CN103665065A

CN103665065A - 一种快速制备土大黄苷和丹叶大黄素的方法

Info

Publication number: CN103665065A
Application number: CN201310597696.6A
Authority: CN
Inventors: 王洪伦; 何彦峰; 王小艳; 丁晨旭; 索有瑞
Original assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Plateau Biology of CAS
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: CN103665065B

Abstract

本发明公开了一种快速分离制备土大黄苷和丹叶大黄素的方法。该方法，包括如下步骤：1）将胡芦巴种子粉碎后于乙醇水溶液中回流提取，收集提取液，浓缩，得到胡芦巴提取物；2）将胡芦巴提取物用去离子水溶解后，用石油醚萃取，收集下层清液再用乙酸乙酯萃取，收集下层清液再用正丁醇萃取，收集上层萃取液浓缩得待分离样品；3）用高速逆流色谱法对待分离样品进行分离，依次得到含有土大黄苷、丹叶大黄素的流分；固定相和流动相由体积比为1～3：6～10：2～6：10～14的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水而得；所述上样溶液为将待分离样品溶于所述流动相而得。本发明简单快速，制备量大，产品纯度高，适合于工业化大规模生产。

Description

一种快速制备土大黄苷和丹叶大黄素的方法

技术领域

本发明涉及一种快速制备土大黄苷和丹叶大黄素的方法。

背景技术

土大黄苷和丹叶大黄素均属多羟基芪类化合物，主要是由植物在真菌感染，强紫外线照射等不利条件下产生的一种植物抗毒素。研究发现，土大黄苷和丹叶大黄素等多羟基芪类化合物具抗菌消炎，活血化瘀，调节血糖和抑制肿瘤等多种显著的药理功效。多羟基芪类化合物最早发现于蓼科植物大黄中，大黄也是土大黄苷等药用活性成分的主要来源。近年来，随着对多羟基芪类化合物药理价值的深入研究和开发，对植物资源的需求量也逐渐增加，对大黄资源的过度开发利用现象也日益严重。因此，寻找一种大黄的替代性植物资源迫在眉睫。

胡芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)为豆科胡芦巴属一年生草本植物，是一种集药用、食用、香料和饲料等价值于一身的经济作物。《本草纲目》记载，其成熟干燥的种子（又称胡芦巴）具有治疗“小肠气痛，肾脏虚冷”等疾病；2000年版《中华人民共和国药典》规定，干燥的胡芦巴种子有“温肾，驱寒，止痛”的功效，主治“肾脏虚冷，小腹冷痛，小肠疝气，寒湿脚气”等症。近年来，胡芦巴显著的药理活性，如降血糖、降血脂和保肝护肝等引起了研究者的关注，其中黄酮类，多糖，生物碱是该属植物的药理活性成分，最近，从胡芦巴种子中分离得到了土大黄苷和丹叶大黄素等多羟基芪类化合物，这为减轻大黄资源的过度开发有重要意义。为有效开发利用胡芦巴资源，以及进一步研究芪类化合物的药理活性及机制，研究快速制备胡芦巴中高纯度土大黄苷和丹叶大黄素的方法具有重要的意义。

检索发现，目前，有关多羟基芪类化合物分离的报道大多采用传统柱色谱法和萃取法，如公开号为CN101195646A的中国专利应用乙醇提取，乙酸乙酯反复萃取，制得含量大于55%的二苯乙烯苷类化合物；公告号为CN1060481的中国专利通过萃取法和硅胶柱层析法从中药何首乌乙酸乙酯萃取部位分离得二苯乙烯苷类化合物；公告号为CN101787060B的专利应用大孔树脂柱层析、反渗透浓缩、析晶、重结晶、冷冻干燥等多步骤从何首乌中得二苯乙烯苷。但是，传统树脂柱色谱无法避免制得的样品中树脂残留物的安全性隐患等问题，国家药监局已经对应用于保健食品的利用吸附树脂分离纯化的生产工艺作出了相应的限制和规定；同时，传统硅胶柱色谱存在样品组分死吸附严重，对结构相似，极性相近的化合物分离困难，化合物纯度低等不足；此外，采用传统方法制备多羟基芪类化合物过程繁琐，分离周期长，样品损失严重，分离效率低。因此，有必要探索一些行的方法来制备高纯度的多羟基芪类化合物。

高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是20世纪80年代以来在液-液分配色谱基础上发展起来的新型分离技术，它无需固态载体，克服了传统分离技术对样品组分的不可逆吸附作用，节省了材料和溶媒消耗，样品回收率高，同时还具有操作简便、分离量大、分离周期短、分离效率高以及重现性好等优点，易形成自动化生产，被广泛应用于生物、医药、环保等领域各种物质的制备分离和纯化。

公开号为CN102702283A和CN102786563A的中国专利分别应用高速逆流色谱法，均以氯仿-正丁醇-甲醇-水为两相溶剂系统，分别从大黄中分离出土大黄苷和脱氧土大黄苷等化合物。但是由于氯仿是一种人体致癌物，且是一种严重危害环境的有机溶剂，在原料药的制备过程中一般避免使用。同时这些专利在分离过程中至少要花320min才能对两种化合物进行完全分离。因此，以氯仿-正丁醇-甲醇-水为两相溶剂系统的高速逆流色谱制备方法在医药及保健食品工业中的实际生产应用方面具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速制备土大黄苷和丹叶大黄素的方法。

本发明提供的制备土大黄苷和丹叶大黄素的方法，包括如下步骤：

1）将胡芦巴种子粉碎后于乙醇水溶液中回流提取，收集提取液，浓缩，得到胡芦巴提取物；

2）将步骤1）所得胡芦巴提取物用去离子水溶解后，用石油醚萃取，收集下层清液再用乙酸乙酯萃取，收集下层清液再用正丁醇萃取，收集上层萃取液后浓缩，得到待分离样品；

3）用高速逆流色谱法对步骤2）所得待分离样品进行分离，依次得到流分I和II；其中，所述流分I中含有土大黄苷；所述流分II中含有丹叶大黄素；

所述高速逆流色谱法中的固定相和流动相按照如下方法制备：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水混匀后静置分层，分别收集上层溶剂和下层溶剂，分别进行超声，以上层溶剂为固定相，下层溶剂为流动相；

所述正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为1～3：6～10：2～6：10～14；

所述上样溶液为将步骤2）所得待分离样品溶于所述流动相而得。

上述方法的步骤1）粉碎步骤中，粉碎后胡芦巴种子的目数为40-60目，具体可为50目、40-50目或50-60目；

所述乙醇水溶液的质量百分浓度为40-80%，具体可为60%、40-60%、60-80%；

粉碎后的胡芦巴种子与乙醇水溶液的用量比为1g：10-30mL，具体为1g：20mL、1g：10-20mL、1g：20-30mL；

所述提取步骤中，提取次数为1-5次，具体为3次；

所述浓缩步骤中，浓缩所得胡芦巴提取物中，固形物的质量百分含量为35-62%，具体为55%、55-57%、57%、35-55%、35-57%、57-62%、。

所述步骤2）溶解步骤中，胡芦巴提取物与去离子水的用量比为1g：5-15mL，具体为1g：10mL、1g：5-10mL、1g：10-15mL；

所述萃取步骤中，萃取所用溶剂与待萃取物质的体积比均为1:0.5-1.5，具体为1:1；萃取次数均为2-10次，具体为5、7、2-5、2-7、5-7、5-10或7-10次；

所述浓缩步骤中，温度为50-70℃，具体为60℃、50-60℃或60-70℃；浓缩所得待分离样品中，固形物的质量百分含量为15-30%，具体为27%、27.6%、15-27%或27-30%。

所述步骤3）分离步骤包括：向高速逆流色谱仪的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为25～35℃，以800～900rpm的转速正转10～20分钟后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入所述上样溶液。

所述上样溶液的流速为1.5-2.5mL/min，具体为2.2mL/min、1.5-2.2mL/min、2.2-2.5mL/min；

所述分离步骤中，检测波长为320nm；

所述超声步骤中，超声的时间为10-30分钟。

所述待分离样品与流动相的用量比为40～160mg：10mL，具体为80mg：10mL、120mg：10mL、80-120mg：10mL、80-160mg：10mL、40-80mg：10mL、40-120mg：10mL；

所述泵入上样溶液的次数至少为一次，具体为1-6次，更具体为1-4次；

当泵入上样溶液的次数为一次时，对应的进样方式为单次进样；所述泵入上样溶液的次数为一次时，流分I和流分II出峰时间依次为50-110分钟和80-180分钟；

具体的，流分I的出峰时间可为70-110分钟、50-80分钟、60-90分钟，

流分II的出峰时间可为140-180分钟、90-120分钟、110-150分钟，

当泵入上样溶液的次数至少为两次时，对应的进样方式为连续进样；所述泵入上样溶液的次数至少为两次时，流分I的出峰时间依次为60-90分钟、200-230分钟、320-350分钟和430-460分钟，具体可为60-90分钟、200-230分钟、320-350分钟、430-460分钟；

流分II的出峰时间依次为100-130分钟、240-270分钟、350-380分钟和465-490分钟，具体可为100-130分钟、240-270分钟、350-380分钟、465-490分钟；

所述泵入上样溶液的次数为4次，第一次至第四次泵入上样溶液的时间依次为体系平衡后第0分钟、第145分钟、第250分钟和第340分钟。

以下是土大黄苷和丹叶大黄素化合物的化学结构式：

本发明与已有技术相比具有以下优点：

1与传统柱色谱分离技术相比，本发明采用高速逆流色谱（HSCCC）分离技术，不但有效地缩短了分离时间，而且减少了工艺过程中的有机溶剂消耗和能耗。

2现有报道的分离二苯乙烯苷类化合物的高速逆流溶剂系统有氯仿-正丁醇-甲醇-水。但是此系统的高毒性对人体会带来严重的危害，此外，增加高速逆流色谱仪的转速和温度时，此系统会引起严重的乳化而影响目标化合物的分离。相比较，本发明采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水作为两相溶剂系统，避免了以上两种不利因素的同时，有效缩短了目标化合物的分离时间，改善了目标化合物的分离度。

3本发明实现了连续进样和循环制备的高速逆流色谱分离方法，此方法可以节约泵入固定相所需的时间和平衡时间，进一步缩短了目标化合物的分离时间；同时节约了溶剂，提高了制备效率，适合工业规模化生产。

4本发明通过一次分离可以同时得到土大黄苷和丹叶大黄素两种单体化合物，性质稳定，纯度高（可达到98%以上），土大黄苷的得率可达46%-68%，丹叶大黄素的得率可达54%-75%。

可应用于医药、保健食品、保健药物和标准物质等。

5本发明制备所得两种产品分别经UV、¹H-NMR和¹³C-NMR进行分析鉴定，结构确认，两种产品的结构明确。

附图说明

图1为待分离样品的高效液相色谱图。

图2为本发明分离制备的土大黄苷的高效液相色谱图和全波长扫描图（纯度99.1%，最大吸收320nm）。

图3为本发明分离制备的丹叶大黄素的高效液相色谱图和全波长扫描图（纯度99.4%，最大吸收320nm）。

图4为本发明应用高速逆流色谱设备从胡芦巴中分离制备土大黄苷和丹叶大黄素的一个生产周期（单次进样）的分离制备图谱（峰I为土大黄苷，峰II为丹叶大黄素，分离时间为200分钟）。

图5为本发明应用高速逆流色谱设备从胡芦巴中分离制备土大黄苷和丹叶大黄素的连续4次进样的分离制备图谱（峰I为土大黄苷，峰II为丹叶大黄素，分离时间为600分钟，虚线箭头为各进样时间点）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。

下述实施例中均采用HPLC法对各流分进行纯度检测（峰面积归一法），其色谱条件为：Eclipse XDB C18柱(250mm×4.6mm，i.d.5μm)；

流动相：甲醇-水溶液；

梯度洗脱程序具体如下：

0分钟起至20分钟止，流动相为甲醇的质量百分含量为35-60%的甲醇水溶液；

21分钟起至30分钟止，流动相为甲醇的质量百分含量为60-90%的甲醇水溶液；

流速：1.0mL/min；

检测波长为320nm。

实施例1

一种利用高速逆流色谱法快速分离制备胡芦巴中土大黄苷和丹叶大黄素的方法，包括以下步骤：

（1）将粉碎至40目的胡芦巴种子按料液比为1g：10ml加入质量百分浓度为40%的乙醇水溶液进行加热回流提取3次，合并提取液，60℃浓缩至干，得固形物质量百分含量为35%的胡芦巴提取物。

（2）将胡芦巴提取物用去离子水以1g：5mL溶解后，用等体积的石油醚萃取2次，合并下层清液再用等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并下层清液再用等体积的正丁醇萃取2次，合并上层萃取液后浓缩，在50℃条件下减压浓缩，得固形物质量百分含量为15%的待分离样品；待分离样品的高效液相色谱图见图1。

（3）将含有正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的两相溶剂系统混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声20分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为25℃，以800rpm的转速正转10分钟后泵入流动相，待体系平衡后，泵入上样溶液（单次进样），并以1.5mL/min的流速进行高速逆流色谱分离，检测波长为320nm，依次接收流出液I和流出液II，将流出液I和II干燥至恒重，得到高纯度的土大黄苷和丹叶大黄素单体，土大黄苷的高效液相色谱图和全波长扫描图如图2所示，丹叶大黄素的高效液相色谱图和全波长扫描图如图3所示，纯度经高效液相色谱检验均达到98%以上，产率分别为46%、54%。

其中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为1:6:2:10；

上样溶液为将步骤（3）所得待分离样品溶于流动相而得。待分离样品与流动相的用量比为40mg：10mL；

流出液I和流出液II的出峰时间依次为70-110分钟，140-180分钟。

该实施例所得产物的结构确认结果如下所示：

土大黄苷（I），无色针状晶体，217,320，¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ:9.45(1H,s,5-OH),8.99(1H,s,3′-OH),7.03(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),7.00(1H,d,J=16.3Hz,H-α),6.97(1H,dd,J=2.0,8.3Hz，H-6′),6.90(1H,d,J=8.4Hz,H-5′),6.84(1H,d,J=16.3Hz,H-β),6.74(1H,br.s,H-2),6.58(1H,br.s,H-6),6.35(1H,br.s,H-4),4.81(1H,d,J=7.6Hz,H-1′′),3.78(3H,s,-OCH₃),3.75-3.15(6H,m,sugar-H).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:158.87(C-5),158.35(C-3),147.73(C-4′),146.57(C-3′),139.17(C-1),129.99(C-1′),128.56(C-β),126.09(c-α),118.59(C-6′),112.98(C-2′),112.10(C-5′),107.25(C-2),104.88(C-6),102.89(C-4),100.67(C-1′′),77.12(C-5′′),76.71(C-3′′),73.30(C-2′′),69.76(C-4′′),60.72(C-6′′),55.63(-OCH₃).

丹叶大黄素(II),无色针状晶体，

217,320.¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:9.22(2H,s,3,5-OH),8.99(1H,s,3′-OH),7.02(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.95(1H,dd,J=2.0,8.3Hz,H-6′),6.90(1H,d,J=16.4Hz,H-α),6.89(1H,d,J=8.4Hz,H-5′),6.80(1H,d,J=16.4Hz,H-β),6.40(2H,d,J=2.04Hz,H-2,6),6.14(1H,br.s,H-4),3.77(3H,s,OCH₃).¹³C NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ:158.52(C-3,5),147.64(C-4′),146.58(C-3′),139.11(C-1),120.09(C-1′),127.92(C-β),126.51(C-α),118.47(C-2′),112.94(C-6′),112.14(C-5′),104.43(C-2,6),101.93(C-4),55.63(-OCH₃).

由上可知，所得产物结构正确，为目标产物。

实施例2

（1）将粉碎至60目的胡芦巴种子按料液比为1g：30ml加入质量百分浓度为80%的乙醇水溶液进行加热回流提取3次，合并提取液，60℃浓缩至干，得固形物的质量百分含量为62%的胡芦巴提取物。

（2）将胡芦巴提取物用去离子水以1g：15mL溶解后，用等体积的石油醚萃取10次，合并下层清液用等体积的乙酸乙酯萃取10次，合并下层清液再用等体积的正丁醇萃取10次，合并上层萃取液后，在70℃条件下减压浓缩，得固形物的质量百分含量为30%的待分离样品；

（3）将含有正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的两相溶剂系统混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声10分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为35℃，以900rpm的转速正转20分钟后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入上样溶液（单次进样），并以2.5mL/min的流速进行高速逆流色谱分离，检测波长为320nm，依次接收流出液I和流出液II，将流出液I和II干燥至恒重，得到高纯度的土大黄苷和丹叶大黄素单体，其纯度经高效液相色谱检验均达到97.2%以上，产率分别为52%、59%。

其中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为3:10:6:14.

上样溶液为将步骤（3）所得待分离样品溶于流动相而得。待分离样品与流动相的用量比为160mg：10mL；

流出液I和流出液II的出峰时间依次为50-80分钟，90-120分钟。

实施例3

（1）将粉碎至50目的胡芦巴种子按料液比为1:20g/ml加入质量百分浓度为60%的乙醇水溶液进行加热回流提取3次，合并提取液，60℃浓缩至干，得固形物的质量百分含量为57%的胡芦巴提取物。

（2）将胡芦巴提取物用去离子水以1g：10mL溶解后，用等体积的石油醚萃取5次，合并下层清液再用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并下层清液再用等体积的正丁醇萃取5次，合并上层萃取液后，在60℃条件下减压浓缩，得固形物的质量百分含量为27%的待分离样品；

（3）将含有正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的两相溶剂系统混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声30分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为30℃，以850rpm的转速正转15分钟后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入上样溶液（单次进样），并以2.2mL/min的流速进行高速逆流色谱分离，检测波长为320nm，依次接收流出液I和流出液II，将流出液I和II干燥至恒重，得到高纯度的土大黄苷和丹叶大黄素单体，其纯度经高效液相色谱检验均达到99%以上，产率分别为60%、65%。

其中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为2:8:4:12.

上样溶液为将步骤（3）所得待分离样品溶于所述流动相而得。待分离样品与流动相的用量比为80mg：10mL；

流出液I和流出液II的出峰时间依次为60-90分钟，110-150分钟，单次进样高速逆流色谱图见图4。

实施例4

（1）将粉碎至50目的胡芦巴种子按料液比为1g：20ml加入质量百分浓度为80%的乙醇水溶液进行加热回流提取3次，合并提取液，60℃浓缩至干，得固形物的质量百分含量为55%胡芦巴提取物。

（2）将胡芦巴提取物用去离子水以1g：10mL溶解后，用等体积的石油醚萃取7次，合并下层清液再用等体积的乙酸乙酯萃取7次，合并下层清液再用等体积的正丁醇萃取7次，合并上层萃取液后，在60℃条件下减压浓缩，得固形物的质量百分含量为27.6%的待分离样品；

（3）将含有正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的两相溶剂系统混匀后静置分层，分别收集上相溶剂和下相溶剂，分别超声30分钟，以上相为固定相，下相为流动相，向高速逆流色谱仪的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为30℃，以850rpm的转速正转15分钟后泵入所述流动相，待体系平衡后，分别在0分钟，145分钟，250分钟和340分钟相应的时间点依次泵入上样溶液，并以2.2mL/min的流速进行高速逆流色谱分离，检测波长为320nm，实现连续进样，循环分离，依次接收流出液I和流出液II，4次连续进样高速逆流色谱图见图5。合并各流出液I，干燥至恒重；合并各流出液II干燥至恒重，得到高纯度的土大黄苷和丹叶大黄素单体，其纯度经高效液相色谱检验均达到99.0%以上，产率分别为68%、75%。

其中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为2:8:4:12。

上样溶液为将步骤（3）所得待分离样品溶于流动相而得。所述待分离样品与流动相的用量比为120mg：10mL；

流出液I的出峰时间依次为60-90分钟，200-230分钟，320-350分钟，430-460分钟。

流出液II的出峰时间依次为100-130分钟，240-270分钟，350-380分钟，465-490分钟。

Claims

1.一种制备土大黄苷和丹叶大黄素的方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）粉碎步骤中，粉碎后胡芦巴种子的目数为40-60目；

所述乙醇水溶液的质量百分浓度为40-80%；

粉碎后的胡芦巴种子与乙醇水溶液的用量比为1g：10-30mL；

所述提取步骤中，提取次数为1-5次，具体为3次；

所述浓缩步骤中，浓缩所得胡芦巴提取物中，固形物的质量百分含量为35-62%。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2）溶解步骤中，胡芦巴提取物与去离子水的用量比为1g：5-15mL；

所述萃取步骤中，萃取所用溶剂与待萃取物质的体积比均为1:0.5-1.5，具体为1:1；萃取次数均为2-10次；

所述浓缩步骤中，温度为50-70℃；浓缩所得待分离样品中，固形物的质量百分含量为15-30%。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3）分离步骤包括：向高速逆流色谱仪的分离管中泵入所述固定相，保持分离管温度为25～35℃，以800～900rpm的转速正转10～20分钟后泵入所述流动相，待体系平衡后，泵入所述上样溶液。

5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述上样溶液的流速为1.5-2.5mL/min；

所述待分离样品与流动相的用量比为40～160mg：10mL；

所述分离步骤中，检测波长为320nm；

所述超声步骤中，超声的时间为10-30分钟。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述泵入上样溶液的次数为一次时，流分I和流分II出峰时间依次为50-110分钟和80-180分钟。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述泵入上样溶液的次数至少为两次时，流分I的出峰时间依次为60-90分钟、200-230分钟、320-350分钟和430-460分钟；

流分II的出峰时间依次为100-130分钟、240-270分钟、350-380分钟和465-490分钟。

8.根据权利要求5或7所述的方法，其特征在于：所述泵入上样溶液的次数为4次，第一次至第四次泵入上样溶液的时间依次为体系平衡后第0分钟、第145分钟、第250分钟和第340分钟。