CN107098985B - 一种从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖的制备方法。本发明采用醇沉、酶解、脱色、D900阴离子树脂吸附、盐析和超滤等方法从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖。用间羟联苯法测定人参酸性多糖纯度，人参酸性多糖的含量为93%以上，该工艺稳定可靠、简便易行，适合于工业化生产。

Description

一种从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖的制备方法

技术领域

本发明属于中药材资源综合利用领域，涉及一种人参废弃物的二次资源开发和中药复合提取方法，尤其涉及一种从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖的制备方法。

背景技术

人参( Panax ginseng C.A.Mey)是我国的名贵中药,具有多种药效。《神农本草经》将人参列为上品，言其具有“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，明目，开心益智，久服有轻身延年之功效”。因此，对人参的各种有效成分及其药理活性的研究一直是国内外学者研究的热点。

研究发现, 从人参中分离出的多糖成分具有杀伤肿瘤细胞和诱导巨噬细胞产生细胞因子的活性。人参多糖中的人参果胶是人参中的另一种有效成分，表现出多种生物活性，如增强机体免疫能力，辅助防治肿瘤,显著抑制肝损伤和降血糖等。人参多糖是由糖醛酸及各种中性糖组成的酸性杂多糖，酸性多糖(RGAP) 分离自人参不溶于乙醇而溶于水的部分, 化学成分检测发现其含有56.9%酸性糖和28.3%中性糖, 蛋白质含量低于0.1% ，研究表明糖醛酸本身或含有糖醛酸结构单元的低聚糖或多糖常显示出十分重要的生物活性。

近年来，我国类似人参等的名贵中药材资源越来匮乏，但是利用方式依然相当的落后。例如，每年有数十吨人参用于生产人参精，人参酒等保健产品，在生产中仅利用人参有效成分的4％～ 5％，其余的则被废弃或作为饲料添加剂，十分可惜。其实，在常规的人参提取废料中含有一些具有显著保健作用的有效成分，如人参酸性多糖，则并没有得到合理的利用。

发明内容

人参作为我国珍贵的植物资源,已经被许多企业所利用，但是多数都是利用醇提的人参皂苷入药使用，而醇提后的废渣则被遗弃，本发明工艺本着变废为宝的理念，以人参醇提后的药渣的为原料对人参酸性多糖的制备工艺进行了研究，尤其涉及一种从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖的制备方法。

该人参酸性多糖的制备方法包括以下步骤：

A．制备人参粗多糖：人参醇提后药渣经水提取，水提液离心，上清液浓缩后醇沉，沉淀以水溶解后，酶解，脱色、离心，取上清液，滤膜过滤后浓缩、醇沉，得人参多糖粗品；

B．第一次纯化：取人参多糖粗品水溶，上树脂柱，水洗脱后，用NaCl溶液洗脱，得到人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，浓缩，离心，沉淀以水溶解；

D．第三次纯化：超滤法脱盐，醇沉，离心，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E． 干燥：干燥后即得人参酸性多糖。

该人参酸性多糖的制备方法步骤优选为：

A． 制备人参粗多糖：人参醇提后药渣经水提，离心去沉淀，上清液浓缩，醇沉离心，沉淀经60%醇洗脱后用水溶解，酶解、脱色、离心，上清液经微孔滤膜过滤，减压浓缩制成醇溶液，醇沉离心，沉淀经60%醇洗脱，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取人参多糖粗品溶于水后上树脂柱，用蒸馏水洗脱，再用NaCl溶液洗脱，得到人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C． 第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，减压浓缩，冷藏离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解；

D． 第三次纯化：超滤法脱盐，醇沉离心，沉淀经60%醇洗脱，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E． 干燥：干燥后即得人参酸性多糖。

该人参酸性多糖的制备方法步骤进一步优选为：

A． 制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入15-25倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%-0.31%的中温淀粉酶，酶解22-37分钟，加入0.75%-1.25%的多糖专用大孔径活性炭，脱色30-50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于75-125倍量的纯化水后上树脂柱，用3-5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5-2.5BV/h，再用4-6倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为1.5-2.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，40-75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75-1.25kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口1.88-3.12bar，回流口1.35-2.35bar，蠕动泵的转速为7.5-12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40-75℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

再进一步优选为：

A.制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入15倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%的中温淀粉酶，酶解37分钟，加入0.75%的多糖专用大孔径活性炭，脱色50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于125倍量的纯化水后上树脂柱，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5BV/h，再用6倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为1.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口3.12bar，回流口1.35bar，蠕动泵的转速为12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

还优选为：

A． 制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入25倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.31%的中温淀粉酶，酶解22分钟，加入1.25%的多糖专用大孔径活性炭，脱色30分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于75倍量的纯化水后上树脂柱，用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为2.5BV/h，再用4倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为2.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，40℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为1.25kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口1.88bar，回流口2.35bar，蠕动泵的转速为7.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊， 75℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，后即得人参酸性多糖。

还优选为：

A． 制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入20倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.25%的中温淀粉酶，酶解30分钟，加入1%的多糖专用大孔径活性炭，脱色40分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于100倍量的纯化水后上树脂柱，用4倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为2BV/h，再用5倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为2BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，60℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为1kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口2.5bar，回流口1.8bar，蠕动泵的转速为10rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，60℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

为了充分的利用人参这一珍贵的植物资源,我们利用醇提后的人参废渣为原料，通过醇沉、酶解、脱色、D900阴离子树脂吸附、盐析和超滤等方法分离纯化出人参酸性多糖。对人参多糖的纯度的测定文献多有报道，但都是以葡萄糖为指标，采用苯酚-浓硫酸法测定纯度达90%以上，不可避免的增加了中性多糖的干扰，而以D-半乳糖醛酸计，采用间羟联苯测定的纯度达90%以上的分离纯化工艺研究鲜有报道，对人参废料中的酸性多糖进行分离、纯化，使人参酸性多糖的含量以D-半乳糖醛酸计，采用间羟联苯测定的纯度达90%以上，并且优选的工艺稳定可靠、简便易行，适合于工业化生产。

1、仪器与试药

Cary60型紫外可见分光光度计( 美国安捷伦)；XP105DR型十万分之一电子天平(Mettlet Toledo)；YC-1800型实验室低温喷雾干燥机（上海雅程仪器设备有限公司）；DD6M型离心机（湖南湘立离心机厂）；PALL超滤系统（美国PALL公司）。人参醇提后药渣 (石家庄以岭药业股份有限公司提取车间提供)，D-半乳糖醛酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为111646-200301，供含量测定用)，淀粉酶（邢台万达生物有限公司），活性炭（溧阳南山活性炭有限公司），AB-8和D101型大孔吸附树脂、D201型阴离子交换树脂、聚酰胺吸附树脂，JK008型阳离子交换树脂和D900阴离子交换树脂(沧州宝恩吸附材料有限公司)，四硼酸钠和间羟联苯（sigma公司），浓硫酸为优级纯(天津科密欧化学试剂有限公)，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1 人参粗多糖的制备

称取人参醇提后药渣500克，每次加入10倍量的水，提取2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇，使醇浓度为60%，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，加入0.25%的中温淀粉酶，酶解30分钟，加入1%的多糖专用大孔径活性炭，脱色40分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇，使醇浓度为60%，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品。

2.2 间羟联苯法测定糖醛酸

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取D-半乳糖醛酸15.54 mg，加蒸馏水溶解并定容至100 mL量瓶中，配成155.4g/mL对照品溶液。

2.2.2 线性关系考察

精密量取D-半乳糖醛酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于具塞试管中，加蒸馏水至1.0 mL，在冰浴中预冷后加入12.5mmol/L 四硼酸钠硫酸溶液6mL，摇匀，在沸水浴中煮沸10 min。取出以冰浴冷却至室温，分别加入0.15%间羟联苯溶液80L，摇匀，超声5min，室温放置10min。以1.0 mL 蒸馏水同上操作制得空白对照，于525 nm 处测定A 值，以D-半乳糖醛酸质量浓度为横坐标（C），A值为纵坐标（A）进行线性回归，得回归方程A＝0.0134 C+0.0085，r＝0.9998，D-半乳糖醛酸在15.54～54.39g/mL内线性关系良好。

2.3 树脂的预处理

阴离子交换树脂：用蒸馏水浸泡24h，并用蒸馏水洗至水液澄清，倾去水后加1mol/LHCl 溶液浸泡24h，水洗至中性，最后加入1mol/LNaOH溶液浸泡24h，并用水洗至中性。

阳离子交换树脂：用蒸馏水浸泡24h，并用蒸馏水洗至水液澄清，倾去水后加1mol/L NaOH 溶液浸泡24h，水洗至中性，加入1mol/LHCl溶液浸泡24h，用水洗至中性。

大孔吸附树脂和聚酰胺吸附树脂：95%乙醇浸泡24h，并以95%乙醇洗至加等量的蒸馏水无气泡产生，然后用蒸馏水洗至无醇味。

2.4人参酸性多糖的纯化与结果

2.4.1人参酸性多糖的树脂纯化研究

2.4.1.1树脂型号的筛选

精密称取人参多糖粗品0.4克置200 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，制成浓度为2 mg /mL的多糖溶液，分别精密称取经预处理的六种干树脂约5.0g，置于250ml具塞锥形瓶中。分别精密加入2.0mg/ml的人参多糖溶液25ml，恒温振荡33℃12h树脂充分吸附后过滤，间羟联苯法测定吸附残液中多糖含量。按下列公式计算各树脂的吸附量q(mg/g)及吸附率E(%)。q =(C0－C) V/m；E=( C0－C)/ C0×100。式中: C0为起始浓度(mg /ml);C为平衡浓度(mg/ml);V为溶液体积( ml);m为加入树脂的质量(g)。六种树脂对人参多糖的静态吸附试验结果显示，D900阴离子吸附树脂对于人参多糖的吸附能力高于其他树脂。见表1。

2.4.1.2树脂最大上样量的确定

精密称取经预处理的D900阴离子树脂5克，湿法装柱，将浓度为2.0mg/ml的人参粗多糖溶液，由滴液漏斗向柱中滴流，控制2ml/min的流速，每隔2min收集过柱液并测定多糖浓度，以流出液浓度为上样液浓度的10%来确定泄露点，随即停止上样。根据测试的多糖浓度，以吸光值A作为纵坐标，以收集多糖溶液累计体积(ml)为横坐标，绘制D900阴离子树脂对人参粗多糖的动态吸附穿透曲线，确定上样量，如图1所示。结果显示，当上样量达10ml时，流出液浓度为上样液浓度(2.0mg/ml) 的10%，确定人参粗多糖溶液上样量为18 ml，即上样量为36mg。

2.4.1.3洗脱剂的选择

精密称取经预处理的D900阴离子树脂约5.0 g，共6 份，置于250 ml具塞锥形瓶中。分别加入25 ml 浓度为2.0 mg /ml的人参粗多糖溶液，恒温振荡33℃12h后过滤，测定吸附残液中多糖含量，计算吸附量。在上述已知吸附量的6份树脂中，分别加入40ml纯水以及0.1molNaCl、、0.2molNaCl、0.3molNaCl、0.5molNaCl、1molNaCl的乙醇溶液40ml进行洗脱。其解吸率依次为0.96%、20.16%、60.32.12%、80.69%、75.34%、73.42%，恒温振荡33℃24h，分别测定洗脱液中人参多糖含量，筛选出解吸率最高的洗脱剂。由此可见，随着氯化钠浓度的增加，人参多糖的解吸率呈不断上升的趋势，0.3molNaCl溶液可达到80.69%的解吸率，随着氯化钠浓度的继续增加，解析率略有下降。且为了后期除盐方便，故洗脱溶剂可以选择先用水洗脱，再选择浓度0.3molNaCl溶液作为洗脱剂。

2.4.1.4洗脱量的确定

精密称取经预处理的D900阴离子树脂5克，湿法装柱，将浓度为2.0mg/ml的人参粗多糖溶液，由滴液漏斗向柱中滴流，控制2ml/min的流速，上样18ml，静置12h。加入0.3molNaCl溶液作为洗脱剂，控制2ml/min的流速，每3min 收集过柱液并测定多糖浓度，共收集42ml。根据测试的多糖浓度，绘制D900阴离子树脂对人参粗多糖的动态解吸曲线，确定洗脱液用量，如图2所示。结果显示，采用0.3molNaCl进行解吸时，洗脱峰集中、对称，无明显拖尾现象0.3molNaCl30ml基本上可以将人参粗多糖完全洗脱下来，约为5倍柱体积，故确定洗脱液用量为5倍柱体积。

2.4.1.5洗脱流量的确定

取D900阴离子树脂5g 湿法装柱，按动态吸附试验方法，上样人参粗多糖溶液18mL，分别控制体积流量为1、1.5、2、2.5、3BV/h，并用5倍柱体积的0.3molNaCl进行洗脱，绘制不同体积流量下多糖含量的曲线，如图3所示。结果表明随着试液体积流量的增大，树脂对人参多糖的吸附量减少，这是因为体积流量过大，NaCl与人参多糖分子之间没有足够的接触；离子交换不完全。因此，考虑洗脱彻底、节省时间及大生产的可行性，选择体积流量为2BV/h。

2.4.1.6径高比的确定

取不同量的D900阴离子树脂，用直径为15mm的玻璃色谱柱装柱，使径高比分别为1∶5、1∶7、1∶9，按最大上样量，精密吸取人参多糖样品液，以2BV/h的体积流量过树脂，，分别用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，再用5倍柱体积的0.3molNaCl进行洗脱，收集洗脱液，测定人参多糖的含量，结果见表2。从实验结果可看出，随着径高比的增加，树脂对人参多糖的吸附有所增大，树脂径高比从1∶5增大到1∶7 时，增加明显，但从1∶7增大到1∶9 时，趋于平缓，综合考虑人参多糖的吸附率及工业生产的可行性，选择树脂径高比为1∶7。

综上：人参酸性多糖的树脂纯化的参数为：D900阴离子树脂，流速为2BV/h，径高比为1∶7，上样量为≤7mg人参粗多糖/克树脂，洗脱溶剂先用纯水洗脱再用0.3molNaCl溶液洗脱，洗脱体积为5倍柱体积。

2.4.2盐析法的纯化

取人参酸性多糖的D900阴离子树脂氯化钠洗脱液，（60℃）减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液至冰箱中冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清。

2.4.3脱盐的工艺研究

2.4.3.1脱盐方法的比较

人参酸性多糖盐析后的溶液，选择两种方式进行脱盐，即透析法与超滤法，脱盐后的溶液通过硝酸银溶液检测未见浑浊为终点，经过比较两种方式均能达到很好的除盐目的，但是考虑到大生产透析无法实现，故选择超滤法除盐。

2.4.3.2截留分子量的选择

分别选择1kd，3kd，5kd，10kd，30kd的不同超滤膜包进行脱盐研究，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口2.5bar，回流口1.8bar，蠕动泵的转速为10rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊。

分别测定不同溶液中人参酸性多糖的纯度，结果见表3，从实验结果可以看出，3kd，5kd，10kd，30kd超滤膜包，人参酸性多糖的损失比较多，纯度也偏低，故将超滤截留分子量选择为1kd。

2.4.4干燥方式的比较

综合比较减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥，结果，减压干燥样品复溶性较差，冷冻干燥和喷雾干燥，复溶效果差不多，颜色也比较接近，为了节能和工业化生产需要，故选择喷雾干燥作为样品的干燥方式。

2.4.5小试工艺验证：

按实验确定的方案，取阴离子交换树脂D900约400g 装柱（50mm×260 mm），按照阴离子交换树脂预处理方法处理备用。取人参多糖粗品3g，溶于300ml纯化水后上树脂柱，收集过柱液，控制体积流量为2BV/h，然后用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为2BV/h，合并过柱液和水洗液，定容后留样，最后用5倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为2BV/h，收集洗脱液。得到人参酸性多糖的氯化钠洗脱液。经盐析法纯化和超滤法除盐，最后喷雾干燥得人参酸性多糖，测定醇提药渣喷雾粉、人参粗多糖、D900阴离子流出液和水洗液人参酸性多糖的含量和纯度。结果见表4

2.4.6中试工艺验证与结果

按实验确定的方案，称取人参醇提后药渣1公斤，按照人参粗多糖制备工艺，阴离子交换树脂D900纯化工艺，盐析法纯化和超滤法除盐，最后喷雾干燥得人参酸性多糖的优选工艺，放大制备人参酸性多糖三批，测定三批中试样品中醇提药渣水提液干燥粉、人参粗多糖、人参精多糖的含量和纯度。结果见表5，从实验结果可看出，上述优选出的工艺条件应用于放大试验时，人参多糖的纯度和转移率与小试结果相符合说明该工艺稳定可靠，适用于工业化大生产。

由上述实验可知，人参作为我国珍贵的植物资源,已经被许多企业所利用，但是多数都是利用醇提的人参皂苷入药使用，而醇提后的废渣则被遗弃，本工艺本着变废为宝的理念，以人参醇提后的药渣的为原料对人参酸性多糖的制备工艺进行了研究。

工艺中脱色首次使用的多糖专用的大孔径活性炭对人参多糖溶液的色素起到了明显去除作用；D900阴离子交换树脂的选择性效果很好，对人参中性多糖和酸性多糖分离达到了100%的分离，人参酸性多糖的转移率达到了90%以上；工艺中脱盐采用超滤法代替传统中透析法，不仅节约了时间而且适合产业化。

本工艺制备的人参酸性多糖纯度用间羟联苯法测定以D-半乳糖醛酸计达到了90%以上，目前文献中人参多糖纯度以D-半乳糖醛酸计最高的仅达到了55%以上；而人参多糖纯度达到90%的都是苯酚-浓硫酸法以葡萄糖计算而得，其中人参中性多糖的含量占据了很大部分，因此，本工艺在人参酸性多糖的纯化上优势比较明显，同时，该工艺稳定性好，操作简便，适合于工业化生产。

附图说明

图1：人参粗多糖的吸附泄漏曲线图

图2：动态洗脱曲线图

图3：体积流量洗脱曲线图

具体实施方式：

下述实施例用于举例说明本发明制备方法但其不能对本发明的范围构成任何限制。

实施例1：

A、制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣100g，每次加入1500ml的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%的中温淀粉酶，酶解37分钟，加入75%的多糖专用大孔径活性炭，脱色50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品3g，溶于375ml的纯化水后上树脂柱，用1875ml的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5BV/h，再用2250ml浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为1.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口3.12bar，回流口1.35bar，蠕动泵的转速为12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖1.83g。将所得的样品间羟联苯法测定，人参酸性多糖的纯度为93.9%。

实施例2：

A． 制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣100g，每次加入2500ml的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.31%的中温淀粉酶，酶解22分钟，加入1.25%的多糖专用大孔径活性炭，脱色30分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品3g，溶于225ml的纯化水后上树脂柱，用675ml的蒸馏水洗脱，控制体积流量为2.5BV/h，再用900ml浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为2.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，40℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为1.25kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口1.88bar，回流口2.35bar，蠕动泵的转速为7.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊， 75℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖2.05g。将所得的样品间羟联苯法测定，人参酸性多糖的纯度为96.8%。

实施例3：

A． 制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣100g，每次加入2000ml的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.25%的中温淀粉酶，酶解30分钟，加入1%的多糖专用大孔径活性炭，脱色40分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B． 第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品3g，溶于300ml的纯化水后上树脂柱，用1200ml的蒸馏水洗脱，控制体积流量为2BV/h，再用1500ml浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为2BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，60℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为1kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口2.5bar，回流口1.8bar，蠕动泵的转速为10rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，60℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖1.95g。将所得的样品间羟联苯法测定，人参酸性多糖的纯度为94.7%。

Claims (4)

1.一种从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖的制备方法，其特征在于该人参酸性多糖制备方法包括以下步骤：

A．制备人参粗多糖：称取人参醇提后的干燥药渣，每次加入15-25倍量的水，提取2次，合并水提液离心，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%-75%醇溶液，醇沉过夜，离心；沉淀经醇洗脱后挥尽乙醇，沉淀用水充分溶解，加入0.19%-0.31%的中温淀粉酶，酶解22-37分钟；加入0.75%-1.25%的多糖专用大孔径活性炭，脱色30-50分钟，离心，去除活性炭；上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经醇洗脱后挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B．第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于75-125倍量的纯化水后上树脂柱，用3-5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5 BV/h -2.5BV/h，再用4-6倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为1.5 BV/h -2.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，40℃-75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75 kd-1.25kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口1.88 bar -3.12bar，回流口1.35bar -2.35bar，蠕动泵的转速为7.5 rpm -12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊；40℃-75℃减压浓缩后，加入乙醇制成醇浓度为45%-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述人参酸性多糖制备方法包括以下步骤：

A．制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入15倍量的水，提取2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%的中温淀粉酶，酶解37分钟，加入0.75%的多糖专用大孔径活性炭，脱色50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B．第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于125倍量的纯化水后上树脂柱，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5BV/h，再用6倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为1.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口3.12bar，回流口1.35bar，蠕动泵的转速为12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40℃减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述人参酸性多糖制备方法包括以下步骤：

A．制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入25倍量的水，提取2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.31%的中温淀粉酶，酶解22分钟，加入1.25%的多糖专用大孔径活性炭，脱色30分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B．第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于75倍量的纯化水后上树脂柱，用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为2.5BV/h，再用4倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为2.5BV/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，40℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为1.25kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口1.88bar，回流口2.35bar，蠕动泵的转速为7.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊， 75℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E. 干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述人参酸性多糖制备方法包括以下步骤：

A．制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入20倍量的水，提取2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.25%的中温淀粉酶，酶解30分钟，加入1%的多糖专用大孔径活性炭，脱色40分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

B．第一次纯化：取阴离子交换树脂D900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于100倍量的纯化水后上树脂柱，用4倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为2BV/h，再用5倍柱体积浓度为0.3M的NaCl溶液洗脱，控制体积流量为2BV/h，收集氯化钠洗脱液，得到人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

C．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，60℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

D．第三次纯化：步骤C纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为1kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口2.5bar，回流口1.8bar，蠕动泵的转速为10rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，60℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

E.干燥：步骤D纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

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