CN112694541B - 一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，包括以下步骤：S1制备黄蜀葵花冠粉；S2制备脱脂黄蜀葵花冠粉末；S3制备保存液；S4判断是否存在蛋白吸收峰；S5制备粗制多糖粉末；S6制备多糖浓缩液；S7制备脱色后的黄蜀葵花多糖粉，并测定其成分含量；本发明的有益效果是：通过采用黄蜀葵的花冠进行研磨粉碎处理，再经过丙酮和无水乙醇的洗涤脱脂，随后经过多次反复提取，再经过氯化钙和pH控制，利用透析袋透析，从而使蛋白质沉淀而与多糖溶液区分开，最后经过乙二胺四乙酸二钠和交换树脂联用，不会破坏多糖的结构，也不会损失活性，提高脱色率的同时，多糖损失率较低，同时提高装置的利用效率。

Description

一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法

技术领域

本发明涉及药物组分提取领域，具体是一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法。

背景技术

黄蜀葵为锦葵科秋葵属，是一种一年或多年生粗壮直立植物，别名黄秋葵、棉花葵、野芙蓉、鸡爪莲，广泛分布于印度、尼泊尔和中国，在我国主要分布于产云南、贵州、四川、湖北、广东、广西及台湾等省区；黄蜀葵花冠是一种传统中药材，通常被用作草药、茶饮以及保健等许多不同目的，其具有很高的医疗保健价值，如美容养颜，增加食欲，辅助治疗肾病，治疗炎症等。

黄蜀葵花作为传统中药材分布广泛、功能多样且价格低廉，多糖是黄蜀葵花中主要的药理活性物质，其具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节，降血脂等多种生物功能。而目前，黄蜀葵花多糖的提取方法有复合酶提取法、热水浸提法、热水酸提法、热水碱提法，也有在此基础上，采用高温高压、微波、超声等方法辅助提取，但提取得到的黄蜀葵花多糖通常呈现出深褐色，不仅影响多糖的纯度，更严重影响到多糖的分离纯化、结构鉴定及其构效关系研究，最终影响到实验结果的展现。传统的生产工艺常常采取活性炭吸附法、双氧水法和树脂法进行脱色。活性炭法和双氧水法虽然成本也较为低廉，但操作繁琐操作工时长，并且脱色率低，多糖损失大，获得的多糖纯度低，更会影响多糖的活性，难以满足市场需求。

常见的有效脱色的树脂有大孔吸附树脂、阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，但单纯使用树脂吸附色素后，柱料难以再生，成本高昂，不利于规模化使用。

乙二胺四乙酸二钠(EDAT-2Na)是一种良好的配合剂，被广泛被应用于食品、药品等用途，能够有效的结合植物中的叶绿素、花青素等主要色素。使用EDTA-2Na结合阳离子交换树脂层析法去除黄蜀葵花多糖中的色素，能广泛的去除包括花青素、类黄酮、蒽醌类等色素，能有效解决了树脂脱色后色素吸附导致的再生难的问题，而且因其温和的脱色条件在更高效去除色素的同时减少多糖的损失和保护多糖的结构。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，以至少达到减少多糖损失和收集高纯度多糖的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，包括以下步骤：

S1选取黄蜀葵的花冠部位，干燥粉碎，筛分，取筛分后细粉，得到黄蜀葵花冠粉，随后置于干燥处待用；

S2按照质量比黄蜀葵花冠粉：丙酮＝1:6～8，将黄蜀葵花冠粉浸泡入丙酮中12-24h，随后干燥，再按照质量比黄蜀葵花冠粉：无水乙醇＝1:4～6，将黄蜀葵花冠粉浸泡入无水乙醇中6～12h，取出黄蜀葵花冠粉进行通风干燥，通风干燥后，将干燥后的黄蜀葵花冠粉烘干，得到脱脂黄蜀葵花冠粉末；

S3将脱脂黄蜀葵花冠粉末按照料液比为1：20与超纯水溶液混合后，升温提取，随后降低温度，取反应后溶液离心，收集上清液，同时将沉淀物与超纯水混合，按照上述过程，提取2～3次，合并多次提取的上清液，蒸发浓缩至原体积的1/3-1/4后，按照体积比为浓缩液：质量分数为95％的乙醇＝1:4，沉淀浓缩液12-24h，沥干乙醇后，离心，加入少量的双蒸水重复溶解，于4℃保存了，得到保存液；

S4将得到的保存液，调节pH为9-10，加入固体CaCl₂至终浓度5％，水浴加热后冷却至室温，过滤，稀盐酸调节至中性，随后按照四倍的溶液体积加入质量分数为95％的乙醇进行沉淀，重复沉淀2-3次，得到混合液，针对混合液进行280nm紫外光谱分析扫描，判断是否存在蛋白吸收峰，若存在，返回并执行S4，若不存在，执行步骤S5；

S5将混合液用截留分子量3500Da的透析袋透析，减压低温浓缩至原始体积的1/2～1/4，冻干透析后液体，得到粗制多糖粉末；

S6将粗制多糖粉末加入到100～200mL的0.05～0.6mol/L的乙二胺四乙酸二钠，磁力搅拌30～60min，随后减压浓缩至原始体积的1/3～1/5，低温保存，得到多糖保存液，将多糖保存液依次经过树脂净化处理，减压浓缩，得到多糖浓缩液；

S7将多糖浓缩液通过中空纤维超滤膜过滤，弃去外层溶液，保留截留多糖组分，然后减压浓缩至原体积的1/3～1/4，得到多糖液，随后低温冷冻成粉，即得到脱色后的黄蜀葵花多糖粉，并计算得到的黄蜀葵花多糖粉的成分含量。

优选的，为了进一步实现收集高纯度多糖的目的，所述的树脂净化处理包括以下步骤：

a.将多糖保存液分别反复经过AB-8大孔吸附树脂、732强酸型阳离子交换树脂、D113弱酸性阳离子交换树脂、717强碱性阴离子交换树脂以及D301弱碱性阴离子交换树脂层析系统处理；

b.再利用示差检测器的凝胶渗透色谱在线检测多糖组分，将各个树脂的多糖组分分别富集后，编号，减压浓缩，计算脱色率；

c.根据脱色率排序，筛选最合适的树脂；

所述的脱色率为：

脱色率＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)÷脱色前吸光度*100％；

其中，所述的脱色前吸光度为，采用粗制多糖粉末与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，或利用多糖保存液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度；

所述的脱色后吸光度为，采用多糖保存液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度，或利用多糖浓缩液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所有溶液的吸光度均采用紫外可见分光光度计于420nm波长测定的吸光度值。

优选的，为了进一步实现高脱色率的目的，所述的脱色率包括乙二胺四乙酸二钠脱色率、树脂脱色率以及总脱色率；

所述的乙二胺四乙酸二钠脱色率为：

乙二胺四乙酸二钠脱色率＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)÷脱色前吸光度*100％；

其中，所述的脱色前吸光度为粗制多糖粉末与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为采用多糖保存液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所述的树脂脱色率为：

树脂脱色率＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)÷脱色前吸光度*100％；

其中，所述的脱色前吸光度为多糖保存液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为多糖浓缩液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所述的总脱色率为：

总脱色率＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)÷脱色前吸光度*100％；

其中，所述的脱色前吸光度为粗制多糖粉末与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为多糖浓缩液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

通过采用多个常规的树脂系统，同时利用示差检测器进行在线检测多糖组分，通过分别以吸光度计算包括乙二胺四乙酸二钠脱色率、树脂脱色率以及总脱色率的脱色率，从而准确区分乙二胺四乙酸二钠脱色和树脂脱色的差异，进而能准确筛选出适合的交换树脂，再利用前期的乙二胺四乙酸二钠处理，从而使交换树脂能在使用后进行洗涤，从而完成树脂的再生，实现高脱色率的同时实现树脂的再生。

优选的，为了进一步验证高脱色率和减少多糖损失的目的，所述的成分含量包括多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分测定；所述的多糖含量通过以下步骤测定：

1)将黄蜀葵花冠粉配制成1mg/mL的脱色前样品溶液，同时将制备的黄蜀葵花多糖粉配制成1mg/mL的脱色后样品溶液，溶剂均采用超纯水；

2)将20ml浓硫酸缓慢加入到80ml的水中，待冷却至室温，加入1g的苯酚溶解得到显色液；

3)将得到的脱色前样品溶液和脱色后的样品溶液分别取0.5ml，分别加入到2ml的显色液中，混合均匀后水浴加热，随后流水冷却，得到以脱色前样品溶液为主要成分的对比组，以及以脱色后的样品溶液为主要成分的实验组，将对比组和实验组均在于紫外分光光度计的490nm波长处测定吸收度值，并以葡萄糖为标准品绘制的标准曲线为参考，计算对比组和实验组的多糖含量，即得到多糖含量；所述的多糖保留率为，

多糖保留率(％)＝(脱色后溶液多糖含量÷脱色前溶液多糖含量)×100％；

所述的多糖结构组分测定包括多糖特征结构变化和单糖组成变化；

所述的多糖结构变化具体为以下步骤：

(1)配制浓度为0.5mg/ml的黄蜀葵花多糖粉的溶液，同时配制0.5mg/ml的葡聚糖系列溶液，溶剂均采用超纯水；所述的葡聚糖系列包括葡萄糖、T10、T40、T70、T100、T200以及T500；

(2)利用配制的0.5mg/ml的葡聚糖系列溶液为标准品进行标准曲线的绘制，采用高效凝胶渗透色谱法对黄蜀葵花多糖的相对分子质量的测定，以超纯水作为流动相，柱温30℃，流速为0.3ml/min，测定多糖结构的分子量；

(3)利用傅里叶变换红外光谱仪FT-IR测定脱色前样品溶液和脱色后样品溶液的多糖特征结构，判定是否存在变化；

所述的单糖组成变化为，使用PMP柱前衍生化反应测定脱色前样品溶液和脱色后样品溶液的单糖组成，根据两者单糖组成的图谱，判定单糖组成变化；

通过采用包括多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分测定的成分含量，同时多糖结构组分测定包括多糖特征结构变化和单糖组成变化，进而充分测定多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分的变化，验证黄蜀葵多糖脱色过程中的各组分成分和结构变化，并将各个变化利用数据化显示，展示脱色阶段的变化水平。

本发明的有益效果是：

1.通过采用黄蜀葵的花冠进行研磨粉碎处理，再经过丙酮和无水乙醇的洗涤脱脂，随后经过多次反复提取，再经过氯化钙和pH控制，利用透析袋透析，从而使蛋白质沉淀而与多糖溶液区分开，最后经过乙二胺四乙酸二钠和交换树脂联用，利用乙二胺四乙酸二钠中的酸根离子特性，将黄蜀葵花多糖的中的花青素、叶绿素以及胡萝卜素等色素进行初步的去除，再经过阳离子交换树脂进行层析，使多糖的组分分离出，随后利用中空纤维超滤膜过滤，从而得到高纯度的黄蜀葵花多糖，同时经过乙二胺四乙酸二钠洗涤后的交换树脂能快速再生，从而提高装置的利用效率以及黄蜀葵花的脱色率，而乙二胺四乙酸二钠本身具备的抗氧化性的保护作用，可以防止多糖在浓缩阶段被大量氧化，不会破坏多糖的结构，也不会损失活性，在提高脱色率的同时，多糖保留率高。

2.通过采用多个常规的树脂系统，同时利用示差检测器进行在线检测多糖组分，通过分别以吸光度计算包括乙二胺四乙酸二钠脱色率、树脂脱色率以及总脱色率的脱色率，从而准确区分乙二胺四乙酸二钠脱色和树脂脱色的差异，进而能准确筛选出适合的交换树脂，再利用前期的乙二胺四乙酸二钠处理，从而使交换树脂能在使用后进行洗涤，从而完成树脂的再生，实现高脱色率的同时实现树脂的再生。

3.通过采用包括多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分测定的成分含量，同时多糖结构组分测定包括多糖特征结构变化和单糖组成变化，进而充分测定多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分的变化，验证黄蜀葵多糖脱色过程中的各组分成分和结构变化，并将各个变化利用数据化显示，展示脱色阶段的变化水平。

附图说明

图1为本发明的黄蜀葵花多糖溶液脱色效果与乙二胺四乙酸二钠浓度的关系，其中，A-无乙二胺四乙酸二钠，B-加入100ml的0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠，C-加入200ml的0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠，D-加入100ml的0.6mol/L的乙二胺四乙酸二钠，E-加入200ml的0.4mol/L的乙二胺四乙酸二钠，F-加入200ml的0.6mol/L的乙二胺四乙酸二钠；

图2为本发明的黄蜀葵花多糖脱色前后样品对比图，

其中，A-未脱色前样品，B-脱色后样品；

图3为本发明的黄蜀葵花多糖经过不同树脂和乙二胺四乙酸二钠联合脱水的比较图，

其中，1-单独采用AB-8大孔吸附树脂，2-单独采用732强酸型阳离子交换树脂，3-单独采用D113弱酸性阳离子交换树脂，4-单独采用717强碱性阴离子交换树脂，5-单独采用D301弱碱性阴离子交换树脂，6-单独采用200ml的0.4mol/L的乙二胺四乙酸二钠，7-采用200ml的0.4mol/L的乙二胺四乙酸二钠联合732强酸型阳离子交换树脂；

图4为本发明的黄蜀葵花多糖脱色前后高效凝胶渗透色谱比较图，

其中，1-脱色前样品溶液，2-脱色后样品溶液；

图5为本发明的黄蜀葵花多糖脱色前后的单糖组成图，

其中，1-脱色前样品溶液，2-脱色后样品溶液；

图6为本发明的黄蜀葵花多糖脱色前后的傅里叶变换红外光谱图，

其中，1-脱色前样品溶液，2-脱色后样品溶液。

具体实施方式

下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1

一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，包括以下步骤：

S1选取黄蜀葵的花冠部位，60℃干燥2h后粉碎，20目筛网筛分，取筛分后细粉，得到黄蜀葵花冠粉，随后置于干燥处待用；

S2称取干燥后的黄蜀葵花冠粉150g，按照质量比黄蜀葵花冠粉：丙酮＝1:8洗涤后，将黄蜀葵花冠粉浸泡入丙酮中18h，随后干燥，再按照质量比黄蜀葵花冠粉：无水乙醇＝1:6，将黄蜀葵花冠粉浸泡入无水乙醇中8h，取出黄蜀葵花冠粉进行通风干燥，通风干燥后，将干燥后的黄蜀葵花冠粉50℃烘箱烘干，得到脱脂黄蜀葵花冠粉末；

S3将脱脂黄蜀葵花冠粉末按照料液比为1：20与超纯水溶液混合后，升温到60℃提取4h，随后降低温度至室温，取反应后溶液离心，收集上清液，同时将沉淀物与超纯水混合，按照上述过程，提取2～3次，合并多次提取的上清液，将合并后的上清液经过旋转蒸发仪在60℃下蒸发浓缩至原体积的1/4后，按照体积比为浓缩液：质量分数为95％的乙醇＝1:4，沉淀浓缩液18h，沥干乙醇后，离心，加入少量的双蒸水重复溶解，于4℃保存了，得到保存液；

S4将得到的保存液，调节pH为9-10，加入固体CaCl₂至终浓度5％，水浴加热后冷却至室温，过滤，稀盐酸调节至中性，随后按照四倍的溶液体积加入质量分数为95％的乙醇进行沉淀，重复沉淀2-3次，得到混合液，针对混合液进行280nm紫外光谱分析扫描，判断是否存在蛋白吸收峰，若存在，返回并执行S4，若不存在，执行步骤S5；

S5将混合液用截留分子量3500Da的透析袋透析24h，每3h换双蒸水一次，在60℃下减压低温浓缩至原始体积的1/3，冻干透析后液体，得到粗制多糖粉末；

S6将粗制多糖粉末加入到200mL的0.4mol/L的乙二胺四乙酸二钠，磁力搅拌45min，随后用旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至原始体积的1/5，低温保存，得到多糖保存液，将多糖保存液依次经过树脂净化处理，减压浓缩，得到多糖浓缩液；

S7将多糖浓缩液通过截留分子量为10000Da的中空纤维超滤膜过滤，弃去外层溶液，保留截留多糖组分，然后经过旋转蒸发仪在60℃下减压浓缩至原体积的1/3，得到多糖液，随后低温冷冻成粉，即得到脱色后的黄蜀葵花多糖粉，如图2所示，并计算得到的黄蜀葵花多糖粉的成分含量。

优选的，为了进一步实现收集高纯度多糖的目的，所述的树脂净化处理包括以下步骤：

a.将多糖保存液分别反复经过AB-8大孔吸附树脂、732强酸型阳离子交换树脂、D113弱酸性阳离子交换树脂、717强碱性阴离子交换树脂以及D301弱碱性阴离子交换树脂层析系统处理；

b.再利用示差检测器的凝胶渗透色谱在线检测多糖组分，将各个树脂的多糖组分分别富集后，编号，减压浓缩，计算脱色率；

c.根据脱色率排序，筛选最合适的树脂；

为了进一步实现高脱色率的目的，所述的脱色率包括乙二胺四乙酸二钠脱色率、树脂脱色率以及总脱色率；

所述的乙二胺四乙酸二钠脱色率为：

乙二胺四乙酸二钠脱色率＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)÷脱色前吸光度*100％；

其中，所述的脱色前吸光度为粗制多糖粉末与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为采用多糖保存液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所述的树脂脱色率为：

树脂脱色率＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)÷脱色前吸光度*100％；

其中，所述的脱色前吸光度为多糖保存液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为多糖浓缩液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所述的总脱色率为：

总脱色率＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)÷脱色前吸光度*100％；

其中，所述的脱色前吸光度为粗制多糖粉末与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为多糖浓缩液与超纯水配制成1mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；如图3所示，经过测定发现，采用乙二胺四乙酸二钠以及732强酸型阳离子交换树脂的脱色率能达到94.41％；

通过采用多个常规的树脂系统，同时利用示差检测器进行在线检测多糖组分，通过分别以吸光度计算包括乙二胺四乙酸二钠脱色率、树脂脱色率以及总脱色率的脱色率，从而准确区分乙二胺四乙酸二钠脱色和树脂脱色的差异，进而能准确筛选出适合的交换树脂，再利用前期的乙二胺四乙酸二钠处理，从而使交换树脂能在使用后进行洗涤，从而完成树脂的再生，实现高脱色率的同时实现树脂的再生。

优选的，为了进一步验证高脱色率和减少多糖损失的目的，所述的成分含量包括多糖含量、多糖保留率以及单糖组成变化；所述的多糖含量通过以下步骤测定：

1)将黄蜀葵花冠粉配制成1mg/mL的脱色前样品溶液，同时将制备的黄蜀葵花多糖粉配制成1mg/mL的脱色后样品溶液，溶剂均采用超纯水；

2)将20ml浓硫酸缓慢加入到100ml的水中，待冷却至室温，加入1g的苯酚溶解得到显色液；

3)将得到的脱色前样品溶液和脱色后的样品溶液分别取0.5ml，分别加入到2ml的显色液中，混合均匀后水浴加热，随后流水冷却，得到以脱色前样品溶液为主要成分的对比组，以及以脱色后的样品溶液为主要成分的实验组，将对比组和实验组均在于紫外分光光度计的490nm波长处测定吸收度值，并以葡萄糖为标准品绘制的标准曲线为参考，计算对比组和实验组的多糖含量，即得到多糖含量；所述的多糖保留率为，

多糖保留率(％)＝(脱色后溶液多糖含量÷脱色前溶液多糖含量)×100％；经过测定多糖保留率为89.63％；

所述的单糖组成变化包括多糖结构变化和单糖组成变化；

所述的多糖结构变化具体为以下步骤：

(1)配制浓度为0.5mg/ml的黄蜀葵花多糖粉的溶液，同时配制0.5mg/ml的葡聚糖系列溶液，溶剂均采用超纯水；所述的葡聚糖系列包括葡萄糖、T10、T40、T70、T100、T200以及T500；

(2)利用配制的0.5mg/ml的葡聚糖系列溶液为标准品进行标准曲线的绘制，采用高效凝胶渗透色谱法对黄蜀葵花多糖的相对分子质量的测定，以超纯水作为流动相，柱温30℃，流速为0.3ml/min，测定多糖结构的分子量为467kDa，结果如图4所示；

(3)利用傅里叶变换红外光谱仪FT-IR测定脱色前样品溶液和脱色后样品溶液的多糖特征结构，判定是否存在变化；结果如图6所示，多糖特征结构无明显变化，

所述的单糖组成变化为，使用PMP柱前衍生化反应测定脱色前样品溶液和脱色后样品溶液的单糖组成，根据两者单糖组成的图谱，判定单糖组成变化，如图5所示，其单糖组成无明显差异，同时其单糖组成如表1所示。

表1黄蜀葵花多糖的单糖组成变化表

样品类别	鼠李糖	半乳糖	半乳糖醛酸	葡萄糖醛酸	阿拉伯糖
						脱色前样品溶液	0.93	0.41	1.00	0.29	0.19
脱色后样品溶液	0.94	0.40	1.00	0.29	0.20

通过采用包括多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分测定的成分含量，同时多糖结构组分测定包括多糖特征结构变化和单糖组成变化，进而充分测定多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分的变化，验证黄蜀葵多糖脱色过程中的各组分成分和结构变化，并将各个变化利用数据化显示，展示脱色阶段的变化水平。

实施例2

将S2更改为按照质量比黄蜀葵花冠粉：丙酮＝1:6，将黄蜀葵花冠粉浸泡入丙酮中24h，随后干燥，再按照质量比黄蜀葵花冠粉：无水乙醇＝1:4，将黄蜀葵花冠粉浸泡入无水乙醇中12h；

同时S3中蒸发浓缩至原体积的2/7，以及沉淀浓缩液24h；

S5中减压低温浓缩至原始体积的1/2；

并在S6中将粗制多糖粉末加入到100mL的0.05mol/L的乙二胺四乙酸二钠，磁力搅拌30min，随后减压浓缩至原始体积的1/4；

在S7中减压浓缩至原体积的2/7，其余步骤及配方同实施例1。

实施例3

将S2更改为按照质量比黄蜀葵花冠粉：丙酮＝1:8，将黄蜀葵花冠粉浸泡入丙酮中12h，随后干燥，再按照质量比黄蜀葵花冠粉：无水乙醇＝1:5，将黄蜀葵花冠粉浸泡入无水乙醇中6h；

同时S3中蒸发浓缩至原体积的1/3，以及沉淀浓缩液12h；

S5中减压低温浓缩至原始体积的1/4；

并在S6中将粗制多糖粉末加入到200mL的0.6mol/L的乙二胺四乙酸二钠，磁力搅拌30min；

在S7中减压浓缩至原体积的1/4，其余步骤及配方同实施例1。

对比例1

在S6中加入100mL的0.05mol/L乙二胺四乙酸EDTA，利用乙二胺四乙酸EDTA替代乙二胺四乙酸二钠EDTA-2Na，其余步骤及配方同实施例1。

对比例2

采用常规的水提法对黄蜀葵进行多糖提取。

收集各个实施例和对比例的黄蜀葵花多糖，计算其脱色率以及多糖保留率，得到表2。

表2各个实施例和对比例得到的黄蜀葵花多糖的脱色率和多糖保留率情况表

类别	脱色率(％)	多糖保留率(％)
			实施例1	94.41	89.63
实施例2	79.35	88.37
			实施例3	93.19	87.69
对比例1	78.64	69.75
			对比例2	59.67	76.87

因EDTA的水溶性较EDTA-2Na差，并且多糖为多羟基化合物其水溶性强，因此在多糖的常规溶剂为水的前提下，EDTA-2Na更适合于规模化生产中，并且EDTA-2Na本身具备保护性作用，因此其对提取物的保护也强于EDTA；同时虽然在实施例2和对比例1中都是采用的100mL的0.05mol/L的加入量，然而针对树脂的再生上，由于EDTA的水溶性差，树脂再生时洗脱次数和时长均要高于采用EDTA-2Na洗脱的次数和时长。

尽管实施例1～3中添加的EDTA-2Na的浓度不同，而在实施例1中，若采用实施例2和实施例3中的浓度，其浓度梯度如图1所示，在浓度逐渐增加过程，当采用200mL的0.4mol/L的EDAT-2Na时，其溶液的初步脱色的颜色逐渐稳定。

由表1以及表2可知，当采用本发明的方法，利用质量比黄蜀葵花冠粉：丙酮＝1:8洗涤后，将黄蜀葵花冠粉浸泡入丙酮中18h，再按照质量比黄蜀葵花冠粉：无水乙醇＝1:6洗涤，将黄蜀葵花冠粉浸泡入无水乙醇中8h后，同时蒸发浓缩至原体积的1/4，以及沉淀浓缩液18h；减压低温浓缩至原始体积的1/3；并在将粗制多糖粉末加入到200mL的0.4mol/L的乙二胺四乙酸二钠，磁力搅拌45min，随后减压浓缩至原始体积的1/5，进行732强酸型阳离子交换树脂净化处理，随后进行中控纤维超滤膜过滤，并减压浓缩至原体积的1/3，其得到的黄蜀葵花多糖的脱色率为94.41％以及多糖保留率为89.63％，即证明了本发明的优越性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1选取黄蜀葵的花冠部位，干燥粉碎，筛分，取筛分后细粉，得到黄蜀葵花冠粉，随后置于干燥处待用；

S2按照质量比黄蜀葵花冠粉：丙酮=1:6-1:8，将黄蜀葵花冠粉浸泡入丙酮中12-24 h，随后干燥，再按照质量比黄蜀葵花冠粉：无水乙醇=1:4-1:6，将黄蜀葵花冠粉浸泡入无水乙醇中6~12 h，取出黄蜀葵花冠粉进行通风干燥，通风干燥后，将干燥后的黄蜀葵花冠粉烘干，得到脱脂黄蜀葵花冠粉末；

S3将脱脂黄蜀葵花冠粉末按照料液比为1：20与超纯水溶液混合后，升温提取，随后降低温度，取反应后溶液离心，收集上清液，同时将沉淀物与超纯水混合，按照上述过程，提取2~3次，合并多次提取的上清液，蒸发浓缩至原体积的1/3-1/4后，按照体积比为浓缩液：质量分数为95%的乙醇=1:4，沉淀浓缩液12-24h，沥干乙醇后，离心，加入少量的双蒸水重复溶解，于4℃保存，得到保存液；

S4将得到的保存液，调节pH为9-10，加入固体CaCl₂至终浓度5%，水浴加热后冷却至室温，过滤，稀盐酸调节至中性，随后按照四倍的溶液体积加入质量分数为95%的乙醇进行沉淀，重复沉淀2-3次，沉淀复溶，得到混合液，针对混合液进行260nm和280 nm紫外光谱分析扫描，判断是否存在蛋白吸收峰，若存在，返回并执行S4，若不存在，执行步骤S5；

S5将混合液用截留分子量3500 Da的透析袋透析，减压低温浓缩至原始体积的1/2~1/4，冻干透析后液体，得到粗制多糖粉末；

S6将粗制多糖粉末加入到100~200 mL的0.05~0.6 mol的乙二胺四乙酸二钠，磁力搅拌30~60 min，随后减压浓缩至原始体积的1/3~1/5，低温保存，得到多糖保存液，将多糖保存液依次经过树脂净化处理，减压浓缩，得到多糖浓缩液；

S7将多糖浓缩液通过中空纤维超滤膜过滤，弃去外层溶液，保留截留多糖组分，然后减压浓缩至原体积的1/3～1/4，得到多糖液，随后低温冻干成粉，即得到脱色后的黄蜀葵花多糖粉，并计算得到的黄蜀葵花多糖粉的成分含量；

所述的树脂净化处理包括以下步骤：

a.将多糖保存液分别反复经过AB-8大孔吸附树脂、732强酸型阳离子交换树脂、D113弱酸性阳离子交换树脂、717强碱性阴离子交换树脂以及D301弱碱性阴离子交换树脂层析系统处理；

b.再利用具备示差检测器的凝胶渗透色谱在线检测多糖组分，将各个树脂的多糖组分分别富集后，编号，减压浓缩，计算脱色率；

c.根据脱色率排序，筛选最合适的树脂；

其中，所述最合适的树脂为732强酸型阳离子交换树脂。

2.根据权利要求1所述的一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，其特征在于：所述的脱色率为：

其中，所述的脱色前吸光度为，采用粗制多糖粉末与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，或利用多糖保存液与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度；

所述的脱色后吸光度为，采用多糖保存液与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度，或利用多糖浓缩液与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所有溶液的吸光度均采用紫外可见分光光度计于420nm波长测定的吸光度值。

3.根据权利要求2所述的一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，其特征在于：所述的脱色率包括乙二胺四乙酸二钠脱色率、树脂脱色率以及总脱色率；

所述的乙二胺四乙酸二钠脱色率为：

其中，所述的脱色前吸光度为粗制多糖粉末与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为采用多糖保存液与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所述的树脂脱色率为：

其中，所述的脱色前吸光度为多糖保存液与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为多糖浓缩液与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度；

所述的总脱色率为：

其中，所述的脱色前吸光度为粗制多糖粉末与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测前样品溶液的吸光度，所述的脱色后吸光度为多糖浓缩液与超纯水配制成1 mg/mL的脱色检测后样品溶液的吸光度。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，其特征在于：所述的成分含量包括多糖含量、多糖保留率以及多糖结构组分测定。

5.根据权利要求4所述的一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，其特征在于：所述的多糖含量通过以下步骤测定：

1）将黄蜀葵花冠粉配制成1 mg/mL的脱色前样品溶液，同时将制备的黄蜀葵花多糖粉配制成1 mg/mL的脱色后样品溶液，溶剂均采用超纯水；

2）将20 ml浓硫酸缓慢加入到100 ml的水中，待冷却至室温，加入1g的苯酚溶解得到显色液；

3）将得到的脱色前样品溶液和脱色后的样品溶液分别取0.5ml，分别加入到2 ml的显色液中，混合均匀后水浴加热，随后流水冷却，得到以脱色前样品溶液为主要成分的对比组，以及以脱色后的样品溶液为主要成分的实验组，将对比组和实验组均在于紫外分光光度计的490nm波长处测定吸收度值，并以葡萄糖为标准品绘制的标准曲线为参考，计算对比组和实验组的多糖含量，即得到多糖含量。

6.根据权利要求5所述的一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，其特征在于：所述的多糖保留率为：

7.根据权利要求5所述的一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法，其特征在于：所述的多糖结构组分测定包括多糖特征结构变化和单糖组成变化；

所述的多糖结构变化具体为以下步骤：

（1）配制浓度为0.5 mg/ml的黄蜀葵花多糖粉的溶液，同时配制0.5 mg/ml的葡聚糖系列溶液，溶剂均采用超纯水；所述的葡聚糖系列包括葡萄糖、T10、T40、T70、T100、T200以及T500；

（2）利用配制的0.5 mg/ml的葡聚糖系列溶液为标准品进行标准曲线的绘制，采用高效凝胶渗透色谱对黄蜀葵花多糖的相对分子质量的测定，以超纯水作为流动相，柱温30℃，流速为0.3 ml/min，测定多糖结构的相对分子质量；

（3）利用傅里叶变换红外光谱仪FT-IR测定脱色前样品溶液和脱色后样品溶液的多糖特征结构，判定是否存在变化；

所述的单糖组成变化为，使用PMP柱前衍生化反应测定脱色前样品溶液和脱色后样品溶液的单糖组成，根据两者单糖组成的图谱，判定单糖组成变化。

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