CN101565437B - 万寿菊素-3-o-葡萄糖苷和紫云英苷的分离制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷的分离制备方法；它是采用逆流色谱法从植物黄顶菊乙醇回流提取物中分离制备高纯度万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，其溶剂组分由三个组分构成：由醚类或正构烷烃或脂肪酯、乙腈或脂肪醇或脂肪酮和水构成，体积比依次为：30-10∶1∶30-10；其适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备单体万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，能直接进大量粗品或合成混合物，分离纯度能达到95％以上。

Description

万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷的分离制备方法

技术领域

本发明涉及一种采用高速逆流色谱法从外来入侵植物黄顶菊提取物中分离制备出高纯度单体万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷的分离制备方法。

背景技术

黄顶菊[Flaveria bidentis(L.)Kuntze]为菊科堆心菊族黄顶菊属(Flaveria)一年生草本植物，起源于南美洲。黄顶菊植株高大密集，种子产量惊人，繁殖能力和适应性极强，可入侵农田、路边、荒地等多种生境，并能通过化感作用抑制其它植物的生长，从而迅速占领生态位。除原产地以外，黄顶菊在其他国家和地区均表现出入侵性，对生态环境和农业生产具有极大威胁，是一种危险性极高的外来入侵植物。自2001年在我国衡水湖畔首次发现以来，黄顶菊在河北、天津等地迅速蔓延。从目前的防治经验来看，仅依靠传统的人工铲除和简单的药剂防治很难达到理想的控制效果，因此，从化学生态学的角度阐明物种之间相互作用的化学基础，深层次揭示其入侵机理及对生态系统和生物多样性的影响，对于建立黄顶菊可持续发展的综合防御和控制体系是必需也是迫切的。另一方面，在研究治理措施的同时，若能进行深入研究，进一步开发活性次生物质及相应的医药和农用功能，就可变废为宝、变害为益，为黄顶菊的综合治理寻找到一条新的出路。文献报道黄顶菊中主要活性物质是黄酮类化合物，黄酮类化合物有广泛的生理和药理作用，如双重雌激素样作用、消除活性氧自由基、抵抗生物氧化、抑制炎症反应，调节免疫功能、调节血脂、预防动脉硬化，防癌抗癌、抑制肿瘤、抑菌和抗病毒、延缓衰老等作用。

现有文献报道采用柱层析及高效液相色谱的方法分离，经反相硅胶柱，碳十八柱，及Sephadex LH-20柱从乙醇取后粗品分离获得万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，或者经反复多次硅胶柱分离获得万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，工艺繁琐，成本高，回收率低。逆流色谱分离制备方法可以达到高纯度，成本低，回收率高，优于传统的柱层析及高效液相色谱分离方法在两方面，一方面没有固态支持体无不可逆吸附损失，另一方面粗品可以直接上柱。由于高速逆流色谱(High-speed CountercurrentChromatography，HSCCC)是近些年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的各种问题---样品易被吸附、损耗和变性，使用其它液相色谱法进行制备量分离时，其分配效率会明显降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。逆流色谱仪能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，甚至能直接接质谱仪等仪器，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。

发明内容

本发明的目的是以乙醇提取的黄顶菊粗品为原料从含量仅为2.1％的万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷经高速逆流色谱的方法得到纯度95％以上的万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷。

本发明的方案是：乙醇回流提取的黄顶菊粗品原料通过逆流色谱法分离制备高纯度万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷。选择溶剂的两相组合，选用的两相体系为含水溶剂体系。含水溶剂体系由三个组分构成，A组分是醚类、正构烷烃或脂肪酯。B组分是乙腈、脂肪醇或脂肪酮。C组分为水。

正构烷烃为正己烷、正庚烷、正戊烷。

脂肪酯是乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯或乙酸正丁酯。

脂肪醇或脂肪酮为甲醇、乙醇或丙酮。

醚类是乙醚、石油醚或甲基叔丁基醚。

采用含水溶剂体系，以上相为固定相，下相为流动相，在保证上下相体积比小于1前提下，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节A∶B∶C三组分的体积比：30-10∶1∶30-10，经过一次逆流分离得到万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷。

实验条件适合室温15-30℃，室温对分离效率影响不大。在上述温度范围内，室温较高时，出峰时间略有提前，分离效率变化不大，对万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷峰形无影响。

首先按体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。将黄顶菊粗提物溶解于流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为500-1000rpm，以0.5-3.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，得到固体。

用本方法提取的万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷其纯度可达到95％以上。适用于用各种型号的逆流色谱仪分离制备万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷单体，能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度。

具体实施方式

实施例1：

选取正己烷-乙醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离纯化黄顶菊提取物(乙醇提取的黄顶菊原料)，首先按10∶1∶10体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。称取400mg乙醇提取的黄顶菊原料溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为500rpm，以0.5mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到96％左右。

实施例2：

选取乙酸丁酯-甲醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离黄顶菊提取物。先按30∶1∶30体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。称取100mg乙醇提取的黄顶菊粗品溶解于20mL流动相中待用，进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为1000rpm，以3.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到97％左右。

实施例3：

取乙酸乙酯-甲醇-水组分在分析型逆流色谱仪上来分离黄顶菊提取物。首先按10∶1∶30体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。称取400mg乙醇提取的黄顶菊粗品溶解于10mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到96％以上。

实施例4：

选取乙酸乙酯-乙腈-水在半制备型逆流色谱仪上来分离黄顶菊提取物，首先按30∶1∶10体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。称取370mg乙醇提取的黄顶菊粗品溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到97％左右。

实施例5：

选取乙酸乙酯-乙醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离黄顶菊提取物。首先按15∶1∶15体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。称取360mg乙醇提取的黄顶菊溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，接收目标成分，其HPLC纯度达到96％左右。

实施例6：

选取乙酸异丙酯-乙腈-水在半制备型逆流色谱仪上来分离黄顶菊提取物，首先按20∶1∶20体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。称取365mg乙醇提取的黄顶菊溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，得到黄色固体，其HPLC纯度达到97％左右。

实施例7：

选取石油醚-乙醇-水在半制备型逆流色谱仪上来分离黄顶菊提取物，首先按10∶1∶10体积比将上述溶剂组分配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层。待平衡一段时间后，将上相和下相分开，取下相作为固定相，上相作为流动相。采用半制备型高速逆流色谱仪，配有NS-1007泵，20mL进样阀，聚四氟乙烯柱，柱容积为240mL，8823A-UV紫外检测器，Yokogawa 3057便携式记录仪。称取300mg乙醇提取的黄顶菊溶解于20mL流动相中待用。进样前，先用固定相存满整个柱子，调整主机转速为800rpm，以2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内；待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样；然后根据检测器紫外谱图，得到黄色固体，其HPLC纯度达到97％左右。

Claims (1)

1.一种万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷的分离制备方法，其特征在于：它是采用逆流色谱法从植物黄顶菊乙醇回流提取物中分离制备万寿菊素-3-O-葡萄糖苷和紫云英苷，其溶剂组分由A、B和C三个组分构成：

A组分为乙醚、石油醚、甲基叔丁基醚、正己烷、正庚烷、正戊烷、

乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯或乙酸正丁酯；

B组分为乙腈、甲醇、乙醇或丙酮；

C组分为水；

按体积比依次为：30-10∶1∶30-10。