CN100439384C - 从桑椹中分离制备花色苷单体的方法 - Google Patents
从桑椹中分离制备花色苷单体的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为一种从桑椹中分离制备高纯度花色苷单体的方法。采用酸化乙醇浸提桑椹中的花色苷；用阳离子交换树脂对桑椹乙醇提取物进行初步纯化；以逆流色谱技术分离桑椹花色苷粗提物中的花色苷，其溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液组成，TBME、乙腈和正丁醇的体积比为1∶0.5～1∶1.25～3.5，TFA水溶液的浓度为每升水溶液中含1～10毫升TFA。本发明使用高速逆流色谱仪(HSCCC)或低速逆流色谱仪(SRCCC)为分离设备，有效降低了花色苷单体的制备成本。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，涉及桑椹的深加工技术，具体为从桑椹中分离制备高纯度花色苷单体的方法。
技术背景
桑堪含有丰富的营养物质和花色苷，还具有很高的药用价值，我国卫生部食品卫生监督检验所已于1988年将桑椹列入既是食品又是药品名单。现有研究表明天然花色苷类物质有很强的抗氧化活性，可消除机体代谢过程中产生的过多自由基，延缓衰老、预防各种疾病等功能，还具有抗癌、抗突变等生物活性，并对DNA分裂有保护作用和减轻眼睛的疲劳、提高夜间视力和改善视觉瞬间改变适应性。
现有关于花色苷的分离主要采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱和制备型高效液相色谱，其局限性是分离量少。其次，高效液相色谱柱和Sephadex LH-20价格昂贵、再生使用相对困难，分离得到花色苷单体成本较高，难以发展成为制备量大的分离技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备成本低于现有技术，可以较大批量从桑椹中分离制备高纯度花色苷单体的经济高效的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：采用酸化乙醇浸提桑椹中的花色苷；采用阳离子交换树脂对桑椹乙醇提取物进行初步纯化，得到桑椹花色苷粗提物；以逆流色谱仪为分离设备分离纯化桑椹花色苷粗提物中的花色苷，其溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液组成，TBME、乙腈和正丁醇的体积比为1∶0.5～1∶1.25～3.5，三氟乙酸(TFA)水溶液的浓度为每升水溶液中含1～10毫升三氟乙酸。水的用量应至少保证使溶剂系统上下相分层，上相做固定相，下相做流动相。
本发明方案用下述步骤加以进一步叙述：
1.采用酸化乙醇浸提原料桑椹中的花色苷，将含有花色苷的浸提液真空浓缩，直至固形物浓度在花色苷浓缩液的60％以上；
2.在花色苷浓缩液中加入适量的水，用乙酸乙酯萃取脱脂两次，去除脂溶性成分后，水相通过阳离子交换树脂吸附和酸化甲醇解吸处理，得到初步纯化的花色苷洗脱液；
3.将花色苷洗脱液真空浓缩至糊状，再冷冻干燥，获桑椹花色苷粗提物；
4.采用逆流色谱方法分离桑椹花色苷粗提物中的花色苷；
5.收集逆流色谱分离的目标组分进行真空浓缩，直至固形物浓度达到40％以上，再采用冷冻干燥，得到粉末状花色苷单体。
步骤(1)采用的酸化乙醇为：含5％甲酸的乙醇。
步骤(1)、步骤(3)和步骤(5)中真空浓缩过程的真空度低于0.09Mpa，温度为35～40℃。
步骤(3)和步骤(5)中冷冻干燥的真空度低于50Pa，温度低于-35℃。
步骤(4)采用的逆流色谱方法其溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液组成，三氟乙酸水溶液的浓度为每升水溶液中含1～10毫升三氟乙酸。
步骤(4)所使用的逆流色谱仪为高速逆流色谱仪(HSCCC)或低速逆流色谱仪(SRCCC)。HSCCC主要适用于克量级以下的分离制备，SRCCC主要适用于克量级到工业化规模的分离制备。
步骤(4)采用逆流色谱仪纯化桑椹花色苷粗提物的具体过程为：配制溶剂系统，充分摇匀后静置，待分层后，将上下相分开；用泵将溶剂系统的上相注入逆流色谱仪的色谱柱；取溶剂系统的下相溶解桑椹花色苷粗提物制备逆流色谱分离的样品溶液；开启逆流色谱仪，注入样品溶液(注入顺序可以是先注入样品溶液然后注入流动相，也可以先注入流动相预平衡后再注入样品溶液)；用紫外-可见检测器检测洗出液，根据所得的色谱图收集目标组分。
本发明的优点是：分离效果好、效率高，花色苷单体产品的纯度达到96％以上，花色苷单体制备成本远低于现有技术，是一种经济、高效的从桑椹中分离制备高纯度花色苷单体的方法。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为实施例1的HSCCC-D400分离图谱。
图3为实施例2的HSCCC-D400分离图谱。
图4为实施例3的HSCCC-D1000分离图谱。
图5为实施例4的SRCCC-D3500分离图谱。
具体实施方式
参考附图1：
1、采用含5％甲酸的乙醇(酸化乙醇)提取桑椹中的花色苷，浸提液进行真空浓缩，直至固形物浓度达到60％以上。
2、步骤1所得到的桑椹花色苷浓缩液加入适量的水，再用乙酸乙酯萃取两次脱脂，水相通过阳离子交换树脂吸附和酸化甲醇解吸处理，得到初步纯化的含花色苷的洗脱液。
3、步骤2所得到的含花色苷的洗脱液进行真空浓缩至糊状，再采用冷冻干燥得到桑椹花色苷粗提物。
4、逆流色谱分离桑椹花色苷粗提物中的花色苷。
a)配制溶剂系统，充分摇匀后静置，待分层后，将上下相分开备用。
b)用泵将上述溶剂系统的上相注入逆流色谱仪的色谱柱，并取上述溶剂系统的部分下相溶解桑椹花色苷提取物，制备逆流色谱分离样品溶液。
c)开启逆流色谱仪，注入上述溶解的桑椹花色苷提取物的样品溶液及流动相(注入顺序可以是先注入样品溶液然后注入流动相，也可以先注入流动相预平衡后再注入样品溶液)。
d)紫外-可见检测器检测逆流色谱流出液，根据所得的色谱图收集目标组分。
5.收集的目标组分进行真空浓缩，直至固形物浓度达到40％以上，再采用冷冻干燥，得到花色苷单体粉末。纯度为92～96。
本发明步骤1中采用含5％甲酸的乙醇做溶剂，液料比1∶4～8，温度为室温，避光，浸提时间24小时，浸提次数2～3次。
本发明步骤2中采用乙酸乙酯脱脂，阳离子交换树脂型号为XAD-7。
本发明步骤1、步骤2和步骤5中真空浓缩过程的真空度低于0.09Mpa，温度为35～45℃。
本发明步骤3和步骤5中冷冻干燥时的真空度低于50Pa，温度低于-35℃。
本发明步骤4以逆流色谱仪为分离设备分离，其溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚(TBME)和三氟乙酸(TFA)水溶液组成，比例为1∶0.5～1∶1.25～3.5∶3～10(体积比)。TFA水溶液的浓度为每升水溶液中含1～10毫升TFA。
为进一步详细说明本发明步骤4的逆流色谱仪纯化过程，以4例分述如下：
实施例1
本实施例的溶剂系统按体积比采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝1∶1∶3∶5，TFA水溶液的浓度为每升水溶液中含1毫升TFA，逆流色谱仪为HSCCC-D400高速逆流色谱仪，桑椹花色苷粗提物中花色苷含量约占46％。
量取TBME 150ml、乙腈150ml、正丁醇450ml和三氟乙酸水溶液750ml，置于2000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。将上相以20ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。开启逆流色谱仪至800转/min，然后以0.7ml/min的流速泵入样品溶液(溶解有0.6g桑椹花色苷粗提物的15ml下相溶液)，待进样结束后，再以1.2ml/min的流速注入流动相洗脱柱内的花色苷组分，用紫外可见检测器在520nm下检测洗出液，根据检测器采集的图谱收集花色苷组分。分离得到矢车菊色素-3-氧-(6″-氧-α-吡喃型鼠李糖基-β-吡喃型葡萄糖)苷(C3RG)108.5mg，矢车菊色素-7-β-吡喃型葡萄糖苷(C7G)96.3mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型葡萄糖苷(C3G)19.2mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型半乳糖苷(C3Ga)9.5mg。纯度都在96％以上。
实施例2
本实施例的溶剂系统按体积比采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝2∶1∶2.5∶6，TFA水溶液的浓度为每升水溶液中含5毫升TFA，逆流色谱仪为HSCCC-D400高速逆流色谱仪，桑椹花色苷粗提物中花色苷含量约占46％。
量取TBME 300ml、乙腈150ml、正丁醇375ml和TFA水溶液900ml，置于2000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。将上相以20ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。开启逆流色谱仪至800转/min，然后以0.7ml/min的流速泵入样品溶液(溶解有0.6g桑椹花色苷粗提物的15ml下相溶液)，待进样结束后，再以1.2ml/min的流速注入流动相洗脱柱内的花色苷组分，用紫外可见检测器在520nm下检测洗出液，根据检测器采集的图谱收集花色苷组分。分离得到矢车菊色素-3-氧-(6″-氧-α-吡喃型鼠李糖基-β-吡喃型葡萄糖)苷(C3RG)68.5mg，矢车菊色素-7-β-吡喃型葡萄糖苷(C7G)48.3mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型葡萄糖苷(C3G)20.2mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型半乳糖苷(C3Ga)10.5mg。纯度都在96％以上。
实施例3
本实施例的溶剂系统按体积比采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝1∶1∶3.5∶6，TFA水溶液的浓度为每升水溶液中含5毫升TFA，逆流色谱仪为HSCCC-D1000高速逆流色谱仪，桑椹花色苷粗提物中花色苷含量约占38％。
量取TBME 250ml、乙腈250ml、正丁醇875ml和TFA水溶液1500ml，置于3000ml分液漏斗，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。将上相以40ml/min的流速注入高速逆流色谱的色谱柱。开启逆流色谱仪至800转/min，然后以1.0ml/min的流速泵入样品溶液(溶解有1.5g桑椹花色苷粗提物的40ml下相溶液)，待进样结束后，再以2.0ml/min的流速注入流动相洗脱柱内的花色苷组分，用紫外可见检测器在520nm下检测洗出液，根据检测器采集的图谱收集花色苷组分。分离得到矢车菊色素-3-氧-(6″-氧-α-吡喃型鼠李糖基-β-吡喃型葡萄糖)苷(C3RG)233.5mg，矢车菊色素-7-β-吡喃型葡萄糖苷(C7G)203.3mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型葡萄糖苷(C3G)42.6mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型半乳糖苷(C3Ga)19.6mg。纯度都在95％以上。
实施例4
本实施例的溶剂系统按体积比采用TBME∶乙腈∶正丁醇∶TFA水溶液＝1∶1∶3∶8，TFA水溶液的浓度为每升水溶液中含10毫升TFA，逆流色谱仪为SRCCC-D3500低速逆流色谱仪，桑椹花色苷粗提物中花色苷含量约占51％。
量取TBME 800ml、乙腈800ml、正丁醇2400ml和TFA水溶液6400ml，置于10000ml玻璃瓶，充分摇匀，静置分层后，将上下两相分别装入试剂瓶。将上相以60ml/min的流速注入低速逆流色谱的色谱柱。称取桑椹花色苷粗提物5.6g溶于160ml的下相，开启低速逆流色谱仪至80转/min，然后以3.0ml/min的流速泵入样品溶液(溶解有5.6g桑椹花色苷粗提物的160ml下相溶液)，待进样结束后，再以6.0ml/min的流速注入流动相洗脱柱内的花色苷组分，用紫外可见检测器在520nm下检测洗出液，根据检测器采集的图谱收集花色苷组分。分离得到矢车菊色素-3-氧-(6″-氧-α-吡喃型鼠李糖基-β-吡喃型葡萄糖)苷(C3RG)1135.2mg，矢车菊色素-7-β-吡喃型葡萄糖苷(C7G)965.8mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型葡萄糖苷(C3G)175.3mg，矢车菊色素-3-β-吡喃型半乳糖苷(C3Ga)74.4mg。纯度都在92％以上。
Claims (7)
1、从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于以下步骤：
(1)采用酸化乙醇浸提原料桑椹中的花色苷，将含有花色苷的浸提液真空浓缩，直至固形物浓度在花色苷浓缩液的60％以上；
(2)在花色苷浓缩液中加入适量的水，用乙酸乙酯萃取脱脂两次，去除脂溶性成分后，水相通过阳离子交换树脂吸附和酸化甲醇解吸处理，得到初步纯化的花色苷洗脱液；
(3)将花色苷洗脱液真空浓缩至糊状，再冷冻干燥，获桑椹花色苷粗提物；
(4)采用逆流色谱方法纯化桑椹花色苷粗提物；
(5)收集逆流色谱分离的目标组分进行真空浓缩，直至固形物浓度达到40％以上，再采用冷冻干燥，得到粉末状花色苷单体。
2、根据权利要求1所述从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于步骤(1)采用的酸化乙醇为：含5％甲酸的乙醇。
3、根据权利要求1所述从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于步骤(1)、步骤(3)和步骤(5)中真空浓缩过程的真空度低于0.09Mpa，温度为35～40℃。
4、根据权利要求1所述从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于步骤(3)和步骤(5)中冷冻干燥的真空度低于50Pa，温度低于-35℃。
5、根据权利要求1所述从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于步骤(4)采用的逆流色谱方法其溶剂系统由常温常压下处于液态的正丁醇、乙腈、甲基叔丁基醚和三氟乙酸水溶液组成，三氟乙酸水溶液的浓度为每升水溶液中含1～10毫升三氟乙酸。
6、根据权利要求1所述从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于步骤(4)所使用的逆流色谱仪为高速逆流色谱仪或低速逆流色谱仪。
7、根据权利要求1所述从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，其特征在于步骤(4)采用逆流色谱仪纯化桑椹花色苷粗提物的具体过程为：配制溶剂系统，充分摇匀后静置，待分层后，将上下相分开；用泵将溶剂系统的上相注入逆流色谱仪的色谱柱；取溶剂系统的下相溶解桑椹花色苷粗提物制备逆流色谱分离样品溶液；开启逆流色谱仪，注入逆流色谱分离样品溶液，然后注入流动相，用紫外-可见检测器检测逆流色谱流出液，根据所得的色谱图收集目标组分。
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