乙酰基甘露糖醇的质谱图；
图15为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A体外给药对RAW264.7细胞增殖活性的影响；
图16为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A体外给药对RAW264.7细胞NO生成量的影响；
图17为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A体外给药对RAW264.7细胞中性红吞噬的影响；
图18为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A体外给药对RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α细胞因子mRNA表达的影响；
图19为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A体外给药对RAW264.7细胞ROS释放的影响。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
狄氏副拟杆菌胞外多糖(命名为PEP 1-A)的提取方法，具备包括以下步骤：
(1)粗多糖的提取及脱色
以狄氏副拟杆菌ATCC 8503(可购自上海柯维化学技术有限公司)为实验菌种，将保藏于-80℃的狄氏副拟杆菌ATCC 8503(Pd菌)接种于脑心浸出液液体培养基经37℃培养24h，并且活化两代以后，以3％接种量接种于脑心浸出液液体培养基中进行扩培，在厌氧、37℃、100rpm摇床震荡的条件下培养48h。
培养完成后将发酵液离心(4℃，4000rpm，30min)去除菌体，收集上清于100℃中煮沸30min后离心(4℃，4000rpm，30min)，取上清减压浓缩至1/5体积，并向浓缩液中边搅拌边加入4倍体积的95％预冷的乙醇于4℃静置过夜以沉淀多糖，离心(4℃，4000rpm，30min)收集沉淀。
加适量水溶解沉淀，加入木瓜蛋白酶使其终浓度为1mg/mL，于60℃搅拌反应1h后于100℃灭酶15min，离心(4℃，4000rpm，30min)收集上清，加入1/4体积的Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4：1)涡旋混匀10min后离心(4000rpm，20min)取上清重复操作，直至中间乳化层消失。将获得的上清置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析24h，期间每隔2-4h换一次水。透析后的溶液经冷冻干燥24h即得Pd菌胞外多糖的粗多糖。将粗多糖以200-300mg每次上样于AB-8大孔吸附树脂进行脱色处理，脱色后的多糖液经浓缩、冷冻干燥即得脱色后的Pd菌胞外多糖的粗多糖。
(2)粗多糖的分离纯化
首先采用DEAE Cellulose DE-52阴离子交换柱层析对脱色后的粗多糖进行初步纯化，流动相依次为0、0.1、0.2、0.3、0.5mol/L的NaCl溶液，流速为1.0mL/min，每管收集10mL，每个浓度收集34管，硫酸苯酚法隔管检测，并绘制洗脱曲线(如图1所示)，收集不同峰段下的组分，得到的初步纯化组分经透析、冷冻干燥后，再经0mol/L的NaCl溶液(即去离子水)洗脱的初步纯化组分(PEP 1)继续采用Sephacryl S-300HR凝胶柱层析进行纯化，流动相为0.1mol/L的NaCl溶液，流速为0.5mL/min，每管收集4mL，收集50管，硫酸苯酚法隔管检测，并绘制洗脱曲线(如图2所示)，收集出峰的部分，并对其进行透析、冷冻干燥，得到纯化后的胞外多糖，即为狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A。
实施例2
以实施例1得到狄氏副拟杆菌胞外多糖PEP 1-A为原料，分析其组成和结构。
1.总糖含量测定
以D-甘露糖(Man)为对照品，采用硫酸苯酚法测定PEP 1-A总糖含量。精密准确称取适量D-甘露糖对照品，加纯水配制成0.5mg/mL溶液，依次取0、20、40、60、80、120、160、200μL放置于2mL的EP管中，加纯水补至400μL。准确称取适量PEP 1-A，加纯水配制成0.25mg/mL，取400μL于2mL的EP管中。再向各EP管中加入200μL 5％重蒸苯酚和1mL浓硫酸，摇匀，室温静置10min，40℃保温15min，冰水浴10min，每组取200μL于96孔板中，每组设2个副孔，于酶标仪测其在490nm的吸光值。分别以D-甘露糖浓度(mg/mL)、490nm的吸光值为横、纵坐标，绘制标准曲线图(如图3所示)。
将PEP 1-A在49nm的吸光值带入标准曲线中，计算PEP 1-A的总糖含量。由结果可知，PEP 1-A的总糖含量为102.90％。
2.单糖组成分析
采用PMP柱前衍生高效液相色谱法分析PEP 1-A的单糖组成。精密称取PEP 1-A5mg于耐压反应管中，加入2mL的三氟乙酸(TFA，3mol/L)，密封后于120℃油浴反应6h，水解完成后冷却5min，然后多次加入甲醇减压旋蒸至干以除去多余的TFA，再加800μL去离子水溶解。取100μL上述溶液于耐压反应管中，再加入0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液和0.3mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液各100μL，混匀后于70℃水浴30min进行衍生化反应，冷却后加入105μL的0.3mol/L盐酸溶液中和过量的NaOH，再加入200μL去离子水稀释。然后加入600μL三氯甲烷，震摇，8000rpm离心5min，弃三氯甲烷层，重复操作3次以除去过量的PMP。取单糖标准品(D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-岩藻糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸)，采用上述相同的方法进行衍生化处理，最后水层过0.45μm滤膜后于高效液相进行检测。色谱条件为：高效液相色谱仪为岛津LC-20A，色谱柱为Symmetry C18(Waters，4.6×250mm，5μm)，检测器为二极管阵列检测器(检测波长为250nm)，流动相为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH为6.7)-乙腈(83：17)，流速为1.0mL/min，进样量为20μL。
由图4中结果可知，PEP 1-A仅由甘露糖一种单糖组成。
3.相对分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱法测定PEP 1-A的相对分子量。准确称取适量不同分子量的葡聚糖标准品，加纯水配成浓度为1mg/mL的溶液，过0.45μm滤膜后于高效液相进行检测。以各葡聚糖的保留时间(TR)为横坐标，各葡聚糖分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。准确称取PEP 1-A适量加纯水配成浓度为1mg/mL的溶液，经0.45μm滤膜后于高效液相进行检测，并记录保留时间，将保留时间代入标准曲线中即可计算出PEP 1-A的分子量。色谱条件为：高效液相色谱仪为岛津LC-20A，色谱柱为PolySep-GFC-P 4000色谱柱(Phenomenex，300×7.8mm)，检测器为蒸发光散射检测器，检测器的设定温度为60℃，增益值为10，柱温为35℃，流动相为超纯水，流速为1.0mL/min，进样量为20μL。
由图5中结果可知，PEP 1-A的重均分子量为3396.78kD。
4.PEP 1-A的表征图谱
图6所示为PEP 1-A的红外光谱图；图7-8所示分别为PEP 1-A的一维核磁共振氢谱、碳谱图；图9所示为PEP 1-A的COSY谱图；图10所示为PEP 1-A的HSQC谱图；图11为PEP 1-A的HMBC谱图。表1为PEP 1-A不同糖残基的1H和13C的化学位移的归属表。
表1
Figure BDA0003155420470000061
Figure BDA0003155420470000071
5.糖链连接方式分析
采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析PEP 1-A的糖链连接方式。反应主要包括甲基化、水解、还原、乙酰化等过程。具体步骤如下：取冷冻干燥的PEP 1-A 6mg于耐压反应管中，加入5mL经4A分子筛干燥的二甲基亚砜(DMSO)，超声1h后，加入5mL含有600mg NaOH的DMSO，避光、冰水浴超声1h后，加入碘甲烷(CH3I)500μL，继续超声10min，重复加入500μL碘甲烷超声2次，使甲基化反应完全。甲基化反应结束后加入4mL超纯化水和3mL三氯甲烷，涡旋震荡，离心(8000rpm，5min)，取下层有机层，反复加入超纯水洗涤3次后，取有机层产物，用红外光谱仪检测在3600-3200cm-1范围内是否存在羟基峰，如无羟基峰，则表示样品甲基化完全，否则继续上述甲基化反应直至甲基化完全。用3mL的3mol/L的TFA溶解完全甲基化的样品，密封后于120℃油浴水解反应6h，水解反应结束后加入甲醇多次旋蒸挥干后加入2mL超纯水溶解水解物，再加入20mg硼氢化钠(NaBH4)，室温避光还原2h后加入100μL冰醋酸终止反应，多次加入甲醇旋蒸挥干后，加入乙酸酐和吡啶各2mL，于100℃密闭加热反应1h后，将乙酰化反应产物加甲醇多次旋蒸挥干后，加入2mL三氯甲烷溶解，再加入同体积的超纯水洗涤3次，取有机层减压蒸干后加入1mL三氯甲烷溶解，过0.22μm滤膜后采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)进行检测。GC-MS检测条件为：气相色谱-质谱联用仪为Trace DSQ型气质联用仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)，色谱柱为DB-5MS石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)，载气为高纯氦气，流速为1.0mL/min，，进样口温度为250℃，采用分流进样，分流比为1：30，采用程序升温：起始温度100℃，以6℃/min的升温速率升至250℃，并于250℃维持5min，离子源(EI)70eV，接口温度260℃，离子源温度180℃，质荷比(m/z)扫描范围为40-400，扫描速率为0.8次/秒，进样量为1μL。
由图12-14的结果可知，PEP 1-A的糖链连接方式包括：主链由→2)-D-Man-(1→，→3)-D-Man-(1→和→6)-D-Man-(1→组成，支链由→2，4)-D-Man-(1→和D-Man-(1→组成，其摩尔比依次为3.03：1：1.2：1.27：6.37。
实施例3
PEP 1-A体外给药对巨噬细胞RAW264.7细胞增殖活性的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞吹打混匀后以2×105个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞充分贴壁后，弃旧培养基，加入100μL不同浓度的PEP 1-A(2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，对照组只加培养基，同时以1μg/mL的脂多糖(LPS)作为阳性对照，培养24h后于倒置显微镜下观察并拍照，随后向每孔中加入20μL5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h，取出弃上清，每孔加入200μL的DMSO，室温摇床轻摇10min后用酶标仪测每孔在490nm处的吸光值。
由图15中结果可知，浓度为2-100μg/mL的PEP 1-A对RAW264.7细胞生长没有抑制作用，相反可以促进其增殖。显微镜观察结果显示，与对照组细胞比较，给予LPS和不同浓度的PEP 1-A后的细胞伸出大量伪足，呈现梭形或者不规则多边形，而通常情况下RAW264.7细胞形态的改变往往说明细胞已被活化，说明PEP 1-A可能是通过活化RAW264.7细胞从而发挥其免疫增强的作用。
实施例4
PEP 1-A体外给药对巨噬细胞RAW264.7细胞一氧化氮(NO)分泌的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打混匀，以2×106个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞充分贴壁后，弃旧培养基，加入100μL不同浓度的PEP 1-A(10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，对照组只加培养基，同时以1μg/mL的脂多糖(LPS)作为阳性对照，培养24h后，从每孔吸取50μL上清液于新的96孔板中，依次加入等体积的恢复至室温的GriessⅠ液和GriessⅡ液，摇匀后用酶标仪测每孔在540nm处的吸光值。同时以不同浓度的亚硝酸钠为标准溶液建立NO标准曲线，并根据标准曲线计算各实验组细胞培养上清中的NO浓度。
由图16的结果可知，当PEP 1-A浓度为10-100μg/mL时，可以呈浓度依赖性地促进RAW264.7细胞产生NO，NO作为一种毒性分子，可以帮助机体有效外界抵御病原体，其产生量增加可以初步说明PEP 1-A具有免疫增强作用。
实施例5
PEP 1-A体外给药对巨噬细胞RAW264.7细胞中性红染料吞噬的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打混匀，以2×106个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞充分贴壁后，弃旧培养基；加入100μL不同浓度的PEP 1-A(10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，对照组只加培养基，同时以1μg/mL的脂多糖(LPS)作为阳性对照，培养24h后，弃上清；加入100μL的0.075％中性红溶液，继续孵育45min后，取出弃上清，用磷酸盐(PBS)缓冲液清洗3次以洗去细胞表面未被吞噬的中性红，然后向每孔加入100μL细胞裂解液(乙醇：冰醋酸＝1：1，v/v)摇匀于室温避光放置2h后用酶标仪测每孔在540nm处的吸光值，以对照组细胞对中性红的吞噬率计为100％。
由图17中结果可知，当PEP 1-A浓度为10-100μg/mL时，可以呈浓度依赖性地增强RAW264.7细胞对中性红的吞噬作用，吞噬活性是巨噬细胞抵御并清除病原体最关键的一步，进一步说明PEP 1-A对RAW264.7细胞具有免疫增强作用。
实施例6
PEP 1-A体外给药对巨噬细胞RAW264.7细胞IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子产生的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打混匀，以2×106个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞充分贴壁后，弃旧培养基；加入2mL不同浓度的PEP 1-A(10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，对照组只加培养基，同时以1μg/mL的脂多糖(LPS)作为阳性对照，培养24h后对细胞总RNA进行提取(吸出6孔板中的培养液，加入4℃预冷的PBS将细胞清洗3次以后，每孔加入500μL Trizol试剂，反复吹打至细胞充分裂解，将裂解液转入1.5mL的EP管中，室温静置5min，加入200μL三氯甲烷，上下颠倒混匀，涡旋10s，室温静置10min后离心(4℃，12000rpm，15min)，分层，取上层无色液体至另一新EP管中，加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒，室温静置10min，离心(4℃，12000rpm，10min)，尽量吸取上清液弃去，加入500μL的75％乙醇，吹打，温和震荡离心管，使沉淀悬浮，离心(4℃，12000rpm，3min)，弃去冰乙醇，室温干燥至RNA呈半透明状，加入20μL DEPC水充分溶解RNA。以DEPC水作为空白调零，用Nanodrop分光光度计对RNA的纯度和浓度进行测定和记录，其OD260/OD280的比值在1.8-2.2范围之间较为合适，随后根据FSQ-301逆转录试剂盒说明书对RNA进行去除基因组DNA反应(如表2所示)和逆转录反应(如表3所示)使其成为cDNA，最后将cDNA、上下游引物、2×SYBR Green Mater Mix，双蒸水按照一定比例(如表4所示)进行配制后，于LightCycler荧光量PCR仪中进行反应，以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。IL-1β、IL-6和TNF-α为主要的炎症因子，当机体免疫力低下时，炎症因子表达会相应下降。
由图18中的结果可知，当PEP 1-A浓度为10-100μg/mL时，可提高RAW264.7细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子，进一步说明PEP 1-A可以通过RAW264.7细胞从而发挥其免疫增强的作用。
表2
Figure BDA0003155420470000101
表3
Figure BDA0003155420470000102
表4
Figure BDA0003155420470000103
Figure BDA0003155420470000111
实施例7
PEP 1-A体外给药对巨噬细胞RAW264.7细胞活性氧(ROS)释放的影响
取对数生长期的RAW264.7细胞，吹打混匀，以2×106个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL，待细胞充分贴壁后，弃旧培养基；加入100μL不同浓度的PEP 1-A(5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)，对照组只加培养基，同时以1μg/mL的脂多糖(LPS)作为阳性对照，培养24h后取出弃上清，每孔加入100μL的10μmol/L的2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)溶液，在37℃继续孵育20min，弃上清液，用PBS洗涤细胞3次以除去细胞表面未被结合的DCFH-DA，最后加入100μL的PBS缓冲液重悬细胞，采用荧光定量酶标仪检测每孔的荧光强度，激发波长为500nm，发射波长为525nm。活性氧(ROS)是机体代谢过程中产生的一些性质活泼的化学物质，适量的ROS对机体是有益的，可以参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
由图19中结果可知，当PEP 1-A浓度为10-100μg/mL时，可以浓度依赖性地刺激RAW264.7细胞产生ROS，进一步说明PEP 1-A可以通过作用于RAW264.7细胞产生ROS从而发挥其免疫增强的作用。
上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种狄氏副拟杆菌胞外多糖，其特征在于，所述狄氏副拟杆菌胞外多糖为同多糖，其单糖组成为甘露糖，其主链由→2)-D-Man-(1→，→3)-D-Man-(1→和→6)-D-Man-(1→组成，支链由→2，4)-D-Man-(1→和D-Man-(1→组成；其摩尔比依次为3.03：1：1.2：1.27：6.37；所述狄氏副拟杆菌胞外多糖的总糖含量为102.90％，重均分子量为3396.78kDa。
2.权利要求1所述狄氏副拟杆菌胞外多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对狄氏副拟杆菌进行培养，得到发酵液；
(2)将所述发酵液去除菌体后取上清液，经乙醇沉淀，蛋白酶酶解，Sevag试剂除蛋白，透析，脱色，得到粗多糖；
(3)所述粗多糖依次经阴离子交换柱和凝胶柱进行洗脱，透析，得到狄氏副拟杆菌胞外多糖。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中对狄氏副拟杆菌进行所述培养的方法为：将狄氏副拟杆菌接种于脑心浸出液液体培养基中进行厌氧培养。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。
5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)和/或步骤(3)中采用3500Da透析袋进行所述透析。
6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述脱色的方法为过大孔吸附树脂。
7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中采用经阴离子交换柱进行洗脱时，所用流动相为去离子水。
8.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中采用凝胶柱进行洗脱时，所用流动相为NaCl溶液；所述流动相选用0.1mol/L的NaCl溶液进行等度洗脱。
9.权利要求1所述的狄氏副拟杆菌胞外多糖在制备免疫增强剂中的应用。
10.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的狄氏副拟杆菌胞外多糖。
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