CN100439385C - 从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法。采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提杨梅中的花色苷，用阳离子交换树脂对浸提物初步纯化，用逆流色谱仪分离纯化杨梅花色苷粗提物中的C3G，其溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和含三氟乙酸(TFA)水溶液组成，TBME、乙腈和正丁醇的体积比为1～2∶1∶1～4，水的用量保证使溶剂系统上下相分层，TFA水溶液的浓度为0.1%～1%，用紫外-可见检测器检测洗出液，根据所得的色谱图收集C3G组分。本发明使用基于液-液分配的逆流色谱技术，分离重现性好，样品回收率高，是一种经济、高效的从杨梅中分离制备高纯度矢车菊色素-3-葡萄糖苷的方法。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及杨梅深加工技术，特别是从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法。
技术背景
杨梅是我国的传统特产水果，其果实风味独特，甜酸适口，且具有很高的营养保健价值，含有丰富的营养物质和活性物质，花色苷类化合物是其中最主要的一类活性成分。杨梅花色苷主要成分为矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)。国内外研究表明C3G具有抗氧化、抗癌、抗突变等生物活性，并对DNA分裂有保护作用和减轻眼睛的疲劳、提高夜间视力和改善视觉瞬间改变适应性。从杨梅分离制备C3G未有文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种成本较低、经济适用的从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提杨梅中的花色苷；用阳离子交换树脂对浸提得到提取物进行初步纯化，得到杨梅花色苷粗提物；以逆流色谱仪为分离设备分离纯化杨梅花色苷粗提物中的C3G.，其溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液组成，TBME、乙腈和正丁醇的体积比为1～2∶1∶1～4，水的用量应至少保证使溶剂系统上下相分层，TFA水溶液的浓度为0.1％～1％。上相做固定相，下相做流动相。
以上方案按步骤叙述如下：
1、采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提杨梅中的C3G，得到C3G提取液。
2、将C3G提取液浓缩至含固形物60％左右；
3、在上述浓缩液中加入适量的水(浓缩液体积的1-2倍)，用乙酸乙酯萃取两次脱脂，水相用阳离子交换树脂吸附和酸化甲醇解吸处理，得到初步纯化的C3G洗脱液；
4、将C3G洗脱液真空浓缩至糊状，再冷冻干燥，获杨梅C3G粗提物；
5、采用逆流色谱方法分离纯化C3G粗提物；
6、收集逆流色谱分离的C3G组分进行真空浓缩，直至固形物浓度达到40％以上，再采用冷冻干燥，得到C3G粉末。
步骤(1)所述的浸提过程是：采用含5％甲酸的甲醇或含5％甲酸的乙醇做溶剂，浸提溶剂与杨梅的体积比为5～10∶1，条件为室温、避光，浸提时间为24小时，浸提次数2～3次。
步骤(2)、步骤(4)和步骤(6)所述真空浓缩的真空度低于0.09Mpa，温度为35～40℃。
步骤(4)和步骤(6)所述冷冻干燥的真空度低于50Pa，温度低于-35℃。
步骤(5)所述逆流色谱方法为：采用逆流色谱仪为分离设备，溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液组成，TBME、乙腈和正丁醇的体积比为1～2∶1∶1～4，水的用量应至少保证使溶剂系统上下相分层，TFA水溶液的浓度为0.1％～1％，上相做固定相，下相做流动相；用泵将上述溶剂系统的上相注入逆流色谱仪的色谱柱，并取上述溶剂系统的部分下相溶解花色苷粗提物制备逆流色谱样品溶液；开启逆流色谱仪和流动相输液泵，将样品溶液和流动相输入逆流色谱分离柱；用紫外-可见检测器检测逆流色谱流出液，根据所得的色谱图收集C3G组分。
步骤(5)所述逆流色谱方法中的逆流色谱仪为高速逆流色谱仪(HSCCC)或低速逆流色谱仪(SRCCC)。
本发明的优点是：使用基于液-液分配的逆流色谱技术，分离重现性好，样品回收率高，是一种经济、高效的从杨梅中分离制备高纯度矢车菊色素-3-葡萄糖苷的方法。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为实施例1的HSCCC分离图谱。
图3为实施例1分离所得的C3G的HPLC图谱。
图4为实施例2的HSCCC分离图谱。
图5为实施例3的SRCCC分离图谱。
具体实施方式
实施例1
本发明的工艺流程参考图1：
1、采用含5％甲酸的甲醇或含5％甲酸的乙醇做溶剂，浸提溶剂与杨梅的体积比为5～10∶1，在室温条件下避光浸提，时间24小时，浸提次数2～3次。
2、将浸提液进行真空浓缩，直至固形物浓度占花色苷浓缩液的60％以上。
3、步骤2所得到的杨梅花色苷浓缩液中按浓缩液体积计加入1～2倍量的水，再用乙酸乙酯萃取两次脱脂，水相采用型号为DIAION HP2MGL的阳离子交换树脂吸附，再用酸化甲醇解吸处理，得到初步纯化的花色苷洗脱液。
4、将步骤3所得到的花色苷洗脱液进行真空浓缩至糊状，再采用冷冻干燥得到杨梅花色苷粗提物。
5、逆流色谱分离纯化C3G。
本发明步骤1、步骤2和步骤5中真空浓缩过程的真空度低于0.09Mpa，温度为35～40℃。
本发明步骤3和步骤5中冷冻干燥时的真空度低于50Pa，温度低于-35℃。
为进一步详细说明本发明步骤4的逆流色谱仪纯化过程，以3例分述如下：
实施例1
本实施例的溶剂系统采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝1.5∶1∶2∶5，TFA水溶液浓度为0.1％；逆流色谱仪为HSCCC-D1000高速逆流色谱仪，C3G粗提物中C3G约占36％。
量取TBME 300ml、乙腈200ml、正丁醇400ml，TFA 1ml和水1000ml，置于2000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。将上相以40ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。称取C3G粗提物2.0g溶于50ml下相中制备逆流色谱样品溶液，开启逆流色谱仪至800转/min，然后以1.0ml/min的流速输入样品溶液，待进样结束后，再以2.0ml/min的流速输入流动相以洗脱柱内的组分，用紫外可见检测器在520nm下检测逆流色谱流出液，根据检测器采集的图谱收集C3G组分。分离得到C3G组分676mg，纯度达96％以上。
实施例2
本实施例的溶剂系统采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝2∶1∶4∶8，TFA水溶液浓度为1％，逆流色谱仪为HSCCC-D1000高速逆流色谱仪，杨梅花色苷提取物中C3G约占53％。
量取TBME 400ml、乙腈200ml、正丁醇800ml、TFA 16ml和水1600ml，置于3000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。将上相以40ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。C3G粗提物2.0g溶于50ml下相中制备逆流色谱样品溶液，开启逆流色谱仪至800转/min，然后以1.0ml/min的流速输入样品溶液，待进样结束后，再以2.0ml/min的流速输入流动相洗脱柱内的组分，用紫外可见检测器在520nm下检测逆流色谱流出液，根据检测器采集的图谱收集C3G组分。分离得到C3G组分656mg，纯度达98％以上。
实施例3
本实施例的溶剂系统采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝2∶1∶4∶10，TFA水溶液浓度为0.1％，逆流色谱仪为SRCCC-D3500低速逆流色谱仪，杨梅花色苷提取物中C3G约占53％。
量取TBME 1600ml、乙腈800ml、正丁醇3200ml、TFA 8ml和水8000ml，置于15000ml玻璃瓶，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。将上相以60ml/min的流速注入低速逆流色谱的色谱柱。称取C3G粗提物6.5g溶于180ml下相中制备逆流色谱样品溶液，开启低速逆流色谱仪至80转/min，然后以2.0ml/min的流速输入样品溶液，待进样结束后，再以5.0ml/min的流速输入流动相洗脱柱内的花色苷组分，用紫外可见检测器在520nm下检测逆流色谱流出液，根据检测器采集的图谱收集C3G组分。分离得到C3G组分2225mg，纯度在95％以上。
Claims (6)
1、从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于以下步骤：
(1)采用酸化甲醇或酸化乙醇浸提杨梅中的C3G，得到C3G提取液。
(2)将C3G提取液浓缩至含固形物60％左右；
(3)在上述浓缩液中加入浓缩液体积的1～2倍量的水，用乙酸乙酯萃取两次脱脂，水相用阳离子交换树脂吸附和酸化甲醇解吸处理，得到初步纯化的C3G洗脱液；
(4)将C3G洗脱液真空浓缩至糊状，再冷冻干燥，获杨梅C3G粗提物；
(5)采用逆流色谱方法分离纯化C3G粗提物；
(6)收集逆流色谱分离的C3G组分进行真空浓缩，直至固形物浓度达到40％以上，再采用冷冻干燥，得到C3G粉末。
2、根据权利要求1所述从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步骤(1)所述的浸提过程是：采用含5％甲酸的甲醇，或含5％甲酸的乙醇做溶剂，浸提溶剂与杨梅的液料体积比为5～10∶1，条件为室温，避光，浸提时间24小时，浸提次数2～3次。
3、根据权利要求1所述从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步骤(2)、步骤(4)和步骤(6)所述真空浓缩的真空度低于0.09Mpa，温度为35～40℃。
4、根据权利要求1所述从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步骤(4)和步骤(6)所述冷冻干燥的真空度低于50Pa，温度低于-35℃。
5、根据权利要求1所述从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步骤(5)所述逆流色谱方法为：采用逆流色谱仪为分离设备，溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚和三氟乙酸水溶液组成，甲基叔丁基醚、乙腈和正丁醇的体积比为1～2∶1∶1～4，水的用量应至少保证使溶剂系统上下相分层，三氟乙酸水溶液的浓度为0.1％～1％，上相做固定相，下相做流动相；用泵将上述溶剂系统的上相注入逆流色谱仪的色谱柱，并取上述溶剂系统的部分下相溶解花色苷粗提物制备逆流色谱样品溶液；开启逆流色谱仪和流动相输液泵，将样品溶液和流动相输入逆流色谱分离柱；用紫外-可见检测器检测逆流色谱流出液，根据所得的色谱图收集C3G组分。
6、根据权利要求1所述从杨梅中分离制备矢车菊色素-3-葡萄糖苷(C3G)的方法，其特征在于步骤(5)所述逆流色谱方法所用的逆流色谱仪为高速逆流色谱仪或低速逆流色谱仪。
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